專利名稱:卵巢癌抗獨特型抗體6b11 t細胞表位肽及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域:
本發(fā)明涉及二條卵巢癌抗獨特型抗體6B11的T細胞表位肽及其在增強抗卵巢癌細胞免疫反應中的應用。
背景技術(shù):
卵巢癌是嚴重威脅婦女健康的疾病,在婦科惡性腫瘤中發(fā)病率為第二位、死亡率卻高居首位,是婦科惡性腫瘤的主要死因。其發(fā)病隱匿、進展迅速,70%~80%的卵巢癌患者發(fā)現(xiàn)時已為晚期,5年生存率僅為30%左右,傳統(tǒng)手術(shù)、化療效果尚不滿意;即使暫時控制病情,70%以上的卵巢癌最終仍會進展或復發(fā),進一步治療更加困難。因此,目前迫切需要更有效的治療方法來提高卵巢癌患者的生存率,改善生活質(zhì)量。
腫瘤的生物治療是繼傳統(tǒng)手術(shù)、放療和化療之后的第四大腫瘤治療模式,腫瘤疫苗作為腫瘤生物治療的一種,因其能動援機體免疫系統(tǒng)發(fā)揮積極的抗腫瘤作用,可以具有特異性、靶向性等特點,成為傳統(tǒng)治療手段的有益補充,已經(jīng)用于多種惡性腫瘤的臨床治療。
隨著生物技術(shù)的不斷進步和對于機體免疫反應認識的進一步深入,腫瘤疫苗也經(jīng)歷了極大的發(fā)展,主要包括細胞疫苗、抗原疫苗、抗獨特型疫苗、肽疫苗或表位疫苗。腫瘤的細胞疫苗來源于自體或異體腫瘤細胞或其粗提取物,由于其含有個體的全部腫瘤抗原,能誘導出一定的抗腫瘤免疫反應,但是,其存在免疫原性弱、有致瘤性等缺點;抗原疫苗為提取自腫瘤細胞的特異性或相關(guān)性抗原,與細胞疫苗相比成份進一步明晰,降低了致瘤性和自身免疫反應;抗獨特型疫苗是模擬腫瘤抗原關(guān)鍵表位的內(nèi)影像,與原始的腫瘤抗原不同,應用以后能打破腫瘤機體固有的免疫耐受狀態(tài),激發(fā)機體自身的特異性免疫反應,與抗原疫苗相比制備更為簡單,副作用輕微;肽疫苗為能發(fā)揮關(guān)鍵抗腫瘤作用的肽?,F(xiàn)已明確,任何腫瘤抗原都必須先由抗原遞呈細胞降解為短肽,再由其中關(guān)鍵性的表位肽與主要組織相容性復合物(MHC)分子結(jié)合,激發(fā)免疫細胞發(fā)揮抗腫瘤作用??梢?,腫瘤疫苗的發(fā)展歷程體現(xiàn)了一個由淺入深、由粗到細的科學探索過程,而表位肽代表著未來腫瘤疫苗發(fā)展的新方向。
表位是抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學基團,又稱抗原決定簇,它是T、B細胞受體及抗體特異性結(jié)合的基本單位。在免疫應答中,T細胞和B細胞所識別的抗原表位不同,分別稱為T細胞表位和B細胞表位。MHC分子是高度多態(tài)性的細胞表面分子,由它們將表位肽遞呈給免疫細胞,誘導相應的免疫細胞群增殖,發(fā)揮特異性抗腫瘤作用。經(jīng)典理論認為,與MHC I類分子結(jié)合的主要是內(nèi)源性抗原肽,一般為8-12個氨基酸,此MHC-肽復合物轉(zhuǎn)運至細胞表面被CD8T細胞的受體識別;與MHC II類分子結(jié)合的主要是外源性抗原肽,長度變化較大,一般為9-25個氨基酸,此MHC-肽復合物轉(zhuǎn)運至細胞表面被CD4T細胞的受體識別。CD4T細胞,又稱為Th細胞,據(jù)分泌細胞因子的不同可以劃分為兩群,即Th1和Th2。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β,Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-13。CD8T細胞,也即經(jīng)典的CTL細胞。根據(jù)機體對病原體或腫瘤的免疫應答特點,可以選擇特異性Th和(或)CTL表位以定向誘導宿主的Th和(或)CTL應答,甚至通過選擇Th1表位或Th2表位,誘導機體向Th1或Th2型免疫應答定向發(fā)展,從而實現(xiàn)免疫應答的有效誘導和精確調(diào)控。最近的研究結(jié)果表明,這兩個通路并非完全獨立,外源性抗原經(jīng)機體處理后獲得的肽也可以進入MHC I類分子通路,被CD8T細胞的受體識別。這對于應用外源性抗原發(fā)揮抗腫瘤作用的實踐來說,是一種強有力的理論支持,因為CD4T細胞多數(shù)只能發(fā)揮非特性地抗腫瘤作用,對腫瘤的殺傷作用是間接的,而特異性CD8T細胞才能更有效、更直接地對腫瘤細胞發(fā)揮殺傷作用,如果外來抗原能夠進入MHC I類分子通路,就有可能誘導出特異性的CD8T細胞,從而發(fā)揮有效的抗腫瘤作用;同時也表明Th和CTL細胞誘導通路間存在密不可分的聯(lián)系,正如從功能上而言,在Th表位存在的情況下,CTL表位誘導免疫反應才成為可能或更為有效。現(xiàn)已明確,樹突狀細胞(DCs)、熱休克蛋白分子對于實現(xiàn)這種交叉遞呈效應起重要作用。因此,鑒定有效的抗腫瘤表位肽,可望提供更為精確和有效的調(diào)控抗腫瘤免疫反應的手段。
目前,鑒定表位肽的方法主要有酶解法;洗脫法;合成重疊肽法;用噬菌體顯示肽庫技術(shù)篩選模擬表位;用計算機軟件預測候選表位肽,再用實驗方法驗證。雖然表位肽鑒定的方法學上不斷進步,這些方法操作起來還是很費時,而且由于腫瘤的調(diào)變性和腫瘤機體的免疫耐受特性,篩選得到的肽往往不是十分有效。
國外已經(jīng)制備了結(jié)腸癌、黑色素瘤、淋巴瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、前列腺癌等惡性腫瘤的表位肽,部分進入了臨床研究階段,取得了初步的療效。國內(nèi)外關(guān)于卵巢癌表位肽的制備和應用均鮮見報道。
本發(fā)明為用卵巢上皮癌可溶性抗原OC166-9免疫BALB/c小鼠制備抗卵巢癌單克隆抗體COC166-9,再用COC166-9免疫BALB/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù)制備出一株可以模擬卵巢癌抗原OC166-9的Ab2β型抗獨特型抗體6B11(具體參見本申請人在先的專利申請CN1356341,該申請已授權(quán))。由此抗獨特型抗體鑒定獲得了兩條模擬卵巢癌抗原的T細胞表位肽,這些肽與原始腫瘤抗原不同,有助于打破腫瘤機體的免疫耐受狀況,從而可以用于調(diào)節(jié)抗卵巢癌細胞免疫反應和進行臨床療效的監(jiān)測。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的為進一步鑒定卵巢癌抗獨特型抗體6B11誘導特異性抗卵巢癌細胞免疫反應的有效成份,獲得兩條T細胞表位肽,分別為抗獨特型抗體的重鏈和輕鏈CDR3區(qū)肽,序列為IALITTKIAWYFDV和SQSTHFPYT。
該兩條T細胞表位肽可以誘導產(chǎn)生比其來源的抗獨特型抗體更強的抗卵巢癌細胞免疫反應,因此,可用于構(gòu)建卵巢癌疫苗,用于卵巢癌的輔助治療,還可以監(jiān)測卵巢癌疫苗的治療反應和臨床療效。
本發(fā)明還提供了制備上述抗獨特型抗體T細胞表位肽的方法。
本發(fā)明的優(yōu)點如下1、本發(fā)明的抗獨特型抗體T細胞表位肽為其來源的抗獨特型抗體誘導細胞免疫反應的有效成份,既保留了該抗體誘導特異性抗卵巢癌細胞免疫反應的特性,又避免了抗體中抑制性表位在免疫反應誘導中的負面效應;2、本發(fā)明的抗獨特型抗體T細胞表位肽包括Th和CTL表位,可以同時誘導CD4和CD8T細胞反應,初次和再次免疫應答都很健全,所誘導的抗卵巢癌免疫反應有效;3、本發(fā)明的抗獨特型抗體T細胞表位肽中,Th和CTL表位肽為針對同一腫瘤抗原的相關(guān)T細胞表位,與牛血清白蛋白、匙孔血藍蛋白和破傷風類毒素等來源的Th表位肽與CTL表位肽的無關(guān)組合相比,抗卵巢癌效果更為特異和有效。
4、本發(fā)明的抗獨特型抗體T細胞表位肽來源于抗獨特型抗體6B11,為一種模擬肽,與真實的腫瘤抗原不同,可以打破腫瘤機體固有的免疫耐受狀態(tài)而發(fā)揮抗腫瘤作用。
一方面,本發(fā)明的兩條抗獨特型抗體T細胞表位肽,能特異性殺傷OC166-9陽性的卵巢癌細胞,可以作為卵巢癌疫苗用于卵巢癌的治療,并且可以聯(lián)合其他針對卵巢癌的T細胞表位肽,作為卵巢癌疫苗用于多種類型卵巢癌的治療;另一方面,本發(fā)明的兩條抗獨特型抗體T細胞表位肽,可以與熱休克蛋白分子構(gòu)建融合蛋白,發(fā)揮熱休克蛋白的分子伴侶作用、免疫佐劑作用和抗原交叉遞呈作用,作為卵巢癌疫苗用于卵巢癌的治療;這兩條抗獨特型抗體T細胞表位肽,還可以分別與熱休克蛋白分子的結(jié)合序列共同合成,再于合適的離子條件下與熱休克蛋白分子進行可逆性的結(jié)合,以體內(nèi)抗原肽分子刺激免疫細胞的方式,作為卵巢癌疫苗用于卵巢癌的治療,制備得到的疫苗經(jīng)樹突狀細胞負載后,刺激自體淋巴細胞,同時設(shè)單純T細胞表位肽刺激組、非樹突狀細胞負載組(如經(jīng)射線照射的自體外周血單個核細胞)等,以研究熱休克蛋白分子和DCs在抗原交叉遞呈作用中的分工和協(xié)作情況,通過與不同的熱休克蛋白分子(人或鼠HSP70和gp96)聯(lián)合應用制備抗卵巢癌疫苗,觀察同種屬和異種屬、HSP70和gp96作用效果的差異,從而為選擇熱休克蛋白分子作為疫苗佐劑提供理論依據(jù)、為研究熱休克蛋白分子的功能差異提供參考;另一方面,本發(fā)明的兩條抗獨特型抗體T細胞表位肽,作為ELISPOT實驗的刺激分子,可以用于檢測抗獨特型抗體或抗獨特型抗體T細胞表位肽應用后,產(chǎn)生特異性細胞的數(shù)量,從而監(jiān)測其治療反應,并對其治療的有效性進行評價;最后,本發(fā)明的兩條抗獨特型抗體T細胞表位肽,可以利用Th表位肽和CTL表位肽分別做成Tetramer I和II檢測試劑盒。用于精確定量抗獨特型抗體6B11或抗獨特型抗體T細胞表位肽應用后,產(chǎn)生特異性CLT細胞的數(shù)量,從而監(jiān)測其誘導免疫反應的有效性。
圖1 成熟樹突狀細胞表面分子的表達情況;圖2 BrdU細胞增殖分析;圖3 摸索MHC II類分子抗體的最適應用濃度;圖4 應用MHC II類分子阻斷抗體后進行BrdU細胞增殖分析;圖5 CD4 T細胞分選后進行BrdU細胞增殖分析;圖6 流式細胞術(shù)測定CD4 T細胞細胞內(nèi)細胞因子;圖7 Confocal顯微鏡檢測T2細胞表面MHC-I分子的表達情況;
圖851Cr釋放實驗檢測肽特異性CTLs的細胞毒效應;圖9 摸索MHC I類分子抗體的最適應用濃度;圖10 MHC-I類分子抗體阻斷后進行VH CDR3(重鏈互補決定區(qū)3)和VL CDR3(輕鏈互補決定區(qū)3)肽特異性CTLs的51Cr釋放實驗;圖1151Cr釋放實驗檢測VH CDR3和VL CDR3肽特異性CTLs對K562細胞的殺傷作用;圖1251Cr釋放實驗檢測VH CDR3和VL CDR3肽特異性CTLs殺傷卵巢癌細胞的有效性;圖13 抗獨特型抗體6B11以及VH CDR3和VL CDR3肽誘導的CTLs細胞因子表達譜的情況;圖14 抗獨特型抗體6B11-CTLs以及VH CDR3和VL CDR3區(qū)肽特異性CTLs中抗原特異性IFN-γ產(chǎn)生細胞的情況。
具體實施例方式實施例1 卵巢癌抗獨特型抗體6B11的制備具體的制備過程參見本申請人的在先申請CN1356341,其技術(shù)路線包括以下兩個主要步驟1.以卵巢上皮癌可溶性抗原OC166-9免疫BALB/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù)制備抗卵巢癌單克隆抗體COC166-9。
2.以COC166-9免疫BALB/c小鼠,通過雜交瘤技術(shù)制備模擬卵巢癌抗原OC166-9的抗獨特型抗體。
實施例2 上述抗獨特型抗體6B11的T細胞表位肽的鑒定及誘導免疫反應特性的檢測技術(shù)路線如下一、外周血單核細胞來源DCs的制備以及抗獨特型抗體6B11和肽的負載(一)外周血單核細胞的分離抽取HLA-A2健康人外周血,經(jīng)EDTA抗凝后,用Ficoll淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞。在6孔培養(yǎng)板中,每孔內(nèi)1×107個單個核細胞,定容于1ml含5%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)液中,于37℃、5%CO2條件下孵育2小時。吸取并吹洗去未貼壁的細胞作為淋巴細胞于液氮中凍存?zhèn)溆?,貼壁的細胞即為單核細胞。
(二)DCs(樹突狀細胞)的誘導培養(yǎng)及成熟表型分析將上述6孔培養(yǎng)板中分離獲得的單核細胞每孔加入2ml含5%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)液,同時加入終濃度均為1000U/ml的重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(rh GM-CSF)和重組人白細胞介素-4(rhIL-4)進行誘導培養(yǎng)。第4天,補加1ml含5%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)液,同時補加同樣濃度的rh GM-CSF和rhIL-4。第6天,再次補加1ml含5%人AB血清的AIM-V培養(yǎng)液,同時加入終濃度均為1000U/ml的重組人腫瘤壞死因子-α(rh TNF-α)、重組人α-干擾素(rh IFN-α)、重組人白細胞介素-6(rh IL-6)和終濃度為1μg/ml的前列素E2(PGE2),共同孵育24小時,誘導DCs成熟。
收獲DCs,經(jīng)過洗滌后,調(diào)濃度為每10ml離心管中1×106個細胞,分別加入FITC和PE標記的熒光抗體每管5μl,4℃避光標記30分鐘,洗滌兩次。利用流式細胞分析術(shù)對上述經(jīng)過成熟誘導的DCs表面CD80,CD86,CD83,CD1a和HLA-DR分子的表達情況進行分析(如圖1)。
(三)DCs負載抗獨特型抗體6B11以及抗獨特型抗體6B11 CDRs(互補決定區(qū))區(qū)肽(1)DCs負載抗獨特型抗體6B11于DCs培養(yǎng)第4天,在補加培養(yǎng)液、rh GM-CSF和rh IL-4同時,加入終濃度為40μg/ml的抗獨特型抗體6B11進行負載,作為刺激細胞備用。
(2)DCs負載抗獨特型抗體6B11 CDRs肽收獲經(jīng)誘導成熟后的DCs,洗滌后調(diào)整濃度為1×106個/ml,分別加入終濃度為30μg/ml的各條肽或30μg/ml的各條肽和5μg/ml的匙孔血藍蛋白(KLH)進行負載,作為刺激細胞備用。
二、抗獨特型抗體6B11以及抗獨特型抗體6B11 CDRs肽特異性CTLs的誘導(一)抗獨特型抗體6B11特異性CTLs的誘導用負載抗獨特型抗體6B11的DCs(anti-Id DCs)刺激上述凍存的自體淋巴細胞,獲得抗獨特型抗體6B11特異性CTLs(6B11-CTLs),每7天作為1個周期,于周期第3日補加10U/ml的重組人白細胞介素-2(rh IL-2),最終獲得經(jīng)過1個周期或3個周期刺激的抗獨特型抗體6B11-CTLs。
(二)抗獨特型抗體6B11 CDRs肽特異性CTLs的誘導用負載肽和KLH的DCs刺激上述凍存的自體淋巴細胞,獲得肽特異性CTLs(肽-CTLs),每7天作為1個周期,于周期第3日補加10U/ml的rh IL-2,最終獲得經(jīng)過3個周期刺激的肽-CTLs。
收獲經(jīng)過1個周期刺激的6B11-CTLs,作為反應細胞用于細胞增殖分析實驗、ELISA細胞因子測定實驗和IFN-γELISPOT實驗;收獲經(jīng)過3個周期刺激的6B11-CTLs和肽-CTLs,作為效應細胞用于51Cr釋放實驗。
三、抗獨特型抗體6B11 Th表位肽的鑒定以及其誘導免疫反應型別的分析(一)BrdU ELISA細胞增殖分析方法鑒定抗獨特型抗體6B11的Th表位肽人工合成抗獨特型抗體6B11的全部CDRs區(qū)肽(6條),并利用細胞增殖分析方法進行Th表位肽的篩選。以經(jīng)過1個周期刺激的抗獨特型抗體6B11-CTLs為反應細胞、以分別負載抗獨特型抗體和肽的DCs為刺激細胞,按10∶1比例于37℃、5%CO2條件下共同孵育120小時,進行BrdU ELISA細胞增殖分析。每孔為100μl AIM-V培養(yǎng)液,含1×105個抗獨特型抗體6B11-CTLs。在刺激的最后2小時,每孔加入10μl BrdU標記液,去除板孔中液體,于60℃條件下干燥細胞1小時。每孔再加入200μl FixDenat液,于37℃條件下作用30分鐘,用于固定淋巴細胞中的DNA。最后每孔加入100μl BrdU單克隆抗體作用90分鐘,經(jīng)底物法顯色后,用自動酶標儀讀取450nm處的吸光度值,檢測細胞的增殖情況。以未負載DCs組和植物血凝素(PHA)組分別作為實驗的陰性和陽性對照。結(jié)果,反應細胞6B11-CTLs在受到陽性對照PHA刺激時,發(fā)生了明顯的增殖反應,表明實驗所用的反應細胞具有健全的增殖能力,在遇到T細胞受體特異性的肽后能進行正常的增殖;6B11-DCs因具有完整抗獨特型抗體的全部肽片段,可以刺激反應細胞發(fā)生增殖反應;在6條CDRs肽中,只有重鏈(VH)CDR3肽和輕鏈(VL)CDR3肽可以分別刺激反應細胞發(fā)生增殖反應,而且前者的作用更強一些;其他各條肽不能刺激反應細胞發(fā)生增殖反應;表明VH CDR3和VL CDR3肽為抗獨特型抗體發(fā)揮效應機制的關(guān)鍵部分(如圖2)。
為了進一步分析上述細胞增殖反應的組成情況,應用抗人MHC-II類分子抗體對刺激細胞進行阻斷,以判斷Th表位肽的作用情況。首先,摸索最適的MHC-II類分子抗體的使用濃度,最終選擇1∶20的稀釋度(如圖3)。MHC-II類分子阻斷后的細胞增殖分析結(jié)果顯示,PHA和6B11-DCs引發(fā)的增殖反應在很大程度上被MHC-II類分子抗體阻斷;VH CDR3肽引發(fā)的增殖反應可以大部分被MHC-II類分子抗體阻斷,而VL CDR3肽引發(fā)的增殖反應不能被MHC-II類分子抗體阻斷;其他各條肽不能引發(fā)增殖反應,而且與MHC-II類分子抗體應用與否無關(guān)(如圖4)。以上結(jié)果表明,與PHA一樣,VH CDR3肽主要引發(fā)CD4T細胞發(fā)生增殖反應,而VL CDR3肽引發(fā)的增殖反應與CD4 T細胞無關(guān)。對反應細胞進行CD4 T細胞磁珠分選后的細胞增殖分析顯示,除了PHA和6B11-DCs外,只有VH CDR3肽可以引發(fā)CD4 T細胞發(fā)生增殖反應,VL CDR3肽不能引發(fā)CD4 T細胞發(fā)生增殖反應,與前述結(jié)果一致(如圖5)。表明,VH CDR3肽(IALITTKIAWYFDV)確實可以誘導6B11-CTLs中CD4 T細胞的增殖反應,為抗獨特型抗體6B11的一個Th表位肽。
(二)流式細胞內(nèi)細胞因子測定方法檢測Th表位肽誘導免疫反應的型別將抗獨特型抗體6B11-CTLs分別與負載VH CDR3肽的DCs以及未負載DCs共同孵育,用流式細胞術(shù)檢測抗獨特型抗體6B11-CTLs來源的CD4 T中細胞內(nèi)細胞因子的產(chǎn)生情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),VH CDR3肽可以刺激CD4T細胞分泌高水平的IFN-γ,僅產(chǎn)生低水平的IL-4(如圖6)。以上結(jié)果表明,VH CDR3肽(IALITTKIAWYFDV)作為抗獨特型抗體的Th表位肽,主要誘導Th1型免疫反應。
四、抗獨特型抗體6B11 CTL表位肽的鑒定(一)利用SYFPEITHI法則預測抗獨特型抗體6B11 CDRs 區(qū)HLA-A2結(jié)合肽將抗獨特型抗體6B11 CDRs區(qū)肽的序列分別輸入預測網(wǎng)站,分析序列中可能的HLA-A2結(jié)合肽,并給出預測分值。網(wǎng)址為SYFPEITHI(http//www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)。篩選分值≥7的結(jié)合肽,共有13條VH CDR2區(qū)4條、VH CDR3區(qū)4條、VL CDR1區(qū)4條和VL CDR3區(qū)1條。由于應用該法則只能預測出9mer或10mer的HLA-A2結(jié)合肽,為了盡可能地不遺漏序列,我們?nèi)斯ず铣闪松鲜?3條分值≥7的9mer肽以及VH CDR1和VL CDR2區(qū)的2條8mer肽,用于進一步實驗(如表1)。
(二)T2細胞結(jié)合力分析實驗篩選抗獨特型抗體6B11 CDRs區(qū)HLA-A2結(jié)合肽將經(jīng)SYFPEITHI法則篩選出來的肽以及VH CDR1和VL CDR2區(qū)肽分別進行T2結(jié)合力分析。T2細胞分別與不同濃度(0.3μg/ml、3μg/ml和30μg/ml)的各條肽共同孵育24小時,再與抗人MHC-I類分子抗體共同孵育后,利用共聚焦顯微鏡分析T2細胞表面HLA-I類分子的表達情況。結(jié)果,VH CDR2區(qū)肽(NNKYYNTAL)為高度結(jié)合力肽,VL CDR3區(qū)肽(SQSTHFPYT)為中度結(jié)合力肽,VH CDR3區(qū)肽(LITTKIAW與IALITTKIA)和VL CDR1區(qū)肽(VHSNGNTYL)為低度結(jié)合力肽(如表1,圖7)。NNKYYNTAL、LITTKIAW、IALITTKIA和VHSNGNTYL為新篩選肽,與抗獨特型抗體CDRs區(qū)肽一起合成,用于CTL表位肽的篩選。
表1 抗獨特型抗體6B11 CDRs區(qū)HLA-A2結(jié)合肽的篩選
(三)51Cr釋放實驗鑒定抗獨特型抗體6B11的CTL表位肽以經(jīng)過3個周期刺激的6B11-CTLs和肽-CTLs為效應細胞,以負載相應肽的T2細胞、HOC1A細胞和HLE細胞為靶細胞,進行標準的4小時51Cr釋放實驗。將1×106個靶細胞放在0.5ml含5%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中,加入100μCi Na251CrO4,于37℃標記過夜,最后用冷的含5%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液洗滌細胞3次以終止標記反應。將5×103靶細胞放在100μl培養(yǎng)液中與等體積的效應細胞混合于96孔板板孔中,效靶比設(shè)為40∶1、20∶1、10∶1和5∶1。自發(fā)釋放孔內(nèi)為靶細胞和培養(yǎng)液,最大釋放孔內(nèi)則為靶細胞和含1%Triton X-100的相應培養(yǎng)液。用平板離心機輕甩孔板2分鐘,于37℃、5%CO2條件下共同孵育4小時。再次輕甩孔板,每孔吸取100μl的上清轉(zhuǎn)移入計數(shù)管中,并做好相應的標記,用γ計數(shù)儀測定cpm值。所有實驗均設(shè)2復孔,自然釋放孔與最大釋放孔cpm值之比<20%。
殺傷率(%)=[(實驗孔平均cpm值-自然釋放孔平均cpm值)/(最大釋放孔平均cpm值-自然釋放孔平均cpm值)]×100結(jié)果,VH CDR3肽-CTLs能殺傷負載該肽的T2細胞和HOC1A細胞,表明VH CDR3肽確實為抗獨特型抗體中具有殺傷效應的表位肽,而且該表位肽也是卵巢癌抗原OC166-9的優(yōu)勢表位肽,能參與免疫反應的誘導(如圖8C);VL CDR3肽-CTLs也能殺傷負載該肽的T2細胞和HOC1A,也是抗獨特型抗體中具有殺傷效應的優(yōu)勢表位肽(如圖F)。隨效靶比降低,6B11-CTLs、VH CDR3肽-CTLs和VL CDR3肽-CTLs對靶細胞的殺傷率亦隨之降低。其余各肽-CTLs均不能殺傷相應肽刺激的T2細胞和HOC1A細胞,為抗獨特型抗體6B11中與T細胞殺傷效應無關(guān)的肽(如圖8A、B,D、E,G-J)。
為了進一步分析上述殺傷作用的效應情況,應用抗人MHC-I類分子抗體對靶細胞進行阻斷,以判斷CTL表位肽的作用情況。首先,摸索最適的MHC-I類分子抗體的使用濃度,最終選擇1∶20的稀釋度(如圖9)。MHC-I類分子阻斷后的51Cr釋放實驗結(jié)果顯示,VH CDR3肽-CTLs仍然可以殺傷經(jīng)MHC-I類分子阻斷的該肽刺激的T2細胞和HOC1A細胞,其殺傷作用不受MHC-I類分子抗體干擾,也即與CD8T細胞的作用無關(guān);VL CDR3肽-CTLs對經(jīng)MHC-I類分子阻斷的該肽刺激的T2細胞和HOC1A細胞的殺傷作用明顯受到抑制,其殺傷作用受MHC-I類分子抗體的干擾,主要是CD8T細胞介導的(如圖10)。表明,雖然VH CDR3肽與VL CDR3肽均能引發(fā)殺傷作用,但是其效應機制不同,前者與CD8T細胞無關(guān),而后者為CD8T細胞介導,也即說明VL CDR3肽(SQSTHFPYT)為抗獨特型抗體6B11的一個CTL表位肽。
五、抗獨特型抗體6B11 T細胞表位肽生物活性的檢測(一)51Cr釋放實驗檢測抗獨特型抗體6B11 T細胞表位肽殺傷作用的特異性和有效性分別以Th表位肽、CTL表位肽和抗獨特型抗體6B11誘導特異性CTLs細胞作為效應細胞;以K562細胞和HOC1A細胞為靶細胞進行51Cr釋放實驗,用以檢測Th表位肽、CTL表位肽殺傷作用的特異性,并與抗獨特型抗體6B11進行比較。未負載DCs刺激的T細胞和naiveT細胞作為陰性對照。結(jié)果,VH CDR3肽-CTLs能殺傷K562細胞,存在非特異性效應機制;VL CDR3肽-CTLs不能殺傷K562細胞,不存在非特異性效應機制(如圖11)。由于VH CDR3肽和VL CDR3肽均為抗獨特型抗體6B11的效應部分,二者分別參與了其誘導的非特異性和特異性的效應機制。
為了考察T細胞表位肽殺傷作用的有效性和殺傷效率,我們進行了如下實驗。分別利用終濃度為30μg/ml的VH CDR3肽、30μg/ml的VL CDR3肽、15μg/ml的VH CDR3肽與15μg/ml的VL CDR3肽和40μg/ml的抗獨特型抗體6B11刺激T細胞,獲得相應的特異性CTLs作為效應細胞,以HOC1A為靶細胞,進行51Cr釋放實驗,以對比各組抗原物質(zhì)刺激免疫反應的有效性。結(jié)果,VH CDR3肽-CTLs和VL CDR3肽-CTLs均能殺傷靶細胞HOC1A,而且聯(lián)合應用VH CDR3肽和VL CDR3肽刺激得到的特異性CTLs殺傷作用更強,表明二者之間存在協(xié)同效應;與6B11-CTLs相比,其殺傷作用也更強(如圖12)。進一步證明了,VH CDR3肽和VL CDR3肽為抗獨特型抗體6B11中負責誘導T細胞反應的有效成分,具有比抗獨特型抗體6B11更為精確的效應作用。
(二)ELISA法檢測T細胞表位肽誘導細胞因子譜的情況分別以6B11-CTLs、VH CDR3-CTLs和VL CDR3-CTLs與靶細胞HOC1A按40∶1的比例混合,于37℃、5%CO2條件下共同孵育48小時,收獲上清,利用雙抗夾心ELISA方法測定IL-2、IFN-γ和IL-4的含量。結(jié)果,6B11-CTLs能分泌高水平的IL-2和IFN-γ,IL-4分泌水平低,表明抗獨特型抗體6B11誘導的免疫反應存在Th1或Tc1極化現(xiàn)象;VH CDR3肽-CTLs也能分泌高水平的IL-2和IFN-γ,IL-4分泌水平低,表明其誘導Th1型免疫反應;VH CDR3肽和VL CDR3肽特異性CTLs亦能分泌高水平的IL-2和IFN-γ,IL-4分泌水平低,與抗獨特型抗體6B11所誘導的免疫反應趨勢相同,從另一個角度說明了,VH CDR3肽和VL CDR3肽參與了抗獨特型抗體6B11來源的T細胞免疫反應的誘導(如圖13)。
(三)Elispot法檢測分泌IFN-γ的特異性細胞頻數(shù)Elispot方法能從單個細胞水平精確檢測抗原特異性細胞因子的產(chǎn)生情況,并能計數(shù)抗原特異性細胞的數(shù)量,為監(jiān)測免疫反應的最為有效的方法之一。以6B11-CTLs、VH CDR3和VL CDR3肽特異性CTLs為反應細胞,HOC1A和HLE細胞為刺激細胞,共同孵育24h后,檢測抗原特異性IFN-γ分泌細胞的數(shù)量。結(jié)果,6B11-CTLs、VH CDR3和VL CDR3肽特異性CTLs均能對HOC1A細胞發(fā)生應答,IFN-γ分泌細胞的頻數(shù)分別為196/1×106T細胞和184/1×106T細胞,二者與未負載DCs刺激的T細胞組和naiveT細胞組相比差異有統(tǒng)計學意義。各組T細胞對HLE細胞應答情況相當,IFN-γ分泌細胞的頻數(shù)相仿(如圖14)。以上結(jié)果表明,抗獨特型抗體6B11與VH CDR3和VL CDR3肽均能誘導抗原特異性T細胞反應,而且IFN-γ是該抗原特異性T細胞的效應分子。
六、抗獨特型抗體6B11 T細胞表位肽在構(gòu)建卵巢癌疫苗中的應用目前,由于對卵巢癌抗原的信息了解較少,尚缺乏用于構(gòu)建卵巢癌疫苗的特異性T細胞表位肽,上述T細胞表位肽對于構(gòu)建卵巢癌疫苗具有重要的意義。以下以熱休克蛋白為例,舉例說明T細胞表位肽在構(gòu)建卵巢癌疫苗中的應用。
(一)T細胞表位肽-熱休克蛋白卵巢癌疫苗的構(gòu)建(1)理論基礎(chǔ)T細胞表位肽單獨應用易降解,熱休克蛋白被認為是目前最理想的肽疫苗構(gòu)建的載體,其優(yōu)點如下種屬間同源性高,可以避免引發(fā)同種異體反應;與肽結(jié)合或形成融合蛋白后,可以防止肽的降解;可以引導肽進入相應的免疫刺激通路中,使肽的作用更為精確;可以激活抗原遞呈細胞,促進細胞因子的分泌,從而增強免疫反應;可以促進抗原的交叉遞呈。
(2)構(gòu)建方案1)構(gòu)建T細胞表位肽與熱休克蛋白的融合蛋白作為卵巢癌疫苗①T細胞表位肽與熱休克蛋白融合蛋白的構(gòu)建、表達和鑒定利用基因克隆、DNA重組和PCR技術(shù)構(gòu)建包含組蛋白標簽的T細胞表位肽與熱休克蛋白融合基因的質(zhì)粒(CTL肽-熱休克蛋白質(zhì)粒、Th肽-熱休克蛋白質(zhì)粒、CTL肽-linker-Th肽-熱休克蛋白質(zhì)粒、CTL肽-linker-通用Th肽-熱休克蛋白質(zhì)粒、無關(guān)CTL肽-熱休克蛋白質(zhì)粒、通用Th肽-熱休克蛋白質(zhì)粒);以大腸桿菌BL21(DE3)作為表達菌,經(jīng)IPTG誘導后以包涵體的形式表達T細胞表位肽-熱休克蛋白的融合蛋白;為了恢復熱休克蛋白的構(gòu)像和溶解性,采用鎳結(jié)合柱借助組蛋白標簽純化和復性T細胞表位肽與熱休克蛋白的融合蛋白;利用ELISA和Western blot方法檢測融合蛋白中熱休克蛋白的生物活性;以32P標記的ATP為底物,通過監(jiān)測自ATP釋放32P的射線量,檢測熱休克蛋白的ATP酶活性情況;利用SDS-PAGE凝膠電泳和序列測定來檢測融合蛋白的分子量以及分析序列的正確性。
②卵巢癌患者體外實驗檢測T細胞表位肽與熱休克蛋白融合蛋白疫苗的抗卵巢癌作用DCs的培養(yǎng)以及成熟誘導;以DCs負載T細胞表位肽與熱休克蛋白的融合蛋白,DCs負載無關(guān)T細胞表位肽與熱休克蛋白的融合蛋白組和未負載DC組均作為陰性對照;上述各組DCs刺激卵巢癌患者自體T細胞,利用流式細胞術(shù)分析效應細胞的組成和激活情況,利用ELISA方法測定效應細胞培養(yǎng)上清中細胞因子(IL-2、IL-4、INF-γ和TNFα等)的表達情況,判斷效應細胞的極性(Th1、Tc1極化或是Th2、Tc2極化),利用ELISPOT方法檢測抗原特異性效應細胞的數(shù)量,利用51Cr釋放實驗檢測效應細胞的抗卵巢癌作用。
③動物實驗檢測T細胞表位肽與熱休克蛋白融合蛋白疫苗的抗卵巢癌作用建立SCID鼠卵巢癌模型,皮下注射T細胞表位肽與熱休克蛋白的融合蛋白疫苗,觀察SCID鼠的一般狀況、腫瘤生長情況和腹水產(chǎn)生情況;觀察SCID鼠的平均生存期;取SCID鼠腫瘤組織,切片后免疫組化染色檢測腫瘤浸潤淋巴細胞的類型、數(shù)量以及隨時間推移的變化情況。
2)構(gòu)建T細胞表位肽與熱休克蛋白可逆性結(jié)合的卵巢癌疫苗熱休克蛋白的表達和鑒定;T細胞表位肽與熱休克蛋白結(jié)合序列的合成;Bio-Rad法測定熱休克蛋白的濃度,肽與熱休克蛋白按摩爾比10∶1混合于結(jié)合緩沖液中,37℃條件下作用1小時,Microcon 50經(jīng)分子排阻法去除游離肽;利用質(zhì)譜分析、凝膠電泳和ATP酶活性分析的方法來鑒定T細胞表位肽與熱休克蛋白可逆性結(jié)合的情況;卵巢癌患者體外實驗和動物實驗檢測所構(gòu)建疫苗的抗卵巢癌作用(具體參見構(gòu)建方法一相關(guān)實驗)。
(二)T細胞表位肽參與構(gòu)建多表位肽卵巢癌疫苗由于腫瘤抗原在個體間存在一定的差異,而且即使是相同的腫瘤抗原在機體免疫選擇的壓力下也容易發(fā)生調(diào)變,因而某種抗原來源的肽不可能適用于所有腫瘤患者。雖然,所述的抗獨特型抗體T細胞表位肽為模擬腫瘤抗原的T細胞表位肽,可以克服腫瘤抗原來源肽的免疫耐受性,但是因MHC限制性問題,也應該考慮聯(lián)合其他卵巢癌相關(guān)的T細胞表位肽共同構(gòu)建卵巢癌疫苗,以擴大卵巢癌疫苗的適用范圍。載體仍可以選擇熱休克蛋白(具體構(gòu)建方法如前所述),只是將所述的抗獨特型抗體T細胞表位肽與其他T細胞表位肽(如P53來源)共同用于構(gòu)建。
七、抗獨特型抗體6B11 T細胞表位肽在構(gòu)建檢測試劑盒中的應用(一)理論基礎(chǔ)MHC分子、T細胞表位肽和β2微球蛋白是T細胞受體識別的基本單位,構(gòu)建此三種分子構(gòu)成的復合體,可以對具有相應T細胞表位肽受體的T細胞進行檢測,從而可以反映表位肽所組成的卵巢疫苗應用后的治療反應,并能對其療效進行客觀的評價。
(二)構(gòu)建方案將MHC分子與β2微球蛋白的基因克隆于原核表達載體,分別在大腸桿菌中表達;將此兩種表達產(chǎn)物與T細胞表位肽按摩爾比1∶2∶40于4℃透析過夜(透析法),或與肽共同稀釋于200ml緩沖液中,10℃孵育(稀釋法);利用BirA酶將上述復合物進行生物素化,生物素化的復合物再與藻紅蛋白標記的親和素按4∶1比例混合,從而構(gòu)建成為Tetramer檢測試劑盒。
權(quán)利要求
1.一種卵巢癌抗獨特型抗體6B11的T細胞表位肽,其序列為IALITTKIAWYFDV或SQSTHFPYT。
2.如權(quán)利要求1所述的T細胞表位肽在制備卵巢癌疫苗中的應用。
3.如權(quán)利要求2所述的應用,其中T細胞表位肽與熱休克蛋白共同構(gòu)建卵巢癌疫苗。
4.如權(quán)利要求3所述的應用,其中T細胞表位肽與熱休克蛋白構(gòu)建融合蛋白。
5.如權(quán)利要求2所述的應用,其中T細胞表位肽與熱休克蛋白構(gòu)成可逆性結(jié)合的卵巢癌疫苗。
6.如權(quán)利要求3、4或5所述的應用,其中熱休克蛋白為人或鼠的HSP70或gp96。
7.一種檢測卵巢癌疫苗治療反應和療效的試劑盒,其包括如權(quán)利要求1所述的T細胞表位肽。
全文摘要
本發(fā)明涉及卵巢癌抗獨特型抗體6B11的兩條T細胞表位肽,其序列分別為IALITTKIAWYFDV和SQSTHFPYT。還涉及了這兩條肽在制備卵巢癌疫苗以及檢測卵巢癌疫苗治療反應和療效的試劑盒中的應用,所述肽可以與熱休克蛋白共同構(gòu)建卵巢癌疫苗。所述肽在治療卵巢癌中具有良好的應用前景。
文檔編號A61K39/00GK1865281SQ200610083299
公開日2006年11月22日 申請日期2006年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2006年6月2日
發(fā)明者崔恒, 李巍, 昌曉紅, 馮捷, 程洪艷, 郭慧芳, 成夜霞 申請人:北京大學人民醫(yī)院