專利名稱：一種自發(fā)淋巴高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)、微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，具體涉及一種自發(fā)淋巴高轉(zhuǎn)移性人 卵巢癌細(xì)胞系及其建立方法和用途。
背景技術(shù)：
研究報(bào)道，卵巢癌死亡率位居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位，高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率和化療 耐藥成為影響預(yù)后的兩大特點(diǎn)。淋巴轉(zhuǎn)移是卵巢癌早期播散的主要途徑，是引起卵巢癌 術(shù)后復(fù)發(fā)、影響預(yù)后的重要因素。因卵巢癌死亡的患者中有48% 70%發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn) 移(Pereira A, Magrina JF, Rey V, et al. Pelvic and aortic lymph nodemetastasis in epithelial ovarian cancer. Gynecol Oncol. 2007 ; 105 :604_608·)。 在進(jìn)展期 的患者中腹膜后淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率為55% 75% (Di Re F，Baiocchi G. Value of lymph node assessmentin ovarian cancer :Status of the art at the end of the secondmillennium. Int J Gynecol Cancer. 2000 ; 10 :435_442.)。腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與 患者生存率相關(guān)，有報(bào)道(吳小華，張志毅.卵巢癌腹膜后淋巴結(jié)切除術(shù)生存預(yù)后因素分 析.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展.1996 ；5 133-136.)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)是無淋巴結(jié)轉(zhuǎn) 移患者的2. 75倍。因此，有必要加強(qiáng)對(duì)卵巢癌細(xì)胞淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究，而建立可靠的淋 巴高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系和動(dòng)物模型則是當(dāng)務(wù)之急。在人卵巢癌細(xì)胞系中，可用于小鼠移植瘤模型轉(zhuǎn)移研究的細(xì)胞系包括SK0V-3、 CA0V-3、CAOV-4、0VCAR-3、A0、3A0及H0-8910等。由這些細(xì)胞株所建立的裸鼠皮下移植瘤 和腹腔轉(zhuǎn)移瘤模型均少見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生。其中AO、CA0V-3、CA0V-4和0VCAR-3有相 對(duì)較高的轉(zhuǎn)移率，但研究顯示主要是出現(xiàn)在肺轉(zhuǎn)移(60% -90% )(高慶蕾，孟力，王世宣， et al.卵巢癌高頻轉(zhuǎn)移細(xì)胞模型的建立及其與nm23-Hl的相關(guān)性研究.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn) 展.2003 ；12 :161-163.)。而許沈華等(許沈華，錢麗娟，牟瀚舟，et al.高轉(zhuǎn)移人卵巢癌細(xì) 胞系H0-8910PM的建立及其生物學(xué)特性.中華病理學(xué)雜志.1998 ；27 =451-452.)從H0-8910 中建立的卵巢癌高轉(zhuǎn)移株H0-8910PM也是通過肺轉(zhuǎn)移灶建立的。臨床實(shí)踐顯示，卵巢癌很 少發(fā)生肺轉(zhuǎn)移，研究者認(rèn)為，從肺轉(zhuǎn)移灶中尋找的高轉(zhuǎn)移株似不能完全反應(yīng)臨床真實(shí)情況。 另有學(xué)者從低轉(zhuǎn)移潛能的卵巢癌細(xì)胞株SK0V-3從分離出淋巴定向轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SK0V3-pm3， 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率可達(dá)到100% (阮和云，黎丹戎，李力，et al.卵巢癌淋巴結(jié)定向轉(zhuǎn)移裸鼠動(dòng) 物模型的建立.現(xiàn)代婦產(chǎn)科進(jìn)展.2007; 16:338-340.)。但是，所建立的卵巢癌轉(zhuǎn)移模型是 采用細(xì)胞在裸鼠足墊注射，從局部引流淋巴結(jié)內(nèi)篩選到定向到淋巴結(jié)的高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株。該 模型只有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，沒有腹腔轉(zhuǎn)移和腹水，與患者臨床病情轉(zhuǎn)歸有所不同。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種自發(fā)淋巴高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系-SK0V-3/LN403。本 發(fā)明的進(jìn)一步目的是提供該淋巴高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系的醫(yī)用用途。本發(fā)明以人卵巢癌細(xì)胞系SK0V-3 (美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC編號(hào)HTB_77，由一位64歲女性卵巢腺癌患者的腹水中分離而得)為親本細(xì)胞，通過多次BALB/c裸小鼠腹腔注射、腹膜后淋巴結(jié)連續(xù)篩選、體外擴(kuò)增和傳代等策略，分離得到了具有自發(fā)性淋巴高 轉(zhuǎn)移潛能的人卵巢癌細(xì)胞系SK0V-3/LN403。已于2009年3月27日保藏，保藏單位CGMCC， 北京市朝陽區(qū)大屯路，保藏編號(hào)=CGMCC No. 2940，分類命名人卵巢癌細(xì)胞系參照的細(xì)胞株 為SK0V-3/LN403，該細(xì)胞株具有明顯的淋巴高轉(zhuǎn)移性。本發(fā)明細(xì)胞系具有以下生物學(xué)特性1) SK0V-3/LN403與其親本腫瘤細(xì)胞SK0V-3相比細(xì)胞形態(tài)類似，均為不規(guī)則形，但
多呈集落生長；2) SK0V-3/LN403在體外的細(xì)胞生長、增殖能力和侵襲能力均高于其親本細(xì)胞；3)接種BALB/c裸小鼠后患鼠的生存期顯著縮短，淋巴轉(zhuǎn)移率由親本腫瘤細(xì)胞 SK0V-3 的 10% (η = 10)上升為 90% (η = 10)。本發(fā)明的細(xì)胞系SK0V-3/LN403具有以下特點(diǎn)1.所建立的動(dòng)物模型接近于卵巢癌患者的臨床實(shí)際情況能廣泛腹腔內(nèi)轉(zhuǎn)移；血 性腹水；淋巴轉(zhuǎn)移率高達(dá)90%，累及腹膜后淋巴結(jié)。2.生存期縮短(35. 1 士8. 3) vs (64. 5士21. 2)，可使實(shí)驗(yàn)周期縮短，便于觀察。3.遺傳背景清楚，生物學(xué)特性穩(wěn)定來自于廣泛使用的人卵巢癌細(xì)胞系SK0V-3， 經(jīng)多次傳代及修飾后仍保持穩(wěn)定。本發(fā)明細(xì)胞系以及由此建立的動(dòng)物模型能模擬卵巢癌患者的臨床實(shí)際情況，為研 究卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為和調(diào)控機(jī)制，及其為臨床抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選提供了理想 的實(shí)驗(yàn)工具。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行詳細(xì)地描述。


圖1是SK0V-3/LN403與SK0V-3細(xì)胞形態(tài)學(xué)差異(倒置相差顯微鏡X 200倍)。圖2是SK0V-3/LN403與SK0V-3細(xì)胞的生長曲線。圖3是SK0V-3/LN403腹膜后淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。圖4是SK0V-3/LN403淋巴結(jié)漿液性腺癌轉(zhuǎn)移(HE X 200倍)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1(一)細(xì)胞培養(yǎng)本發(fā)明所涉及的細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FCS)的McCoy’ s5A細(xì)胞培養(yǎng)基 中。培養(yǎng)溫度為37°C，氣體環(huán)境為5%C02/95%空氣，濕度為飽和濕度。傳代時(shí)，用0.25% 的胰蛋白酶消化細(xì)胞，按1 3的比例傳代。( 二)淋巴高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的篩選和建系1.淋巴高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的首輪篩選①將處于生長對(duì)數(shù)期的SK0V-3細(xì)胞用0. 25%的胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液；②無菌條件下，用Iml注射器將腫瘤細(xì)胞接種于6周齡BALB/c雌性裸小鼠腹腔， 接種量為5 X IO6細(xì)胞/lml/只，共五只；
③常規(guī)飼養(yǎng)4周后，斷頭放血，處死裸小鼠，并用75%的酒精浸泡消毒5分鐘；④無菌操作，解剖裸小鼠，取出腹膜后淋巴結(jié)，在生理鹽水中漂洗3次；⑤剪取淋巴結(jié)，剪碎后，移至6孔板中培養(yǎng)；⑥待細(xì)胞貼壁后，更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基；⑦用半消化法和半機(jī)械法清除成纖維細(xì)胞；⑧體外繼續(xù)擴(kuò)增本輪篩選所得的腫瘤細(xì)胞，部分用于下輪篩選，部分予以凍存?zhèn)?br> 用。
2.淋巴高轉(zhuǎn)移細(xì)胞的連續(xù)篩選和建系同法進(jìn)行第2 4輪肺轉(zhuǎn)移細(xì)胞的篩選，各輪所得的細(xì)胞分別命名為SK0V-3/ LNlOl 5、SK0V-3/LN201 5、SK0V-3/LN301 5 和 SK0V-3/LN401 5。其中 SK0V-3/ LN403在體外長期培養(yǎng)逾10代，成為連續(xù)傳代的細(xì)胞系。(三)小鼠淋巴轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)l.BALB/c 裸小鼠①將處于對(duì)數(shù)生長期的SK0V-3和SK0V-3/LN403細(xì)胞用0. 25%的胰蛋白酶消化， 分別制成單細(xì)胞懸液；②無菌條件下，用Iml注射器將腫瘤細(xì)胞接種于裸小鼠腹腔，接種量為5 X IO6細(xì) 胞/lml/只；③隔天觀察裸小鼠的健康狀況、腹水生成情況和生存期；④患鼠死亡時(shí)解剖并經(jīng)病理檢查有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。結(jié)果顯示通過多次BALB/c裸小鼠腹腔注射、腹膜后淋巴結(jié)連續(xù)篩選、體外擴(kuò)增和傳代等策 略，分離得到了具有自發(fā)性淋巴高轉(zhuǎn)移潛能的人卵巢癌細(xì)胞系SK0V-3/LN403。該細(xì)胞系體 外培養(yǎng)生長良好，每3天傳代一次。SK0V-3和SK0V-3/LN403的細(xì)胞形態(tài)類似，均為不規(guī)則形，但多呈集落生長(圖 1)。采用MTT法描記SK0V-3和SK0V-3/LN403的細(xì)胞生長曲線，結(jié)果表明SK0V-3/ LN403細(xì)胞生長、增殖能力高于SK0V-3細(xì)胞(圖2)。Transwell實(shí)驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，SK0V-3/LN403細(xì)胞較SK0V-3細(xì)胞有更強(qiáng)的侵襲能 力。前者穿透人工基底膜的細(xì)胞數(shù)是163士26/HP，后者穿透人工基底膜的細(xì)胞數(shù)是54士8/ HP。接種SK0V-3/LN403細(xì)胞后小鼠的平均生存期為(35. 1 士 8. 3)天，患鼠腹腔腫瘤分 布廣泛，腫塊增大相互融合成片，有6只出現(xiàn)血性腹水，淋巴轉(zhuǎn)移率為90% ；接種SK0V-3細(xì) 胞后小鼠的平均生存期為(64. 5士21. 2)天，患鼠腹腔多處腫瘤種植，有1只出現(xiàn)少許血性 腹水，淋巴轉(zhuǎn)移率為10%。圖3顯示腹膜后淋巴結(jié)，病理證實(shí)為轉(zhuǎn)移性漿液性腺癌(圖4)。
權(quán)利要求
一種自發(fā)淋巴高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系，其特征是所述細(xì)胞分類命名人卵巢癌細(xì)胞系，細(xì)胞株為SKOV-3/LN403，保藏編號(hào)CGMCC No.2940。
2.按權(quán)利要求1所述的自發(fā)淋巴高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系，其特征是所述細(xì)胞具有以 下生物學(xué)特性1)與其親本腫瘤細(xì)胞SKOV-3相比細(xì)胞形態(tài)類似，為不規(guī)則形，多呈集落生長；2)在體外的細(xì)胞生長、增殖能力和侵襲能力高于其親本細(xì)胞；3)接種BALB/c裸小鼠后患鼠的生存期縮短，淋巴轉(zhuǎn)移率為90%。
3.按權(quán)利要求1所述的自發(fā)淋巴高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系，其特征是所述細(xì)胞的親本 腫瘤細(xì)胞是SKOV-3ATCC保藏編號(hào)HTB-77。
4.權(quán)利要求1所述的自發(fā)淋巴高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系在建立模擬卵巢癌臨床實(shí)際 情況動(dòng)物模型中的用途。
5.權(quán)利要求1所述的自發(fā)淋巴高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系在篩選抗卵巢癌轉(zhuǎn)移藥物中 的用途。
全文摘要
本發(fā)明屬生物技術(shù)、微生物動(dòng)物細(xì)胞系領(lǐng)域，具體涉及一種自發(fā)淋巴高轉(zhuǎn)移性人卵巢癌細(xì)胞系及其建立方法和用途。本發(fā)明以人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3(ATCC編號(hào)HTB-77，)為親本細(xì)胞，通過BALB/c裸小鼠腹腔注射、腹膜后淋巴結(jié)連續(xù)篩選、體外擴(kuò)增和傳代等策略，分離得到了具有自發(fā)性淋巴高轉(zhuǎn)移潛能的人卵巢癌細(xì)胞系SKOV-3/LN403，保藏編號(hào)CGMCC No.2940，本發(fā)明細(xì)胞系以及由此建立的動(dòng)物模型能模擬卵巢癌患者的臨床實(shí)際情況，為研究卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的生物學(xué)行為和調(diào)控機(jī)制，及其為臨床抗轉(zhuǎn)移藥物的篩選提供了理想的實(shí)驗(yàn)工具。
文檔編號(hào)C12Q1/18GK101845418SQ20091004846
公開日2010年9月29日 申請(qǐng)日期2009年3月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月27日
發(fā)明者叢青, 吳志勇, 康玉, 張曉燕, 張?chǎng)┍? 徐從劍, 武欣, 王宜生, 程明軍, 羅建明, 黃以萍, 黃宇婷 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院