一種利用外周血分離培養(yǎng)免疫細(xì)胞的方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種利用外周血分離培養(yǎng)免疫細(xì)胞的方法。包括：將外周血在2000rpm、4℃條件下離心10min，收集上層血漿，配制成含血漿的無(wú)血清培養(yǎng)基；加入Ficoll分離液，離心；吸取白膜層，洗滌，即得到PBMC；在PBMC中加入無(wú)血清培養(yǎng)基，接種于無(wú)血清培養(yǎng)基，并添加20～300U/mL IL-2和5～50ng/mL IL-15；培養(yǎng)第13～15天，收集免疫細(xì)胞。本發(fā)明調(diào)整了離心時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速和離心溫度，不僅能較大量的獲得血漿，并能保證血漿中蛋白含量的穩(wěn)定和活性因子成分的不缺失。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種利用外周血分離培養(yǎng)免疫細(xì)胞的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種免疫細(xì)胞的培養(yǎng)方法，具體涉及一種利用外周血分離培養(yǎng)免疫細(xì) 胞的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增 多，靶向性殺傷功能增強(qiáng)，然后再回輸?shù)饺梭w來(lái)殺滅血液及組織中的病原體、癌細(xì)胞、突變 的細(xì)胞，打破免疫耐受，激活和增強(qiáng)機(jī)體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。目前主 要的細(xì)胞免疫治療療法包括細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞（CIK)療法、樹(shù)突狀細(xì)胞（DC)療法、 DC-CIK細(xì)胞療法、自然殺傷細(xì)胞（NK)療法、DC-T細(xì)胞療法等。
[0003]目前免疫細(xì)胞主要通過(guò)無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，但是臨床上規(guī)定使用的無(wú)血清培 養(yǎng)基需要添加一定濃度的自體血漿才能達(dá)到很好的擴(kuò)增培養(yǎng)的效果。血漿是血液的重要組 成部分，人體中自體血漿的最大含量為血液體積的55%，故盡可能的得到最大量的自體血 漿是目前免疫細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 現(xiàn)有技術(shù)的離心時(shí)間短或離心力過(guò)低導(dǎo)致外周血血漿分離得到的血漿量少，離 心時(shí)間長(zhǎng)或離心力過(guò)高會(huì)使得下層血細(xì)胞活率低，從而導(dǎo)致下層PBMC誘導(dǎo)培養(yǎng)得到的免 疫細(xì)胞量少。另外，血漿少，同等自體血漿濃度的免疫細(xì)胞培養(yǎng)基較少，最終培養(yǎng)獲得的細(xì) 胞總量較少。本發(fā)明提供一種新的人自體血漿獲得方法。離心的轉(zhuǎn)速為2000rpm、時(shí)間為 lOmin、溫度4°C，在該條件下收集血漿并不影響下層血細(xì)胞的活率，并可在免疫細(xì)胞培養(yǎng)中 獲得更多的免疫細(xì)胞總量。
[0005] 在常規(guī)免疫細(xì)胞培養(yǎng)中，除獲得上層血漿外，下層細(xì)胞需經(jīng)分離后獲得外周血單 個(gè)核細(xì)胞（PBMC)，再經(jīng)誘導(dǎo)、擴(kuò)增得到NK、NKT、CIK等免疫細(xì)胞。因此本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化血漿 的收集條件，可獲得更多的血漿，保證血漿的白蛋白的含量和活性因子，下層PBMC經(jīng)誘導(dǎo) 培養(yǎng)獲得更多的免疫細(xì)胞（NK/NKT/CIK等）。
[0006] 本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化離心速度、離心溫度與離心時(shí)間，找到最佳的血漿收集的離心條 件，獲得更大的血漿量，同時(shí)也保證分離后較高的細(xì)胞活率，而且血漿蛋白及血漿中的活性 因子的含量均未減少。
[0007] 本發(fā)明目的通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0008] 一種利用外周血分離培養(yǎng)的免疫細(xì)胞的方法，包括以下步驟：
[0009] (1)將外周血在2000rpm、4°C條件下離心lOmin，收集上層血衆(zhòng)，配制成含血衆(zhòng)的 無(wú)血清培養(yǎng)基，其中血漿的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5% ;
[0010] (2)將下層血細(xì)胞和生理鹽水按照體積比1:2?2:1混合后，加入Ficoll分離液， 混合液與Ficoll分離液的體積比為1:2?2:1，離心力為700g，離心20?40min ;
[0011] ⑶吸取白膜層，洗絳，即得到PBMC ;
[0012] (4)在PBMC中加入無(wú)血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度為5 X IO5?20 X 10 5/ml，重懸細(xì)胞 沉淀，接種于無(wú)血清培養(yǎng)基，并添加20?300U/mL IL-2和5?50ng/mL IL-15 ;
[0013] (5)當(dāng)細(xì)胞密度大于2 X 106/ml時(shí)，添加無(wú)血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度保持為5-105/ ml ?I X IOfVml，補(bǔ)加 20 ?300U/mL IL-2 和 5 ?50ng/mL IL-15 ;培養(yǎng)第 13 ?15 天，收集 免疫細(xì)胞。
[0014] 步驟（3)所述洗滌是用生理鹽水洗滌兩次。
[0015] 步驟（3)所述白膜層在離心后的上清液從上往下數(shù)的第二層，。
[0016] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)所具有的優(yōu)點(diǎn)及有益效果。
[0017] 1.在現(xiàn)有外周血血漿分離方案中，采用常溫下3000rpm的離心速度分離血漿，在 獲得大量血漿的同時(shí)，下層細(xì)胞有很大一部分受損，影響后續(xù)免疫細(xì)胞的培養(yǎng)。本發(fā)明調(diào)整 了離心時(shí)間、離心轉(zhuǎn)速和離心溫度，不僅能較大量的獲得血漿，并能保證血漿中蛋白含量的 穩(wěn)定和活性因子成分的不缺失；
[0018] 2.在免疫細(xì)胞培養(yǎng)方案中，目前部分采用含胎牛血清的無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)， 胎牛血清培養(yǎng)屬于動(dòng)物血清，可能導(dǎo)致動(dòng)物源性病原體的污染。所以，本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化血漿 分離條件，得到足夠量的高純度的自體血漿用于培養(yǎng)免疫細(xì)胞，規(guī)避了使用動(dòng)物血清所帶 來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖1是NKT細(xì)胞100的形態(tài)圖；
[0020] 圖2是NKT細(xì)胞的流式檢測(cè)；
[0021] 圖3是NKT細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明提供的人自體血漿獲得方法如下：
[0023] (1)醫(yī)用抗凝管采集血樣，8支，5ml/支，共40ml。
[0024] (2)將40mL外周血置于2-8°C恒溫運(yùn)輸箱中，30min內(nèi)送至細(xì)胞中心，細(xì)胞中心接 收外周血，登記好相關(guān)信息
[0025] 將抗凝管中的外周血轉(zhuǎn)移到15mL離心管中，分4組，每組IOml外周血，分別進(jìn)行 不同離心條件下的血漿分離，如下表1，并檢測(cè)血漿蛋白濃度（酶聯(lián)免疫試劑盒）、后續(xù)分離 PBMC量和細(xì)胞活率，結(jié)果如下表2、表3和表4。
[0026] 表1不同離心條件下的血漿分離
[0027]

【權(quán)利要求】
1. 一種利用外周血分離培養(yǎng)免疫細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 將外周血在2000rpm、4°C條件下離心lOmin，收集上層血衆(zhòng)，配制成含血衆(zhòng)的無(wú)血 清培養(yǎng)基，其中血漿的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)為5% ; (2) 將下層血細(xì)胞和生理鹽水按照體積比1:2?2:1混合后，加入Ficoll分離液，混合 液與Ficoll分離液的體積比為1:2?2:1，離心力為700g，離心20?40min ; ⑶吸取白膜層，洗絳，即得到PBMC; (4) 在PBMC中加入無(wú)血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度為5 X 105?20 X 10 5/ml，重懸細(xì)胞沉淀， 接種于無(wú)血清培養(yǎng)基，并添加20?300U/mL IL-2和5?50ng/mL IL-15 ; (5) 當(dāng)細(xì)胞密度大于2 X 106/ml時(shí)，添加無(wú)血清培養(yǎng)基，使細(xì)胞密度保持為5-105/ml? 1 X 106/ml，補(bǔ)加20?300U/mL IL-2和5?50ng/mL IL-15 ;培養(yǎng)第13?15天，收集免疫 細(xì)胞。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述洗滌是用生理鹽水洗滌兩 次。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟（3)所述白膜層在離心后的上清液的 從上往下數(shù)的第二層。
【文檔編號(hào)】C12N5/078GK104480069SQ201410718862
【公開(kāi)日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 應(yīng)杰, 羅二梅, 王小燕 申請(qǐng)人:廣州賽萊拉干細(xì)胞科技股份有限公司