人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量的一種檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量的一種檢測(cè)方法。主要步驟包括：根據(jù)淋巴細(xì)胞gdf15基因表達(dá)序列設(shè)計(jì)引物和Taqman-MGB探針，構(gòu)建含有淋巴細(xì)胞gdf15基因表達(dá)序列的重組載體作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；以10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，繪制絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；對(duì)接受不同劑量電離輻射后不同培養(yǎng)時(shí)間淋巴細(xì)胞gdf15基因的表達(dá)水平定量測(cè)定，獲得輻射劑量和gdf15基因表達(dá)水平的擬合劑量效應(yīng)曲線；對(duì)待測(cè)輻射劑量的人外周血淋巴細(xì)胞gdf15基因的表達(dá)水平定量測(cè)定，計(jì)算待測(cè)淋巴細(xì)胞所受的電離輻射劑量。本發(fā)明能夠快速定量檢測(cè)人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量，達(dá)到簡(jiǎn)便，快速定量，高通量的要求，在遇到大規(guī)模輻照事故時(shí)，可以凸顯其優(yōu)勢(shì)。
【專利說(shuō)明】人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量的一種檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于輻射生物劑量估算領(lǐng)域，具體涉及人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量的檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002]電離輻射對(duì)機(jī)體的損傷是通過(guò)原發(fā)作用的直接和間接作用，引起生物分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的變化，由分子水平的損傷進(jìn)一步造成了細(xì)胞水平、器官水平和整體水平的損傷，出現(xiàn)相應(yīng)生化代謝紊亂并由此產(chǎn)生一系列表現(xiàn)或造成死亡和產(chǎn)生某些遠(yuǎn)后效應(yīng)。
[0003]在核戰(zhàn)爭(zhēng)和核或放射事故中，大量受照人群的分選和急救是搶救可治愈人群(IOGy以下)的關(guān)鍵，而成功的救助需要快速、準(zhǔn)確的估算受照劑量。目前估算劑量的方法很多，包括物理的和生物的方法。生物學(xué)方法具有其優(yōu)越性，輻射生物劑量計(jì)在核事故受害者受照劑量估算及輻射生物學(xué)效應(yīng)研究中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。理想的電離輻射生物劑量計(jì)應(yīng)具備的特點(diǎn)包括:①具有電離輻射可誘導(dǎo)性，特異良好的量-效關(guān)系；②確定的劑量和時(shí)間響應(yīng)范圍遺傳背景穩(wěn)定，本底變異較低；④影響、干擾因素明確且可控制；⑤采樣方便，分析方法簡(jiǎn)單、迅速、可靠，易于自動(dòng)化大通量操作；⑥經(jīng)濟(jì)成本和社會(huì)成本低等特點(diǎn)。
[0004]目前常用的生物劑量計(jì)有早熟凝聚染色體片段分析、微核分析、穩(wěn)定染色體畸變分析、體細(xì)胞基因位點(diǎn)突變分析等。但這些技術(shù)相對(duì)復(fù)雜，需要良好的專業(yè)知識(shí)和訓(xùn)練后才能夠順利開展，而且在大量人群受到照射的情況下不能滿足高通量檢測(cè)、生物輻射劑量快速定量檢測(cè)的需求。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種快`速定量、高通量估算人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量的檢測(cè)方法。
[0006]本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的:
[0007]人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量的一種檢測(cè)方法，包括如下步驟:
[0008](I)、根據(jù)淋巴細(xì)胞gdf 15基因表達(dá)序列設(shè)計(jì)引物和Taqman-MGB探針，構(gòu)建含有淋巴細(xì)胞gdf 15基因表達(dá)序列的重組載體作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；
[0009](2)、以步驟(1)所述引物和Taqman-MGB探針對(duì)10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，繪制絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線；
[0010](3)、將正常人外周血中分離的淋巴細(xì)胞分組接受不同劑量的電離輻射，按照步驟
(2)所述實(shí)時(shí)熒光PCR的方法對(duì)輻射后不同培養(yǎng)時(shí)間淋巴細(xì)胞gdf 15基因的表達(dá)水平定量測(cè)定，獲得輻射劑量和gdf 15基因表達(dá)水平的擬合劑量效應(yīng)曲線；
[0011](4)、按照步驟(2)所述實(shí)時(shí)熒光PCR的方法對(duì)待測(cè)輻射劑量的人外周血淋巴細(xì)胞gdfl5基因的表達(dá)水平定量測(cè)定，根據(jù)步驟(3)所述的擬合劑量效應(yīng)曲線計(jì)算待測(cè)淋巴細(xì)胞所受的電離輻射劑量。[0012]上述技術(shù)方案中，步驟⑴所述的淋巴細(xì)胞gdfl5基因表達(dá)序列如SEQ ID NO:1 ；所述引物的上游引物如SEQ ID NO:2，下游引物如SEQ IDNO:3 ;Taqman_MGB探針序列如SEQID NO:4，探針的熒光基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為NFQ。
[0013]本發(fā)明提供的人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量的檢測(cè)方法，是根據(jù)人外周血淋巴細(xì)胞gdfl5基因表達(dá)序列設(shè)計(jì)引物及TaqMan-MGB探針，以構(gòu)建的含有淋巴細(xì)胞gdfl5基因表達(dá)序列的重組載體10倍系列稀釋作為標(biāo)準(zhǔn)品模板，在熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，斜率為-3.5345，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.999，呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系，擴(kuò)增效率為99.7%。靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明，PCR反應(yīng)31個(gè)循環(huán)時(shí)可以檢測(cè)到的質(zhì)粒最小濃度是50拷貝數(shù)/ μ L，選用50、500、5000、50000和500000拷貝數(shù)/ μ L5個(gè)濃度梯度質(zhì)粒做模板，變異系數(shù)在1.2% -3.2%范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化TaqMan-MGB探針熒光定量PCR反應(yīng)條件和反應(yīng)體系，能夠快速定量檢測(cè)人外周血淋巴細(xì)胞gdf 15基因在接受電離輻射時(shí)的表達(dá)水平變化，與現(xiàn)有的輻射后早熟凝聚染色體片段分析、微核分析、穩(wěn)定染色體畸變分析、體細(xì)胞基因位點(diǎn)突變分析等方法相比，可以大大的節(jié)省時(shí)間，達(dá)到簡(jiǎn)便，快速定量，高通量的要求，在遇到大規(guī)模輻照事故時(shí)，可以凸顯其優(yōu)勢(shì)。
【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重組pUC57質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。
[0015]圖2為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重組PUC57質(zhì)粒瓊脂凝膠電泳圖。
[0016]圖3為10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線。橫坐標(biāo)表示基因拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示Ct值。
[0017]圖4為輻射后淋巴 細(xì)胞培養(yǎng)4、8、12、24和48小時(shí)的擬合劑量效應(yīng)曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0018]以下通過(guò)實(shí)施例詳細(xì)描述本發(fā)明提供的檢測(cè)人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量的方法。下面實(shí)施例中所涉及的生物技術(shù)沒有特別描述之處均采用細(xì)胞遺傳學(xué)常規(guī)技術(shù)，如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中提供的常規(guī)技術(shù)方法。
[0019]實(shí)施例1:TaqMan_MGB探針及引物對(duì)設(shè)計(jì)
[0020]I)、根據(jù)淋巴細(xì)胞gdfl5基因表達(dá)序列設(shè)計(jì)上下游引物和探針序列。
[0021]發(fā)明人利用基因芯片技術(shù)對(duì)0.5、3和SGy三個(gè)劑量組的45200個(gè)基因進(jìn)行差異表達(dá)篩選，其中淋巴細(xì)胞gdf 15正調(diào)控基因的劑量變化趨勢(shì)明顯，對(duì)gdf 15基因外周血水平的表達(dá)變化進(jìn)行探索具有重要的實(shí)用價(jià)值，更接近于應(yīng)用。
[0022]淋巴細(xì)胞gdf 15基因表達(dá)序列SEQ ID NO:1為:
[0023]GACTTGTTAGCCAAAGACTGCCACTGCATATGAGCAGTCCTGGTCCTTCCACTGTGCACCTGCGCGGAGGACGCGACCTCAGTTGTCCTGCCCTGTGGAATGGGCTCAAGGTTCCT。
[0024]上游引物SEQ ID NO:2 為:5’ -GTTAGCCAAAGACTGCCACTG-3’。
[0025]下游引物SEQ ID NO:3 為:5’ -CCTTGAGCCCATTCCACA-3’。
[0026]探針核苷酸序列SEQ ID NO:4 為:CCGCGCAGGTGCACAG。
[0027]實(shí)施例2:標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重組pUC57質(zhì)粒的構(gòu)建
[0028]I)、常規(guī)方法從人外周血中分離單個(gè)淋巴細(xì)胞；[0029]2)、常規(guī)方法提取單個(gè)淋巴細(xì)胞的RNA，并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA ；
[0030]3)、特異性引物PCR擴(kuò)增淋巴細(xì)胞gdfl5基因；
[0031]4)、PCR產(chǎn)物純化后，按照?qǐng)D1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重組PUC57質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖，將PCR產(chǎn)物連接到PUC57質(zhì)粒(上海生工公司提供)，構(gòu)建重組pUC57質(zhì)粒，圖2為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重組pUC57質(zhì)粒瓊脂凝膠電泳圖。
[0032]5)、重組pUC57質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證，結(jié)果為淋巴細(xì)胞gdf 15基因表達(dá)序列SEQ ID NO:1正確插入pUC57質(zhì)粒中。
[0033]實(shí)施例3:標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備
[0034]1)、標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重組pUC57質(zhì)粒10倍系列稀釋。利用NanoDrop 2000紫外分光光度儀測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重組PUC57質(zhì)粒的濃度，分別將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用雙蒸水稀釋到108拷貝/μ I。在5個(gè)0.5ml的離心管中分別加入9μ I雙蒸水，吸取1 μ 1108拷貝/ μ I的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，加入9μ1雙蒸水中充分混勻，再依次進(jìn)行梯度稀釋，將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)分別稀釋成107、106、IO5UO4和103拷貝/ μ 1，以備96孔板上樣時(shí)使用。
[0035]2)、以10倍稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)重組PUC57質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR。
[0036]實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀器為美國(guó)ABI公司的7500fast Real Time PCR測(cè)量?jī)x，優(yōu)化后的反應(yīng)體系為20 μ 1，其中IOylMaster Mix (美國(guó)ABI公司提供，內(nèi)含buffer，dNTP，Taq DNA聚合酶)，2 μ I標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)模板，7 μ I雙蒸水和1μ I Taqman探針及引物對(duì)(引物最終工作濃度為900ηπιο1/μ 1，探針最終工作濃度為250ηmο1/μ I)。反應(yīng)條件:95°C預(yù)變性10分鐘(min)后進(jìn)行下述40個(gè)循環(huán):95°C變性15秒(s)，60°C退火和延伸共lmin。每個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)平行樣復(fù)孔；另外，每塊96孔板上樣時(shí)都要設(shè)立三個(gè)無(wú)cDNA模板的空白對(duì)照。Taqman-MGB探針(美國(guó)ABI公司提供)的熒光基團(tuán)為FAM，淬滅基團(tuán)為NFQ。
[0037]通過(guò)對(duì)各個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)測(cè)定的Ct值及樣品拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值繪制定量的標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖3為10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)表示基因拷貝數(shù)對(duì)數(shù)值，縱坐標(biāo)表示Ct值，斜率為-3.5345，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.999，呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系(y=-3.5345X+42.495)，擴(kuò)增效率為99.7%。靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明，PCR反應(yīng)31個(gè)循環(huán)時(shí)可以檢測(cè)到的質(zhì)粒最小濃度是50拷貝數(shù)/ μ L，選用50、500、5000、50000和500000拷貝數(shù)/μ L 5個(gè)濃度梯度質(zhì)粒做模板，變異系數(shù)在1.2% -3.2%范圍內(nèi)，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。
[0038]實(shí)施例4:獲得輻射劑量和人外周血淋巴細(xì)胞gdfl5基因表達(dá)水平的擬合劑量效應(yīng)曲線
[0039]1)人群外周血淋巴細(xì)胞gdfl5基因本底表達(dá)水平分析。
[0040]選取73名志愿者，其中男性39名，女性34名，年齡分布為20_60歲。分析步驟如下:采集志愿者血樣4ml，用實(shí)驗(yàn)室常規(guī)方法(如《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》)分離外周血淋巴細(xì)胞，提取總RNA，進(jìn)行cDNA鏈的合成。以cDNA為模板按照實(shí)施例3提供的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件測(cè)定人群外周血淋巴細(xì)胞gdf 15基因本底表達(dá)拷貝數(shù)。本底水平測(cè)量的結(jié)果顯示，不同性別(如表1)和不同年齡組(如表2) gdf 15基因本底表達(dá)水平?jīng)]有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，雙側(cè)檢驗(yàn)P < 0.05)，測(cè)量結(jié)果如表1和表2。
[0041]表1.不同性別組間gdfl5基因mRNA本底表達(dá)水平
【權(quán)利要求】
1.人外周血淋巴細(xì)胞所受電離輻射劑量的一種檢測(cè)方法，其特征包括如下步驟: (1)、根據(jù)淋巴細(xì)胞gdf15基因表達(dá)序列設(shè)計(jì)引物和Taqman-MGB探針，構(gòu)建含有淋巴細(xì)胞gdfl5基因表達(dá)序列的重組載體作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)； (2)、以步驟(1)所述引物和Taqman-MGB探針對(duì)10倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR，繪制絕對(duì)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線； (3)、將正常人外周血中分離的淋巴細(xì)胞分組接受不同劑量的電離輻射，按照步驟(2)所述實(shí)時(shí)熒光PCR的方法對(duì)輻射后不同培養(yǎng)時(shí)間淋巴細(xì)胞gdf 15基因的表達(dá)水平定量測(cè)定，獲得輻射劑量和gdf 15基因表達(dá)水平的擬合劑量效應(yīng)曲線； (4)、按照步驟(2)所述實(shí)時(shí)熒光PCR的方法對(duì)待測(cè)輻射劑量的人外周血淋巴細(xì)胞gdfl5基因的表達(dá)水平定量測(cè)定，根據(jù)步驟(3)所述的擬合劑量效應(yīng)曲線計(jì)算待測(cè)淋巴細(xì)胞所受的電離輻射劑量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述的淋巴細(xì)胞gdf15基因表達(dá)序列如SEQ ID NO:1所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述引物的上游引物如SEQIDNO:2，下游引物如SEQ ID NO:30
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述Taqman-MGB探針含有如SEQID NO:4所不的喊基序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)所述Taqman-MGB探針熒光基團(tuán)為FAM，淬滅 基團(tuán)為NFQ。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103805683SQ201210444265
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月9日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月9日
【發(fā)明者】劉青杰, 張慶召, 張德欽, 高玲, 封江彬 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所