專利名稱：生物還原制備他汀側(cè)鏈6-氰基-(3r,5r)-二羥基己酸叔丁酯及菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一株具有反-PrelOg非對(duì)映體選擇性羰基還原酶活性的菌株——黏紅酵母(Rhodotorula glutinis) ZJB-09224,及其在生物不對(duì)稱還原制備光學(xué)純6-氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心血管疾病已成為對(duì)人類最具威脅的疾病之一，其發(fā)病率和死亡率均已超過惡性腫瘤而躍居第一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，全世界每年有3000多萬人死于心腦血管疾病，約占全部死亡人數(shù)的一半。中國(guó)每年因心腦血管疾病及并發(fā)癥死亡病例超過300萬。研究表明，血脂異常引發(fā)的大動(dòng)脈和中型動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的最主要病因。人體高血脂癥主要是極低密度脂蛋白(VLDL)和低密度脂蛋白(LDL)增多，臨床上血清膽固醇含量高于2.30g/L、甘油三酯高于1.40g/L統(tǒng)稱為高血脂癥。調(diào)節(jié)血液中脂蛋白的比例并維持在相對(duì)恒定的濃度，是預(yù)防和消除動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵。人體內(nèi)的膽固醇主要來自于肝臟內(nèi)源性生物合成，肝臟細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)中膽固醇合成途徑需要26步生物合成反應(yīng)，其中，3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A (HMG-COA)還原酶催化HMG-COA還原生成甲羥戊酸反應(yīng)是人體內(nèi)膽固醇合成的限速性步驟。他汀類藥物是HMG-COA還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，能強(qiáng)烈抑制人體內(nèi)膽固醇的合成。此外，他汀類藥物還能反饋性上調(diào)細(xì)胞表面低密度脂蛋白受體表達(dá)，促進(jìn)循環(huán)血液中極低密度脂蛋白膽固醇?xì)埩：偷兔芏戎鞍椎那宄?，最終降低血清中總膽固醇和低密度脂蛋白的水平，有效防止動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病的發(fā)生，產(chǎn)生較好的降血脂療效。全球開發(fā)和在研的他汀類藥物已有十多個(gè)品種。第一代他汀藥物包括辛伐他汀、普伐他汀、洛伐他汀，是一類結(jié)構(gòu)類似的真菌代謝物。 第二代他汀包括化學(xué)合成的外消旋氟伐他汀。第三代他汀是合成的光學(xué)純他汀藥物，如阿托伐他汀、瑞舒伐他汀和匹伐他汀。他汀類降脂藥占世界降脂藥物市場(chǎng)的85%以上份額，并仍具有提升空間。2003年，阿托伐他汀成為全球首個(gè)年銷售額超過百億美元的藥物，近年來的銷售額仍穩(wěn)居世界前列。國(guó)內(nèi)他汀類藥物市場(chǎng)前景廣闊。他汀類藥物往往都含有3，5-二羥基己酸酯側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)含有兩個(gè)手性中心，只有一種立體異構(gòu)體((3R，5R)-或者(3R，5S)- 二羥基己酸酯)具有HMG-COA還原酶抑制活性。由于各國(guó)藥監(jiān)部門要求藥物e.e.值大于99.5%，d.e.值大于99%，他汀類藥物的手性側(cè)鏈的光學(xué)純度將決定藥物的質(zhì)量。作為他汀類藥物的關(guān)鍵合成砌塊——6-氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯生產(chǎn)技術(shù)備受關(guān)注。廣泛采用的6-氰基-(3R，5R) - 二羥基己酸叔丁酯化學(xué)合成方法存在諸多缺陷，合成需要使用劇毒的三乙基硼和_85°C深冷條件，而且非對(duì)映誘導(dǎo)不充分，產(chǎn)物6-氰基_(3R，5R)- 二羥基己酸叔丁酯d.e.值低，該反應(yīng)形成的硼化物廢物處理需要經(jīng)過繁瑣的反復(fù)甲醇淬滅、真空蒸餾等。與化學(xué)合成方法相比，生物催化法制備6-氰基_(3R，5R)- 二羥基己酸叔丁酯具有許多不可比擬的潛在優(yōu)勢(shì)，包括反應(yīng)體選擇性高，反應(yīng)條件溫和，革除有毒溶劑使用等等。迄今為止，文獻(xiàn)報(bào)道的具有不對(duì)稱還原(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基_(3R，5R)- 二羥基己酸叔丁酯活性的微生物菌種有 Beauveria bassiana ATCC 7159、Hansenula nonfermentansCBS 5764、Saccharomyces cerevisiae, Pichia angusta NCYC 495、Pichia angusta NCYCR320、Pichia angusta NCYC R322、Pichia haplophila CBS 2028、Pichia pastoris BPCC260、Pichia pastoris BPCC 443、Pichia pastoris NCYC R321、Pichia membranefaciens、Pichia guilliermondi1、Candida humicola CBS 1897、Candida solani CBS 1908、Candida diddensiae ATCC 20213、Candida friedrichii ATCC 22970、Kluyveromycesdrosophilarum CBS 2105、Torulaspora hansenii ATCC 20220。目前，未見 Rhodotorulaglutinis具有(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯非對(duì)映選擇性(R)-羰基還原酶活性的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種從土壤中富集、篩選具有高立體選擇性羰基還原酶活性微生物菌
種-黏紅酵母(Rhodotorula glutinis) ZJB-09224,及其在生物不對(duì)稱還原(R)_6_氰
基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基_(3R，5R)- 二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一株具有反-Prelog非對(duì)映體選擇性羰基還原酶活性的黏紅酵母(Rhodotorulaglutinis) ZJB-09224，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼:430072，保藏編號(hào)為CCTCC No:M2012412,保藏日期為2012年10月18日。經(jīng)鑒定該菌株屬于紅酵母屬(Rhodotorula)的glutinis種，菌株編號(hào)為ZJB-09224，命名為Rhodotorula glutinis ZJB-09224。該菌株菌落形態(tài):菌落呈粉紅色，邊緣整齊，圓形，隆起，表面光滑，不透明(菌落照片見

圖1)。 生理生化特征:利用Vitek2微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)測(cè)定菌株ZJB-09224對(duì)46種鑒定試驗(yàn)的鑒定結(jié)果，經(jīng)Vitek2讀數(shù)儀分析代謝指紋，確定菌株ZJB-09224屬于紅酵母屬(Rhodotorula)的 gutinis 種，同源性 98% (詳見表 I)。表1:利用Vitek2微生物自動(dòng)鑒定系統(tǒng)分析菌種ZJB-09224結(jié)果
權(quán)利要求
1.一株具有反-Prelog非對(duì)映體選擇性羰基還原酶活性的黏紅酵母(Rhodotorulagutinis)ZJB-09224,保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼:430072，保藏編號(hào)為CCTCCNo:M 2012412，保藏日期為2012年10月18日。
2.如權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于該菌株的18SrDNA序列如下:TCCGTAGGTG AACCTGCGGA AGGATCATTA GTGAATATAGGACGTCCAAC TTAACTTGGA GTCCGAACTCTCACTTTCTAACCCTGTGCA CTTGTTTGGG ATAGTAACTC TCGCAAGAGAGCGAACTCCT ATTCACTTATAAACACAAAG TCTATGAATGTATTAAATTT TATAACAAAA TAAAACTTTC AACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCATCGAT GAAGAACGCA GCGAAATGCGATAAGTAATG TGAATTGCAG AATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGC ACCTTGCGCT CCATGGTATT CCGTGGAGCATGCCTGTTTG AGTGTCATGAATACTTCAAC CCTCCTCTTTCTTAATGATT GAAGAGGTGT TTGGTTTCTG AGCGCTGCTGGCCTTTACGGTCTAGCTCGT TCGTAATGCA TTAGCATCCGCAATCGAACT TCGGATTGAC TTGGCGTAATAGACTATTCGCTGAGGAATT CTAGTCTTCG GACTAGAGCC GGGTTGGGTTAAAGGAAGCT TCTAATCAGAATGTCTACAT TTTAAGATTAGATCTCAAAT CAGGTAGGAC TACCCGCTGA ACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。
3.如權(quán)利要求1所述的菌株在生物不對(duì)稱還原(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備6-氰基_(3R，5R)- 二羥基己酸叔丁酯中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述不對(duì)稱還原在？!17 8、25 351:下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株具有反-Prelog非對(duì)映體選擇性羰基還原酶活性的黏紅酵母(Rhodotorula glutinis)ZJB-09224，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)，郵政編碼430072，保藏編號(hào)為CCTCC NoM 2012412，保藏日期為2012年10月18日。利用該菌產(chǎn)生的羰基還原酶轉(zhuǎn)化(R)-6-氰基-5-羥基-3-羰基己酸叔丁酯制備光學(xué)純6-氰基-(3R,5R)-二羥基己酸叔丁酯，酶活為13.6U/L，d.e.值>90%，立體選擇性高，反應(yīng)條件溫和，環(huán)境友好。
文檔編號(hào)C12R1/645GK103146591SQ20131004161
公開日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2013年1月30日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月30日
發(fā)明者鄭裕國(guó), 王亞軍, 羅希, 盛駿楨, 沈寅初 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)