蝦蟹螺原體病原的原位雜交檢測探針及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種蝦蟹病原螺原體的原位雜交檢測探針及試劑盒。所述探針的序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。所述兩條寡核苷酸探針用地高辛標(biāo)記，與蝦蟹組織切片中螺原體16SrDNA雜交結(jié)合后通過免疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)擴(kuò)大信號(hào)，然后經(jīng)酶反應(yīng)顯色；能直觀地將病原檢測與其病理變化結(jié)合起來；在高效、準(zhǔn)確檢測螺原體的同時(shí)，可由樣本切片上分析感染率和感染強(qiáng)度；由于探針與16SrDNA的雜交是特異的，且信號(hào)經(jīng)過了逐級(jí)放大，所以較常規(guī)的染色觀察檢測靈敏、精確；而且檢測結(jié)果雜交顯色后的切片可長期保存。
【專利說明】蝦蟹螺原體病原的原位雜交檢測探針及試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種蝦蟹螺原體病原的原位雜交檢測探針及檢測用試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)俗稱河蟹,是我國特有的水產(chǎn)養(yǎng)殖珍品，但隨著養(yǎng)殖集約化和規(guī)模化發(fā)展，各種病害已經(jīng)成為危害養(yǎng)蟹業(yè)的重要難題。在河蟹眾多疾病中，“顫抖病”最為常見、危害也最嚴(yán)重，該病自1994年首次在江蘇被發(fā)現(xiàn)后，相繼在上海、浙江、安徽、江西等地暴發(fā)，并呈逐年加劇趨勢，后來幾乎蔓延到全國各河蟹養(yǎng)殖地區(qū)。2008年農(nóng)業(yè)部已將該病列為新修訂的“一二三類動(dòng)物疫病病種名錄”中?？耸显x下(Procambarus clarkii),俗稱小龍奸,是另一種非常有潛力的淡水養(yǎng)殖品種，江蘇、湖北、安徽等地均將其列為重點(diǎn)推薦養(yǎng)殖品種，發(fā)展非常迅速，而蝦蟹混養(yǎng)則為當(dāng)前的主要養(yǎng)殖模式之一。研究發(fā)現(xiàn)，在暴發(fā)“顫抖病”的蝦蟹混養(yǎng)的池塘中，伴隨著中華絨螯蟹的大量死亡，克氏原螯奸也連續(xù)出現(xiàn)大規(guī)模死亡，經(jīng)查明螺原體(spiroplasma)是引起它發(fā)病的病原[1]，此外，其他水產(chǎn)養(yǎng)殖甲殼動(dòng)物如南美白對(duì)蝦[I]、羅氏沼蝦也相繼發(fā)現(xiàn)了螺原體病原[2]，由此可見，螺原體病原已經(jīng)成為當(dāng)前蝦蟹重要的新型病原。目前超薄切片電子顯微鏡觀察是使用較多的檢測方法，但該方法對(duì)操作技術(shù)與儀器設(shè)備要求較高，且實(shí)驗(yàn)周期長，較難普及；PCR也是另一種常用的檢測方法[3]，該方法雖然檢測較為簡單，靈敏度高，但不能直觀的觀察和證明螺原體的包涵體，而且易于因操作中的模版污染而出現(xiàn)假陽性。原位雜交假陽性率低，從直觀性、準(zhǔn)確性和靈敏度綜合考慮是一種其它任何方法都無法替代的檢測方法，但至今未見有關(guān)水產(chǎn)螺原體病原的原位雜交檢測方法。(參考文獻(xiàn):[l]Wang, W, Gu, W, Ding, Z, et al.A novel Spiroplasma pathogen causingsystemic infection in the crayfish Procambarus clarkii (Crustacea:Decapod), inChina[J].FEMS microbiology letters,2005, 249, 131-137;[2]Liang T, Li X,Du Jie, etal.1dentification and isolation of a spiroplasma pathogen from diseasedfreshwater prawns,Macrobrachium rosenbergii, in China:A new freshwatercrustacean host.Aquaculture 2011, 318:1-6, 2011.[3]Ding, Z, Bi, K, ffu, T, et al.Asimple PCR method for the detection of pathogenic spiroplasmas in crustaceansand environmental samples[J].Aquaculture, 2007，265，49-54.X

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于提供一種用于高靈敏度、高可信度同時(shí)又非常直觀的蝦蟹螺原體病原的早期檢測的探針，并提供檢測試劑盒。
[0004]本發(fā)明根據(jù)螺原體在細(xì)菌分類學(xué)上具有保守功能的16S rDNA序列中的兩段特有的DNA序列設(shè)計(jì)合成了兩條寡核苷酸探針，建立了螺原體病原的原位雜交檢測方法，該探針與健康克氏原螯蝦及患白斑綜合征病毒病(WSSV)的克氏原螯蝦樣品均無特異性信號(hào)，而與螺原體感染陽性樣品有明顯的深棕色信號(hào)，具有很好的特異性，且能直觀地將檢測到的病原螺原體與其引起的病理變化結(jié)合起來，從而確定該病原的感染部位、感染程度，了解其致病力。該方法具有優(yōu)異的直觀性、準(zhǔn)確度和靈敏度，實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明的目的。
[0005]本發(fā)明所述的兩條螺原體病原的原位雜交檢測探針，其序列如下
[0006](I) 5’-GTTCTTCCCTTACAACAGACCTTTACAATCCGA-3’ (SEQ ID N0.1)
[0007](2) 5’-GTACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACTAGGGT-3’(SEQ ID N0.2)。
[0008]本發(fā)明提供了一種蝦蟹病原螺原體的原位雜交檢測方法，其技術(shù)方案包括如下步驟:
[0009](I)用地高辛標(biāo)記的特異的探針與組織切片中螺原體16S rDNA雜交結(jié)合；
[0010](2)進(jìn)行原位雜交檢測:
[0011]a.所述的地高辛標(biāo)記的探針結(jié)合生物素化鼠抗地高辛，再結(jié)合鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，最后再結(jié)合生物素化過氧化物酶；
[0012]b.經(jīng)酶反應(yīng)顯色；
[0013]所述的特異的探針是根據(jù)螺原體在細(xì)菌分類學(xué)上具有保守功能的16S rDNA序列中的兩段特有的DNA序列設(shè)計(jì)合成的兩條寡核苷酸探針，合成后于每一探針的3’末端標(biāo)記地高辛；所述的兩條 寡核苷酸探針的序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
[0014]蝦蟹組織樣品和通常的原位雜交檢測一樣需要固定、切片、滅活樣品內(nèi)源性的過氧化物酶和消化蛋白以暴露DNA等處理，可以采用通常的方法；用地高辛標(biāo)記的探針可以采用免疫學(xué)的抗原抗體反應(yīng)擴(kuò)大反應(yīng)信號(hào)、二甲基聯(lián)苯胺(DAB)酶反應(yīng)顯色，本發(fā)明在這方面有一定改進(jìn)。
[0015]本發(fā)明提供一種用于蝦蟹病原螺原體的原位雜交檢測方法的試劑盒，該試劑盒包括上述特異探針和原位雜交試劑。
[0016]所述的原位雜交試劑包括:DAB顯色試劑盒，博士德公司，武漢；多聚賴氨酸，Sigma,美國；焦碳酸二乙酯(DEPC), Sigma,美國；多聚甲醒干粉，Sigma,美國；梓檬酸三鈉，Sigma,美國；氯化鈉，Sigma,美國。
[0017]有益效果:
[0018](I)能直觀地將螺原體病原與其引起的病理變化結(jié)合起來；
[0019](2)在高效、準(zhǔn)確檢測螺原體的同時(shí)可根據(jù)樣本切片分析感染率和感染強(qiáng)度，這是其它分子生物學(xué)檢測方法所不具有的特點(diǎn)；
[0020](3)由于探針與16S rDNA的雜交是特異的，且信號(hào)經(jīng)過了逐級(jí)放大，所以較常規(guī)的染色檢測靈敏、精確；
[0021](4)本發(fā)明中，顯色后的切片可以長期保存。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1，健康克氏原螯蝦陰性對(duì)照；
[0023]圖2，患白斑綜合征病毒病(WSSV)克氏原螯蝦陰性對(duì)照；
[0024]圖3，感染螺原體克氏原螯蝦原位雜交檢測結(jié)果，箭頭示深棕色包涵體(X 1000)。
【具體實(shí)施方式】
[0025]下列實(shí)驗(yàn)及操作實(shí)例是進(jìn)一步對(duì)本發(fā)明的說明，不應(yīng)該當(dāng)作對(duì)本發(fā)明的限制。[0026]實(shí)施例1:
[0027]克氏原螯蝦樣品
[0028]發(fā)病克氏原螯蝦于2011年7-9月取自江蘇省內(nèi)發(fā)生嚴(yán)重死亡的養(yǎng)殖場，平均重量21.7g，頭胸甲長42.5mm (樣本量n=30)。健康克氏原螯蝦于2011年7月，取自南京克氏原螯蝦養(yǎng)殖場，平均重量20.lg，頭胸甲長41.0mm (樣本量n=24)。
[0029]健康克氏原螯蝦通過常規(guī)光鏡、電鏡觀察和PCR檢測，確定是無螺原體感染，作為陰性對(duì)照；感染白斑綜合征病毒病(WSSV)的克氏原螯蝦同時(shí)作為陰性對(duì)照；發(fā)病克氏原螯蝦經(jīng)光鏡、電鏡觀察和PCR檢測確定是有螺原體感染后，作為陽性對(duì)照。使用的原位雜交主要試劑、材料:
[0030](1) DAB顯色試劑盒,博士德公司，武漢
[0031](2)多聚賴氨酸，Sigma,美國
[0032](3)焦碳酸二乙酯(DEPC)，Sigma，美國
[0033](4)原位雜交專用蓋玻片，Sigma，美國
[0034](5)含DEPC的多聚甲醛固定液:1000mL蒸餾水中加Na2HPO4.12H20 36g，多聚甲醛干粉40g，加熱攪拌溶解后加NaH2PO4.2H20 3g，pH 7.0 ;趁熱加DEPC至終濃度0.1% ；
[0035](6)含DEPC的1%多聚賴氨酸:取多聚賴氨酸稀釋成1%，加DEPC至終濃度0.1% ；
[0036](7)載玻片用前需泡于1%多聚賴氨酸中5分鐘后晾干，4°C保存?zhèn)溆茫?br> [0037](8)2X檸檬酸三鈉-NaCl緩沖液(SSC):1OOOmL蒸餾水中加氯化鈉17.6g，檸檬酸三鈉8.8g ；
[0038](9)0.5XSSC:300mL 蒸餾水加 IOOmL 2X SSC ；
[0039](10)0.2XSSC:270mL 蒸餾水加 30mL 2 X SSC
[0040]樣品固定及切片制備:
[0041](1)取克氏原螯蝦易感染組織鰓于含0.P/oDEPC的4%多聚甲醛固定2小時(shí)后，用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，每次30分鐘，然后脫水、透明、石蠟包埋、切片；
[0042](2)切片(需同時(shí)做陽性和陰性對(duì)照)，經(jīng)常規(guī)石蠟脫水后，加3%的H2O2室溫處理10分鐘，然后用蒸餾水洗滌2次。
[0043]合成特異探針:
[0044]根據(jù)螺原體在細(xì)菌分類學(xué)上具有保守功能的16S rDNA序列(AY920929.1)中的兩段特有的DNA序列(對(duì)應(yīng)的堿基區(qū)域分別為228 - 260,600-632)設(shè)計(jì)合成的兩條寡核苷酸探針，合成后于每一探針的3’末端標(biāo)記地高辛，探針序列為:
[0045](1) 5’-GTTCTTCCCTTACAACAGACCTTTACAATCCGA-3’ (SEQ ID N0.1)
[0046](2) 5’-GTACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACTAGGGT-3’ (SEQ ID N0.2)
[0047]原位雜交:
[0048](1) 1mL 3%的檸檬酸加2滴濃縮的胃蛋白酶，混勻，滴加于切片，37°C消化蛋白10分鐘，然后用0.5mol/L磷酸鹽緩沖液洗3次，每次5分鐘，再用蒸餾水洗I次；
[0049](2)預(yù)雜交:在干的雜交盒底部加20%甘油20mL以保持濕度，按每張20 μ L加雜交液，恒溫箱38°C預(yù)雜交lh，吸取多余液體，不洗；
[0050](3)雜交:用雜交液稀釋地高辛標(biāo)記的探針，濃度為每條探針0.5μ g/mL，每張切片加20 μ L雜交液，蓋上蓋玻片，恒溫箱42°C，雜交過夜。[0051](4)雜交后洗滌:揭去蓋玻片，37°C 2X檸檬酸三鈉-NaCl緩沖液洗滌2次，每次5分鐘；0.5 X檸檬酸三鈉-NaCl緩沖液洗滌15分鐘；0.2 X檸檬酸三鈉-NaCl緩沖液洗滌15分鐘；
[0052](5)滴加封閉液，37°C 30分鐘，甩去多余液體，不洗；
[0053](6)滴加生物素化鼠抗地高辛，370C 60分鐘，0.5mol/L磷酸緩沖液洗4次，每次5分鐘；
[0054](7)滴加鏈霉親和素-生物素-過氧化物酶復(fù)合物，37°C 20分鐘，0.5mol/L磷酸緩沖液洗3次，每次5分鐘；
[0055](8)滴加生物素化過氧化物酶，370C 60分鐘，0.5mol/L磷酸緩沖液洗4次，每次5分鐘；
[0056](9)顯色:使用二甲基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒，即ImL蒸餾水加顯色劑A、B、C各一滴，混勻，加至標(biāo)本片上，鏡下控制顯色，一般30分鐘內(nèi)顯色完畢，充分水洗；
[0057](10)蘇木精染色30秒后充分水洗，酒精脫水、二甲苯透明，封片。
[0058]結(jié)果觀察:
[0059]地高辛標(biāo)記的寡核苷酸探針與細(xì)胞內(nèi)寄生的螺原體特異性地結(jié)合，經(jīng)DAB染色后呈深棕色，宿主細(xì)胞核由蘇木精染成藍(lán)色。所檢測的健康克氏原螯蝦與感染白斑綜合征病毒病的克氏原螯蝦 無特異性信號(hào)(圖1，2)，而感染螺原體的克氏原螯蝦樣品則出現(xiàn)明顯的深棕色信號(hào)(圖3)。
【權(quán)利要求】
1.螺原體病原的原位雜交檢測探針，其特征在于，其序列如SEQID N0.1和SEQ IDN0.2所示。
2.螺原體病原的原位雜交檢測試劑盒，包括原位雜交試劑和特異性探針，其特征在于所述特異性探針 的序列如SEQ ID N0.1和SEQ ID N0.2所示。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK103805680SQ201210443870
【公開日】2014年5月21日 申請(qǐng)日期:2012年11月8日 優(yōu)先權(quán)日:2012年11月8日
【發(fā)明者】王文, 丁正峰, 孟慶國, 顧偉, 任乾 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)