專利名稱：小鼠裸卵體外成熟技術的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種小鼠裸卵體外培養(yǎng)成熟的技術，屬于生物技術領域。
(二)
背景技術：
許多研究證明，體外成熟(IVM)之前脫去卵丘細胞會嚴重影響卵母細胞的 胚月臺發(fā)育育g力(Schroeder AC, Eppig JJ. ， The developmental capacity of mouse oocytes that matured spontaneously in vitro is normal. Dev Biol 1984; 102: 493-497)和谷胱甘肽(GSH)合成能力(de Matos DG, Furnus CC， Moses DF. ， Glutathione synthesis during in vitro maturation of bovine oocytes: role of cumulus cells. Biol R印rod 1997:57:1420-1425)。盡管 有些動物的裸卵(DO)在體外能夠完成核成熟，但體外受精后發(fā)育能力大大下 降(Ge L， Han D， Lan GC et aL Factors affecting the in vitro action of cumulus cells on the maturing mouse oocytes. Mol R印rod Dev 2008; 75: 136-142)。然而，對于生發(fā)泡(GV)移植，體細胞單倍體化、利用GV期胞質進 行體細胞克隆以及GV期卵母細胞冷凍保存等胚胎工程技術，卵母細胞都必須在 體外成熟前脫去卵丘細胞。因此，建立有效的DO體外成熟系統(tǒng)勢在必行。然而， 目前為止，全世界還都沒有建立起任何一種哺乳動物的DO體外成熟系統(tǒng)。另外， 小鼠是進行上述胚胎工程技術研究的主要模式動物，因此，建立小鼠裸卵體外 成熟系統(tǒng)的意義尤為重大。
近年來，許多研究者嘗試與卵丘細胞共培養(yǎng)來改善DO的體外成熟質量，但 研究結果證明，除非保留放射冠，與卵丘細胞或卵丘一卵母細胞復合體(COC) 共培養(yǎng)都只能部分恢復體外成熟DO的發(fā)育能力(Ge L， Han D， Lan GC et al. Factors affecting the in vitro action of cumulus cells on the maturingmouse oocytes. Mol Reprod Dev 2008; 75: 136-142)。有研究表明，向 成熟培養(yǎng)液中添加半胱胺可提高卵母細胞的谷胱甘肽(GSH)水平，從而提高卵 母細胞發(fā)育能力(de Matos DG， Furnus CC， Moses DF et al. Effect of cysteamine on glutathione level and developmental capacity of bovine oocyte matured in vitro. Mol R印rod Dev 1995)。體夕卜成熟DO的GSH含量 遠遠低于C0C (de Matos DG， Furnus CC， Moses DF. Glutathione synthesis during in vitro maturation of bovine oocytes: role of cumulus cells. Biol R印rod 1997; 57: 1420-1425)。另外，我們先前的研究證明，向成熟培養(yǎng)液 中聯(lián)合添加半胱胺和胱氨酸比單獨添加二者之一提高山羊卵母細胞發(fā)育能力效 果更佳(Zhou P， Wu YG， Li Q et al. The interactions between cysteamine, cystine and cumulus cells increase the irvtracellular glutathione level and developmental capacity of goat cumulus—denuded oocytes. Reproduction 2008;135:605-611)。因此，我們設想，可以通過共培養(yǎng)結合添加半胱胺和胱 氨酸使小鼠裸卵完全恢復發(fā)育能力。
發(fā)明內容
本發(fā)明為卵丘細胞利用胱氨酸和半胱胺提高了小鼠裸卵的GSH合成和發(fā)育 能力，進而建立了卵丘細胞共培養(yǎng)結合添加半胱胺和胱氨酸使小鼠裸卵完全恢 復發(fā)育能力的體外成熟系統(tǒng)。本發(fā)明通過以下技術方案實現(xiàn)即把小鼠裸卵與 小鼠或山羊卵丘顆粒細胞置于添加100-200umol/l半胱胺和250-300 P mol/1 胱氨酸的TCM-199成熟培養(yǎng)液中共培養(yǎng)，培養(yǎng)成熟的小鼠C0C和共培養(yǎng)成熟的 裸卵產生的2-細胞胚胎移植到假孕受體。
用原來不含有半胱胺或胱氨酸的M16培養(yǎng)基作為成熟培養(yǎng)液發(fā)現(xiàn)，盡管山 羊卵丘細胞只需要半胱胺或者胱氨酸就能促進小鼠DO的GSH合成，但小鼠卵丘細胞則需要半胱胺和胱氨酸同時存在才能促進DO的GSH合成。用TCM-199培養(yǎng) 基進行成熟培養(yǎng)證明，不加半胱胺或者添加100-200 " mol/1半胱胺和83 u mol/1 胱氨酸不能提高小鼠卵母細胞的囊胚形成率，但添加100-200 u mol/1半胱胺和 250-300 u mol/1胱氨酸再結合與小鼠或山羊卵丘細胞共培養(yǎng)則使小鼠DO的囊胚 率提高到添加相同巰基化合物培養(yǎng)成熟的COC的水平。把由添加適當濃度半胱 胺和胱氨酸培養(yǎng)成熟的小鼠COC和共培養(yǎng)成熟的DO產生的2-細胞胚胎移植到假 孕受體后，COC和DO的妊娠率和產仔數(shù)差異不顯著，說明所建立的小鼠裸卵體 外成熟體系是成功的，能夠使小鼠裸卵完全恢復發(fā)育能力，'所述的適當濃度為 100-200 u mol/1半胱胺和250-300 u mol/1胱氨酸。
本技術的關鍵是把小鼠裸卵用添加適當濃度半胱胺和胱氨酸的TCM-199培 養(yǎng)液與小鼠或山羊卵丘細胞共培養(yǎng)成熟，體外受精后囊胚發(fā)育率和胚胎移植產 仔率都達到與同等條件下成熟的COC相同水平。這是在國際上首次建立能夠使 小鼠裸卵完全恢復發(fā)育能力的體外成熟系統(tǒng)，對于動物胚胎工程以及人類輔助 生殖技術研究和應用都有重要意義。
(四)


圖l:小鼠裸卵體外成熟培養(yǎng)的程序示意圖
1是成熟培養(yǎng)液的配制
2是小鼠D0的制備
3是小鼠或山羊顆粒細胞單層制備
4是小鼠D0的成熟培養(yǎng)
5是體外受精和胚胎培養(yǎng)
6是胚胎移植
具體實施方式
1、成熟培養(yǎng)液配制
TCM-199培養(yǎng)液(Gibco， Grand Island, NY， USA)添力口 1 u g/ml E2， 24.2mg/l丙酮酸鈉，0. 05IU/ml FSH， 0. 05IU/ml LH和10ng/ml EGF配成成熟 培養(yǎng)液。將半胱胺和胱氨酸分別配制成20mmol/l和100ramol/l的濃儲液，-20
°。保存，用前以成熟培養(yǎng)液稀釋到所需濃度(半胱胺lOOumol/1;胱氨酸
200umol/l)。由于商品TCM-199培養(yǎng)液本身含有83umol/l胱氨酸，因此胱氨 酸最終使用濃度為283umol/l0
2、 小鼠DO制備
自超排處理的小鼠獲取卵巢，刺破大卵泡獲得COC。用直徑略大于卵母細胞 的細玻璃管反復吹打，脫去卵丘細胞獲得DO。
3、 小鼠或山羊顆粒細胞單層制備
小鼠或山羊COC于成熟培養(yǎng)液滴中脫下卵丘細胞。取出卵母細胞后，收集 卵丘細胞，以3X105個/ml接種于培養(yǎng)板孔中。卵丘細胞在37°C (小鼠)或38. 5 °C (山羊)，5%C02, 100%濕度條件下培養(yǎng)。
4、 小鼠DO的成熟培養(yǎng)
卵丘細胞〉80%貼滿時，將原來的培養(yǎng)液吸出，加入添加半胱胺和胱氨酸的 成熟培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱平衡3h后將DO移入，成熟培養(yǎng)14-16 h。培養(yǎng)條件為 DO 25-30枚/100p1成熟培養(yǎng)液，覆蓋石蠟油，37.5°C， 5%C02， 100%濕度。 5、體外受精和胚胎培養(yǎng)
雄鼠附睪尾精子置lml含10 mg/ml BSA的T6液滴內，于37。C、 5%0)2及 飽和濕度的C02培養(yǎng)箱內中獲能1. 5h。用piezo驅動顯微注射系統(tǒng)在DO透明帶 上穿一個20um的孔，然后移入受精液(添加20mg/ml BSA的T6液)滴中(DO 30-35枚/100ul)，加入適量體積的獲能精子，使精子密度在1X106個/ml。授精6h后，取含兩原核和第二極體的受精卵置于無糖CZB中(胚胎30-35個 /100 u l)進行胚胎培養(yǎng)。當胚胎發(fā)育到3-或4-細胞時，向CZB中添加5. 5mmo1/1 葡萄糖。胚胎培養(yǎng)4d，觀察囊胚發(fā)育情況。 6、胚胎移植
進行胚胎移植的前一天將8-10周齡的雌鼠與結扎的雄鼠合籠，合籠后第2d 早上檢查雌鼠的陰道栓。見栓的雌鼠作為假孕母鼠在當天下午進行胚胎移植。 將8-10個2細胞階段的胚胎用細玻璃管經輸卵管傘吹入假孕受體母鼠的輸卵管 壺腹部。胚胎移植完畢的受體母鼠單獨伺養(yǎng)直到出生后代。
權利要求
1、一種小鼠裸卵體外成熟技術，其特征在于把小鼠裸卵與小鼠或山羊卵丘顆粒細胞置于添加100-200μmol/l半胱胺和250-300μmol/l胱氨酸的TCM-199成熟培養(yǎng)液中共培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種小鼠裸卵體外成熟技術，屬于生物技術領域。本發(fā)明為卵丘細胞利用胱氨酸和半胱胺提高了小鼠裸卵GSH合成和發(fā)育能力，進而建立了卵丘細胞共培養(yǎng)結合添加半胱胺和胱氨酸使小鼠裸卵完全恢復發(fā)育能力的體外成熟系統(tǒng)。小鼠裸卵在添加100-200μmol/l半胱胺和250-300μmol/l胱氨酸的TCM-199成熟培養(yǎng)液中與小鼠或山羊卵丘細胞共培養(yǎng)，其囊胚率達到添加相同巰基化合物培養(yǎng)成熟COC水平。將共培養(yǎng)成熟的裸卵和COC產生的2-細胞胚胎移植后，妊娠率和產仔數(shù)差異不顯著。這是在國際上首次建立使小鼠裸卵完全恢復發(fā)育能力的體外成熟系統(tǒng)，對于動物胚胎工程以及人類輔助生殖技術研究和應用都有重要意義。
文檔編號C12N5/06GK101560494SQ20091001575
公開日2009年10月21日 申請日期2009年5月31日 優(yōu)先權日2009年5月31日
發(fā)明者吳延光, 萍 周, 青 李, 剛 王, 羅明久, 譚景和, 達 高, 魏德莉 申請人:山東農業(yè)大學