用于白酒釀造的釀酒酵母的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種釀酒酵母(Saccharomyces?cerevisiae)菌種HJY-002，保藏編號(hào)為CGMCC?No6979。該菌株最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是高粱汁培養(yǎng)基。發(fā)酵參數(shù)條件為溫度30℃，培養(yǎng)時(shí)間70h，接種量3％和pH6.5，其酒精含量達(dá)到7.4％vol；產(chǎn)乙酸乙酯的最佳工藝參數(shù)為：溫度25.5℃，培養(yǎng)時(shí)間60h，接種量5％和pH5.7，其乙酸乙酯含量達(dá)到16.95mg/100mL。該菌株既產(chǎn)酒精又產(chǎn)酯，既能有一定的酒精產(chǎn)量，又能很好地滿足白酒對(duì)酯香的要求，兼具了酒精酵母和產(chǎn)酯酵母的雙重特性，成為老白干釀造過程不可缺少的特征性功能菌，對(duì)于老白干酒的典型風(fēng)格特點(diǎn)的形成具有重要意義。
【專利說明】用于白酒釀造的釀酒酵母
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]中國白酒香味物質(zhì)種類繁多，包括醇、醛、酮、酸、酯、縮醛、芳香族化合物、含氮化合物、含硫化合物、醚類、內(nèi)酷類等化合物達(dá)數(shù)百種之多(莊名揚(yáng),釀酒,2007，34 (2):109一 113)。中國白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成，是微生物代謝的產(chǎn)物，同時(shí)也是原料中基本組分及非基本組分，在各類生物酶的直接或間接催化下的生物合成、非酶促化學(xué)反應(yīng)和熱降解反應(yīng)等多種因素共同作用結(jié)果。
[0003]白酒的風(fēng)味與釀造微生物及釀造工藝也有直接關(guān)系。釀造基酒質(zhì)量的聞低對(duì)廣品的最終質(zhì)量的好壞起決定性的作用。白酒釀造中的生香酵母又稱產(chǎn)酯酵母，主要屬于產(chǎn)膜酵母和假絲酵母，大多為異型漢遜酵母及少數(shù)小圓型酵母屬，是白酒和黃酒發(fā)酵產(chǎn)香的重要菌種(熊子書，釀酒科技，2002，5:19 — 21)。濃香型白酒以己酸乙酷為主的復(fù)合香，是由梭狀芽抱桿菌，俗稱己酸菌的作用，產(chǎn)于泥質(zhì)發(fā)酵老窖或人工培養(yǎng)泥窖中，發(fā)酵周期長；清香型白酒以醋酸乙酯為主體香，在小曲、鼓曲或液態(tài)法白酒中添加生香酵母，在發(fā)酵過程中生成醋酸及其乙酯。酒精發(fā)酵過程中酯的產(chǎn)生量與特殊的酵母菌種類有密切關(guān)系。
[0004]白酒發(fā)酵要求釀酒菌劑具有產(chǎn)酯率高、產(chǎn)酒精率高并耐高溫。質(zhì)量相同的原料使用不同的釀酒菌劑，形成不同的酒精產(chǎn)量和酯含量。好的釀酒菌劑使同樣的原料酒精產(chǎn)量高、富含酯類，并使白酒純香。但傳統(tǒng)大曲雖然產(chǎn)酯率高，產(chǎn)酒率卻較低，特別是大曲構(gòu)成成份復(fù)雜，使白酒質(zhì)量不穩(wěn)定；而單個(gè)酵母菌或釀酒菌劑組合物不耐高溫，雖發(fā)酵產(chǎn)酒率高但產(chǎn)酯率低，白酒品質(zhì)較差。
[0005]酒精發(fā)酵過程中酯的產(chǎn)生量與特殊的酵母菌種類有密切關(guān)系。乙酸乙酯的產(chǎn)生量高低被普遍認(rèn)為是依賴于酯的合成和酯的水解之間的平衡。在最新審定通過的中國兼香型白酒國家標(biāo)準(zhǔn)中，總酯含量(以乙酸乙酯計(jì))是劃分白酒等級(jí)的重要指標(biāo)，優(yōu)級(jí)酒總酷酯含量比一級(jí)酒高I倍(熊小毛等，2009)。如何提高白酒中總酯含量，提高白酒等級(jí)是白酒企業(yè)和研究者面對(duì)的技術(shù)難題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明提供一種釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種HJY-002,該菌株已經(jīng)于2012年12月12日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址位于北京市朝陽區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，(郵編100101)，保藏編號(hào)為CGMCC No6979
[0007]CGMCC No6979菌株的細(xì)胞卵圓形，在麥芽固體培養(yǎng)基培養(yǎng)24h后，形成乳白色菌落，表面濕潤、有光澤，圓形，邊緣整齊，隆起，不透明。
[0008]CGMCC No6979既產(chǎn)酒精又產(chǎn)酯，既能有一定的酒精產(chǎn)量，又能很好地滿足白酒對(duì)酯香的要求，兼具了酒精酵母和產(chǎn)酯酵母的雙重特性，成為老白干釀造過程不可缺少的特征性功能菌。其代謝特性對(duì)于老白干酒的典型風(fēng)格特點(diǎn)的形成具有重要意義。[0009]釀酒酵母CGMCC No6979的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是高粱汁培養(yǎng)基，該菌株酒精的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間73h，接種量3%和pH6.5，發(fā)酵液的酒精度為7.6%voL.其產(chǎn)乙酸乙酯的最佳工藝參數(shù)為:溫度25.5°C，培養(yǎng)時(shí)間60h，接種量5%和pH5.7，其乙酸乙酯含量達(dá)到16.95mg/100mL。
[0010]CGMCC No6979菌株從衡水老白干大曲中培養(yǎng)、經(jīng)過分離得到，具體步驟為:
[0011](I)麥芽粉培養(yǎng)基制備:
[0012]麥芽粉20g,蛋白胨Ig,萄萄糖20g,蒸懼水1000mL,pH調(diào)至6.0,121°C滅菌20min。 [0013]固體培養(yǎng)基加2 %瓊脂.[0014](2)菌株分離及形態(tài)觀察:
[0015]將粉碎的大曲Ig溶于9mL0.9%的滅菌生理鹽水的試管中，振蕩30分鐘，吸出ImL,注入9mL0.9%的滅菌生理鹽水的試管中，依次操作五次，稀釋倍數(shù)達(dá)107，從IO7試管中吸取0.2mL，注入裝有固體麥芽粉培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行涂布，30°C培養(yǎng)2d后，觀察菌落形態(tài)，從中挑出乳白色，表面濕潤、有光澤，圓形，邊緣整齊，隆起，不透明菌落，挑取單菌落，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，選取酵母大小均一、酵母細(xì)胞健壯的單個(gè)菌落在裝有固體麥芽粉培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)劃線培養(yǎng)，從中挑取單個(gè)菌落接入試管斜面，30°C下培養(yǎng)2d，將試管斜面菌種放入冰箱0-4°C保存?zhèn)溆谩?br> [0016](3) 26S rRNA基因序列測(cè)定:
[0017]挑取一環(huán)試管斜面菌種于10 μ L滅菌水中，99°C、IOmin變性，離心取上清液做模板，使用試劑盒 TaKaRa Fungi Identification PCRIit (Code N0.D317)，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增目的片段，取5ul進(jìn)行3%瓊脂糖凝膠電泳，使用TaKaRa Agarose Gel DNA PurificationKitVer.2.0 (Code N0.DV805A)切膠回收目的片段，以Seq Forward為引物進(jìn)行DNA測(cè)序。測(cè)序結(jié)果在GeneBank中利用Blast程序進(jìn)行比對(duì)。
[0018]采用特異性引物擴(kuò)增后，獲得的26SrDNA序列在GeneBank的比對(duì)結(jié)果顯示，HJY-002與釀酒酵母(⑶565213.1)的26S rRNA基因的相似性達(dá)到100 %。結(jié)合菌體形態(tài)特征的鑒定結(jié)果，將菌株HJY-002確定為釀酒酵母。
【專利附圖】

【附圖說明】:
[0019]圖1為HJY-002在顯微鏡下的菌體細(xì)胞形態(tài)
[0020]圖2為HJY-002在培養(yǎng)皿內(nèi)的菌落形態(tài)
【具體實(shí)施方式】:
[0021]下面通過具體的實(shí)施方案敘述本發(fā)明用于白酒釀造的釀酒酵母。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實(shí)施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本發(fā)明實(shí)質(zhì)和范圍的前提下，對(duì)這些實(shí)施方案中的物料成分和用量進(jìn)行的各種改變或改動(dòng)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022]釀酒酵母HJY-002在液態(tài)條件下產(chǎn)酒精產(chǎn)酯實(shí)驗(yàn):
[0023]培養(yǎng)基制備:
[0024](I)麥芽粉培養(yǎng)基[0025]麥芽粉20g，蛋白胨lg，萄萄糖20g，蒸餾水lOOOmL，pH調(diào)至6.0，121°C滅菌20min。固體培養(yǎng)基加2%瓊脂.[0026](2)大米麥芽培養(yǎng)基
[0027]取粉碎后的麥芽和大米按質(zhì)量比1: 4混合后，加入3倍量的水，加液化酶液化后，再加糖化酶糖化，過濾備用，糖度控制在12Brix，121°C滅菌30min。
[0028](3)純麥芽培養(yǎng)基
[0029]取粉碎后的麥芽加水，加入液化酶液化后，再加糖化酶糖化，過濾備用，糖度控制在 12Brix, 121°C滅菌 30min。
[0030](4)高粱汁培養(yǎng)基
[0031]取粉碎后的高粱加水，加入液化酶液化后，再加糖化酶糖化，過濾備用，糖度控制在 12Brix, 121°C滅菌 30min。
[0032](5)玉米汁培養(yǎng)基
[0033]按GB/T20886-2007的制備方法進(jìn)行。
[0034]測(cè)定方法
[0035]I酒精度的測(cè)定
[0036]取成熟發(fā)酵液200mL加入到蒸餾瓶中，加入IOOmL蒸餾水，調(diào)pH在6.5左右，混勻后蒸餾，準(zhǔn)確取出IOOmL蒸餾液，用酒精計(jì)測(cè)定酒精含量，同時(shí)測(cè)定溫度，轉(zhuǎn)換成20°C時(shí)的酒精度。
[0037]2香氣成分分析
`[0038]采用島津GC-14C氣相色譜儀對(duì)蒸餾后的溜出液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定條件:大口徑毛細(xì)管柱，柱溫70°C，進(jìn)樣器溫度250°C，檢測(cè)器溫度230°C。
[0039]酵母菌發(fā)酵
[0040]通過對(duì)酵母菌在不同溫度、不同培養(yǎng)基、不同接種量和不同發(fā)酵時(shí)間條件下，發(fā)酵產(chǎn)物的酒精度測(cè)定，確定其各自最佳溫度、培養(yǎng)基、接種量和發(fā)酵時(shí)間。
[0041]菌株HJY-002可在23°C~30°C的范圍內(nèi)發(fā)酵，29°C時(shí)，發(fā)酵液的酒精含量最高，達(dá)到4.6% vol，相當(dāng)于23°C時(shí)的1.58倍。該菌株的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是高粱汁培養(yǎng)基。高粱培養(yǎng)基中酒精含量最高，達(dá)到6.30% vol，是玉米培養(yǎng)基的2.1倍。接種量在2% -7%的范圍內(nèi)，隨著接種量的提高，發(fā)酵液的酒精含量逐漸增大，3%的接種量，發(fā)酵液酒精含量最高，達(dá)到4.3% voL.當(dāng)培養(yǎng)時(shí)間為72h時(shí)，發(fā)酵液的酒精含量最高，達(dá)到3.5% vol，是36h含量的1.3倍。
[0042]發(fā)酵參數(shù)條件為溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間70h，接種量3%和pH6.5，其酒精含量達(dá)到
7.4% voL.更優(yōu)的發(fā)酵參數(shù)為:為:溫度30 ? C，培養(yǎng)時(shí)間73h，接種量3%和pH6.5。酒精度為 7.6% vol。
[0043]釀酒酵母(HJY-002)香氣成分實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0044]釀酒酵母HJY-001香氣成分發(fā)酵條件的L9 (34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0045]
【權(quán)利要求】
1.釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種 HJY-002，保藏編號(hào)為 CGMCC No6979。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種HJY-002，其特征在于所述釀酒酵母CGMCC No6979的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是高粱汁培養(yǎng)基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種HJY-002，其特征在于所述釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌種HJY-002產(chǎn)乙酸乙酯的最佳工藝參數(shù)為:溫度25.5°C，培養(yǎng)時(shí)間60h，接種量5%和pH5.7，其乙酸乙酯含量達(dá)到16.95mg/100mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)菌種HJY-002，其特征在于所述釀酒酵母CGMCC No6979的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基是高粱汁培養(yǎng)基，該菌株酒精的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為:溫度30°C，培養(yǎng)時(shí)間73h，接種量3%和pH6.5，發(fā)酵液的酒精度為7.6%νο? ο`
【文檔編號(hào)】C12R1/865GK103789219SQ201310041825
【公開日】2014年5月14日 申請(qǐng)日期:2013年2月1日 優(yōu)先權(quán)日:2013年2月1日
【發(fā)明者】肖冬光, 劉彥龍, 李澤霞, 程宗志, 王慶宇 申請(qǐng)人:河北衡水老白干酒業(yè)股份有限公司