專利名稱：：一個簇毛麥二硫化物異構(gòu)酶基因及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一個簇毛麥二硫化物異構(gòu)酶基因及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：由專性寄生真菌小麥白粉病菌(BlumeriagraminisDCf.sp.tritici)引起的小麥白粉病是中國和世界上許多國家小麥生產(chǎn)中危害日趨嚴重的病害之一。從一葉期到衰老，植株都能被白粉菌侵染。早期的侵染可使分蘗減少，上部葉片和穗部晚期的侵染能嚴重減少籽粒產(chǎn)(20%-33%)。白粉病雖然能用殺菌劑防治，但必然增加人力、物力投入，而且還會引起環(huán)境污染等生態(tài)問題，因此培育和推廣抗病品種已被公認為是防治小麥白粉病最為經(jīng)濟、安全和有效的途徑，而抗病遺傳背景和抗病機理的研究則是制定抗病育種策略的重要依據(jù)。明確其抗病機制，克隆抗病相關(guān)基因，對于防治小麥病害、開展抗病育種改良具有重要理論指導(dǎo)意義。小麥抗病分子機制是目前小麥白粉病研究的熱點課題。白粉病病原菌與寄主小麥之間的互作關(guān)系十分復(fù)雜。分析病原菌-寄主互作過程中的基因表達情況，有助于發(fā)掘抗病基因和發(fā)現(xiàn)抗病通路，并進一步闡明抗病的分子機制。通過構(gòu)建受白粉病菌誘導(dǎo)表達的cDNA文庫、SSH文庫，利用雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)、芯片技術(shù)等，篩選出了可能與白粉病抗性相關(guān)的基因或蛋白，包括各種病程相關(guān)蛋白、絲氨酸-蘇氨酸激酶、ABC轉(zhuǎn)運蛋白等，也發(fā)現(xiàn)了水楊酸途徑、雙氧水途徑等信號通路與白粉病抗性關(guān)。二倍體簇毛麥是高抗白粉病的小麥遠緣物種，其抗病基因Pm21位于6V上，本實驗室前期研究表明Hv-CMPG與簇毛麥的白粉病相關(guān)，該基因是一個E3連接酶，參與泛素化過程降解結(jié)合目標底物蛋白。研究像Hv-CMPG這類E3連接酶的底物結(jié)合蛋白及信號傳導(dǎo)途徑是近年來的研究熱點。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，提供一種二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PD10本發(fā)明的另一目的是提供該基因的表達載體。本發(fā)明的又一目的是提供該基因和表達載體的應(yīng)用。本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI,來自二倍體簇毛麥(Haynaldiavillosa,VV,2n=14)，可以和白粉病抗性相關(guān)基因Hv-CMPG互作，其核苷酸序列為SEQIDN0.1。該受體蛋白激酶基因編碼的蛋白質(zhì)Ην-PDI，其氨基酸序列為SEQIDN0.2。含有所述的二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI的表達載體。所述的含有權(quán)利要求1所述的二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI的表達載體優(yōu)選以PBI220為出發(fā)載體，將權(quán)利要求1所述的HvPDI基因插入pBI220的BamH/和Kpnl酶切位點間所得。所述的二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。所述的含二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI的表達載體在構(gòu)建抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。本發(fā)明首次從簇毛麥中克隆得到了一個和白粉病抗性相關(guān)基因HvCMPG互作的二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI及其所編碼的蛋白質(zhì)Hv-PDI，為簇毛麥中首次報道。將其插入表達載體PBI220，得到的該基因的過量表達載體導(dǎo)入感病小麥品種中，可以提高感白粉病小麥品種對白粉病的抗性。Hv-PDI用于基因工程育種，將其導(dǎo)入易感白粉病小麥品種中，能夠提高小麥的白粉病抗性。有益效果:本發(fā)明利用酵母雙雜交技術(shù)，將Hv-CMPG作為誘餌，利用聚乙二醇-醋酸鋰轉(zhuǎn)化法，篩選受白粉菌誘導(dǎo)的簇毛麥酵母雙雜交cDNA文庫，得到Hv-CMPG的一個互作基因Hv-PDI，該基因是一個二硫化物異構(gòu)酶，在簇毛麥葉片中受白粉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達；將其插入表達載體PBI220，得到該基因的過量表達載體導(dǎo)入感病小麥品種中，可以提高感小麥白粉病品種對白粉病的抗性。因此，Hv-PDI可用于基因工程育種，特別是應(yīng)用于基因工程手段培育抗白粉病的小麥品種。圖1利用酵母雙雜交克隆Hv-CMPG的互作基因Hv-PDI上行為:SD-LT培養(yǎng)基下行為:SD-HLT培養(yǎng)基；從左至右分別為pGADT7+pGBKT7；pGBKT7:CMPG+pGADT7；pGADT7:PDI+pGBKT7；pGBKT7:CMPG+pGADT7:PDI。圖2Hv-PDI在二倍體簇毛麥白粉菌誘導(dǎo)后的葉片中的QRT-PCR分析上行:Hv-PDI在簇毛麥葉片受白粉菌誘導(dǎo)的不同時間的表達情況；中行:看家基因Tubulin在簇毛麥葉片受白粉菌誘導(dǎo)的不同時間的表達情況；下行:0h、30min、45min、lh、2h、6h、12h、24h、48h、72h分別表示簇毛麥葉片受白粉菌誘導(dǎo)的不同時間段圖3HV-PDI過量表達載體構(gòu)建。圖4與白粉菌互作的表達⑶S基因的表皮細胞a:白粉菌侵入表達⑶S的表皮細胞后未形成吸器；b:白粉菌侵入表達⑶S的表皮細胞后形成吸器Co:分生孢子；pp:侵入釘；ha:吸器；hy:菌絲圖5利用單細胞瞬間表達技術(shù)研究Hv-PDI在抗白粉病中的效應(yīng)具體實施例方式實施例1利用酵母雙雜交克隆簇毛麥二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI二倍體簇毛麥(參考文獻:齊莉莉，陳佩度，等，小麥白粉病新抗源一基因Pm21，作物學報，1995，21(3):257-262)是高抗白粉病的材料。Hv-CMPG是南京農(nóng)業(yè)大學細胞遺傳研究所克隆的一個位于二倍體簇毛麥6V上的白粉病抗性相關(guān)基因(劉圓.簇毛麥Hv-CMPG基因克隆及其功能初步分析[D].南京.南京農(nóng)業(yè)大學，2007)，以Hv-CMPG為誘餌，用聚乙二醇-醋酸鋰轉(zhuǎn)化法篩選酵母雙雜交cDNA文庫，得到一個Hv-CMPG的互作基因(附圖1)。對該互作基因測序，獲得了大小為1615bp的序列，序列如SEQIDN0.1所示。通過NCBI網(wǎng)站中的ORFfinder搜索該獲得序列的開放閱讀框，發(fā)現(xiàn)其包含一個全長ORF的基因，其中5，-UTR(非翻譯區(qū))81bp、3’-UTR211bp、0RF(開放閱讀框)1323bp，編碼440個氨基酸，序列如SEQIDN0.2所示，將該基因命名為Hv-PDI。實施例2HV-PDI基因受白粉菌誘導(dǎo)的表達特征把抗白粉病的簇毛麥種子(參考文獻:齊莉莉，陳佩度，等，小麥白粉病新抗源-基因Pm21，物學報，1995，21(3)=257-262)播于培養(yǎng)皿中發(fā)芽，露白后移栽到盆缽(周圍用圓柱狀透明塑料片隔離，頂端用濾紙封閉，形成無白粉菌的環(huán)境)。待三葉期，把在感病品種蘇麥三號上培養(yǎng)的南京本地混合白粉菌新鮮孢子輕輕抖落在簇毛麥的幼苗上。接種白粉菌后的簇毛麥葉片保存在16°C。接種后011、3011^11、451^11、111、211、611、1211、2411、4811、7211取樣，置于一70°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。用TRIZOL(InvitiOgen)提取受白粉菌誘導(dǎo)的簇毛麥葉片的RNA,利用AMV酶(Takara)合成反轉(zhuǎn)錄第一鏈,得到反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。應(yīng)用能特異擴增Hv-PDI的特異引物P1(CAAGTGGCAAAACCTCTGGT(SEQIDN0.3))和P2(TACAAAGCAAATGGCAGCAG(SEQIDN0.4))，對該基因在受白粉菌誘導(dǎo)樣品中進行半定量PCR(sQ-RT-PCR)分析。PCR反應(yīng)在PCR儀(PTC-200，Bio-Rad，USA)上擴增。10μIPCR反應(yīng)體系中含Iμ11XBuffer,1.5mmol/LMgC12,200mmol/LdNTP，0.2nmol/yI引物Pl和P2，0.5UTaqDNA聚合酶(rTaqTakaRa)，上述獲得的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物IμI。擴增參數(shù)為:95°〇3!^11，然后951:308、561:458，721:lmin，共26個循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)產(chǎn)物加2μIloadingbuffer后用I%的瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果表明，和看家基因(Tubulin)相比較，在簇毛麥葉片中Hv-PDI受白粉菌誘導(dǎo)上調(diào)表達，24h后表達水平達到峰值，之后開始下調(diào)。sQ-RT-PCR的結(jié)果表明，Hv-PDI可能與白粉病抗性相關(guān)(附圖2)。實施例3HV-PDI正義表達載體構(gòu)建利用上述經(jīng)白粉菌誘導(dǎo)后的簇毛麥cDNA為模板，以可擴增Hv-PDI基因蛋白編碼區(qū)的引物對P3(CGGGATCCATGCGTCCGGCCATCC(SEQIDN0.5))和P4(GGGGTACCTCACAACTCGTCGTTGGGC(SEQIDN0.6))進行PCR擴增，回收大小為1323bp擴增片段。將擴增片段插入PMDlS-T(Takara)中，經(jīng)測序后和原序列比對，為Hv-PDI基因，用BamHI和Kpnl雙酶切將擴增目標片斷插入到載體pBI220(JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.GUSfusions:beta-glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJ.1987,6:3901-3907.)的35S啟動子后面的多克隆位點BamHI和Kpnl之間。由此將目標基因Hv-PDI克隆到強啟動子35S的下游，經(jīng)測序后，和原序列比對無點突變，獲得表達載體PBI220=PDI(附圖3)。實施例4利用瞬間表達方法將Hv-PDI基因轉(zhuǎn)入小麥葉片白粉菌侵染感白粉病小麥葉片后大約24小時左右會在葉片表皮中形成吸器，吸器是吸收寄主養(yǎng)分供白粉菌菌絲生長的重要結(jié)構(gòu)。白粉菌侵染后如果能在葉片表皮細胞中形成吸器一般認為是寄主-病原菌發(fā)生了親和反應(yīng)，即葉片產(chǎn)生的是感病反應(yīng)；如果不能在葉片表皮細胞中形成吸器一般認為是寄主-病原菌發(fā)生了非親和反應(yīng)，即葉片產(chǎn)生了抗病反應(yīng)。吸器指數(shù)，即與病原菌互作的細胞中有吸器形成的細胞比例，是衡量寄主抗病性的一個重要指標。瞬間表達方法是一種可靠且快速鑒定基因功能的方法(參考文獻:Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheat.MolecularPlant-MicrobeInteractions.1999，12:647-654.)，可將質(zhì)粒DNA包裹到金屬微粒外層，借助基因槍將金屬微粒轟擊到小麥葉片的表皮細胞，載體上攜帶的目的基因在葉片細胞中超量表達。本研究將Hv-PDI構(gòu)建到超量表達載體中pBI220:H)I，通過瞬間表達方法將pBI220:PDI和⑶S基因所在載體pAHC25(ChristensenAH,QuailPH.Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicResearch,1996,5:213-218.)進行共轉(zhuǎn)化，以⑶S基因標記Hv-PDI基因表達的細胞，通過比較轟擊Hv-PDI細胞的白粉菌吸器指數(shù)與未轟擊Hv-PDI細胞的白粉菌吸器指數(shù)，明確目標基因是否具有白粉病抗病功能。具體操作步驟如下:載體DNA與金屬微粒包裹的程序:1、制備鎢粉:(I)稱取30mg的鎢粉于1.5ml印pendorf管中，加入lml70%酒精，渦旋3_5min后靜置15min，使鎢粉完全沉淀。(2)12000rpm離心Imin后棄上清。(3)向沉淀中加入ImlddH20水,潤旋混勻后，12000rpm離心棄上清(重復(fù)三次)。(4)向沉淀中加入500μI甘油(V/V，50%)渦旋混勻，以備用。2、包裹子彈:(I)吸取5μI潤旋均勻的鶴粉于1.5ml的eppendorf管中，加入5μI質(zhì)粒DNA(0.2μg/μI的濃度)，邊渦旋邊向印pendorf管內(nèi)滴加50μICaCl2(2.5Μ)，然后加入20μI亞精氨(0.1Μ，現(xiàn)配先用)，渦旋3min。(2)靜置Imin后離心2s，棄上清，向沉淀中加入140μI酒精(V/V，70%)，充分渦旋，離心2s，棄上清。(2)加入140μI無水酒精，充分渦旋，離心2s，棄上清。向沉淀中加入15μI無水酒精，充分渦旋，以備使用?；驑屴Z擊程序如下:剪下長約6cm的小麥幼苗葉片端部，平行貼在載玻片上，每張玻片貼6片葉片左右?；驑屖褂胷oSlOOO/He系統(tǒng)，采用1350psi的可裂膜片，真空度為28inHg。轟擊后將葉片置于墊有潤濕濾紙的瓷盤內(nèi)，罩以打有小孔的保鮮膜，保濕并透氣，18-20°C恢復(fù)培養(yǎng)4h后，高密度接種白粉菌分生孢子。接種48h后用⑶S染液[配方為:0.1MNa2HP04/NaH2P04緩沖液(PH7.0)，含IOmMEDTA,5mM鐵氰化鉀和亞鐵氰化鉀，0.lmg/mlX-Gluc,0.1%TritonX-100，20%甲醇]真空滲透10min，37°C染色12h，然后用70%酒精脫色2天直至葉片漂白后，用考馬斯亮藍(W/V，0.6%)對白粉菌孢子染色。實施⑶S基因單轉(zhuǎn)化時，將含有⑶S基因表達載體PAHC25的質(zhì)粒DNA與鎢粉包裹；當實施Hv-PDI與⑶S基因共轉(zhuǎn)化時，將含有Hv-PDI基因表達載體pBI220:PDI的質(zhì)粒DNA與含有⑶S基因表達載體PAHC25的質(zhì)粒DNA按摩爾濃度1:1的比例混合包裹鎢粉。當GUS基因與Hv-PDI基因進行共轉(zhuǎn)化時，標記基因⑶S轉(zhuǎn)入的染色呈現(xiàn)藍色的細胞即為Hv-PDI轉(zhuǎn)入的細胞。實施例5HV-PDI的抗病功能分析在⑶S表達的細胞中，指狀吸器會被⑶S染色液染成藍色，在顯微鏡下容易辨認。在GUS基因轉(zhuǎn)化細胞后，通過統(tǒng)計與白粉菌互作的GUS表達細胞中，吸器形成的細胞所占的比例(％)，即為“吸器指數(shù)”(參考文獻:Schweizer,Pokornyetal.ATransientAssaySystemfortheFunctionalAssessmentofDefense-RelatedGenesinWheatMolecularPlant-MicrobeInteractions.1999,12:647-654)。吸器指數(shù)越小，表明形成吸器的細胞比例越低，葉片的抗病性越強。本研究利用“吸器指數(shù)”作為抗病強弱的衡量指標。當單轉(zhuǎn)化GUS基因時，感白粉病小麥品種揚麥158中的吸器指數(shù)為63.28%(統(tǒng)計了897個細胞)。當⑶S基因與Hv-PDI共轉(zhuǎn)化感白粉病小麥品種揚麥158后，統(tǒng)計了⑶S基因表達(即Hv-PDI表達)且有白粉菌互作的細胞的吸器指數(shù)，結(jié)果表明當Hv-PDI轉(zhuǎn)入后，揚麥158的吸器指數(shù)從63.28%降到37.55%(統(tǒng)計了1055個細胞)。該結(jié)果說明，Hv-PDI能顯著的降低吸器指數(shù)，其瞬間表達可以提高對白粉菌的抗性。權(quán)利要求1.一個簇毛麥二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI，其特征在于其核苷酸序列為SEQIDN0.1。2.權(quán)利要求1所述二硫化物異構(gòu)酶基因的蛋白質(zhì)Hv-PDI，其特征在于其氨基酸序列為SEQIDN0.2。3.含有權(quán)利要求1所述的二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI的表達載體。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的表達載體，其特征在于所述的二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI的表達載體是以PBI220為出發(fā)載體，將權(quán)利要求1所述的Hv-PDI基因插入pBI220的BamHI和KpnI酶切位點間所得。5.權(quán)利要求1所述的二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI在培育抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。6.權(quán)利要求3或4所述的含二硫化物異構(gòu)酶基因Hv-PDI的表達載體在培育抗白粉病小麥品種中的應(yīng)用。`全文摘要本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，公開了一個簇毛麥二硫化物異構(gòu)酶基因及其應(yīng)用。Hv-PDI的cDNA序列為SEQIDNO.1及其編碼的氨基酸序列為SEQIDNO.2。該基因來自二倍體簇毛麥(Haynaldiavillosa,VV,2n=14)，在抗白粉病二倍體簇毛麥中受白粉菌誘導(dǎo)表達增強。通過瞬間表達將該基因轉(zhuǎn)化感病小麥品種揚麥158，結(jié)果表明Hv-PDI的過量表達可以降低揚麥158的吸器指數(shù)。因此，Hv-PDI可望用于基因工程育種，將其導(dǎo)入易感白粉病小麥品種中，有望提高小麥的白粉病抗性。文檔編號C12N9/90GK103103208SQ20131004150公開日2013年5月15日申請日期2013年2月1日優(yōu)先權(quán)日2013年2月1日發(fā)明者王秀娥,李穎波,曹愛忠,王海燕,邢莉萍,祝燕飛,王慰,費菲申請人:南京農(nóng)業(yè)大學