專利名稱：一種魚卵分類分子鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚卵分類分子鑒定方法，能快速、準(zhǔn)確地對(duì)形態(tài)學(xué)難以鑒定的魚卵進(jìn)行分類鑒定，屬于漁業(yè)資源技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
魚卵記載了魚類許多早期發(fā)育生活史特征及相關(guān)生態(tài)學(xué)信息，在環(huán)境評(píng)估、漁業(yè)資源解析、漁業(yè)資源增殖放流和養(yǎng)殖等研究領(lǐng)域都具有重要意義。魚卵種類的準(zhǔn)確鑒定是研究魚類生活史和魚類資源評(píng)估的工作基礎(chǔ)。一方面魚卵種類的準(zhǔn)確鑒別是進(jìn)行漁業(yè)資源評(píng)估的前提，另一方面魚類早期發(fā)育又與漁業(yè)資源的早期補(bǔ)充機(jī)制密切相關(guān)。因此，越來越多的學(xué)者開始關(guān)注魚卵分類及其生物、生態(tài)學(xué)研究。目前魚卵種類鑒定主要依賴傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法，即依據(jù)胚胎的外部特征(如魚卵的形狀、卵徑、卵膜構(gòu)造、油球有無及油球徑大小、卵黃構(gòu)造、卵黃大小、胚體形態(tài)及色素出現(xiàn)的早晚等)來判斷。由于部分魚卵在形態(tài)上高度 相似、產(chǎn)卵期和產(chǎn)卵區(qū)的交叉重疊及缺乏可靠的鑒定資料，魚卵種類的準(zhǔn)確鑒定十分困難。迄今為止，只有較少數(shù)的魚卵可以被鑒定到種，許多魚卵只能鑒定到科或?qū)俚乃健?br>
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的即為克服傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定方法的不足之處，提供一種魚卵分類分子
鑒定方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為首先分別提取調(diào)查水域魚類的DNA，選擇線粒體DNA中細(xì)胞色素氧化酶亞單位I基因(CO I)為特征片段，通過擴(kuò)增后測(cè)序，建立線粒體CO I基因DNA指紋庫，然后提取需要鑒定的魚卵的DNA，擴(kuò)增CO I基因后測(cè)序，與指紋庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，若基因序列一致性大于或等于99%，即可判斷屬于同一個(gè)種，從而鑒定出魚卵種類。上述方法中，魚類的樣本應(yīng)盡量全面，提取的魚類或魚卵的DNA，可以為總DNA，也可以僅提取線粒體DNA ;總DNA的提取方法可采用常規(guī)苯酚-氯仿法(《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾))；線粒體DNA的提取方法可采用Triton法、堿變性法、改進(jìn)高鹽沉淀法等(參見李偉文，線粒體DNA提取方法的比較.國(guó)外醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)分冊(cè)；2003 ；25 (3) ；191) ；DNA的擴(kuò)增方法可采用常規(guī)PCR方法。線粒體DNA中CO I基因較保守，同源性高，無組織特異性，進(jìn)化速度快，在魚卵中也存在大量的拷貝數(shù)，非常適合作為分子標(biāo)記物。本發(fā)明選擇線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞單位I基因(COI)為特征片段建立DNA指紋庫，實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，分類鑒定準(zhǔn)確。使用該方法對(duì)魚卵進(jìn)行分類鑒定與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法相比具有以下優(yōu)勢(shì)
(I)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法借助顯微鏡根據(jù)胚胎形態(tài)差異對(duì)魚卵樣本進(jìn)行鑒定，不僅要求鑒定者具備扎實(shí)的魚類早期分類鑒定知識(shí)，而且準(zhǔn)確鑒定到種極其困難；而魚類線粒體COI基因在DNA片段中相對(duì)保守，是穩(wěn)定可靠的種間分子標(biāo)記，分類鑒定結(jié)果準(zhǔn)確；(2)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法在無法對(duì)魚卵樣本準(zhǔn)確分類的情況下，需要對(duì)魚卵進(jìn)行孵化培養(yǎng)，待胚胎發(fā)育至形態(tài)發(fā)生分化，直至有明顯的形態(tài)差異時(shí)再進(jìn)行分類鑒定。這種方法對(duì)魚卵采集后的孵化條件及孵化技術(shù)要求很高，而且需要耗費(fèi)大量的時(shí)間和精力。本發(fā)明的方法在采集魚卵后僅需要用95%的酒精保存，不需要復(fù)雜的保存條件，帶回實(shí)驗(yàn)室后經(jīng)過步驟簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)，獲得CO I基因序列后經(jīng)比對(duì)DNA庫可以快速、準(zhǔn)確的對(duì)樣本進(jìn)行分類鑒定。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地說明，但本發(fā)明不限于下述實(shí)施例。一種魚卵分類分子鑒定方法，采用以下步驟
1、在調(diào)查水域通過現(xiàn)場(chǎng)捕撈、市場(chǎng)購買等方法獲取可以準(zhǔn)確分類鑒定的魚類樣本，用95%乙醇固定，帶回實(shí)驗(yàn)室_4°C保存?zhèn)溆茫? 2、取上述一種魚類樣本肌肉約IOOmg裝入I.5ml的Eppendorf管中，參照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第三版(J.薩姆布魯克，D. W.拉塞爾)采用常規(guī)苯酚-氯仿法提取樣本總DNA ；
3、選擇COI基因?yàn)樘卣髌?，采用PCR擴(kuò)±曾，上游引物(5 , — 3 '):AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC，下游引物(5 ' — 3 ' ) CCTGCAGGAGGAGAYCC，PCR 反應(yīng)體系為20μ L，包括 IOXbuffer (含 Mg2+)2y L、2. 5 mmol/L dNTP 2 μ L、10 μ mol/L 上下游引物各IuL, 5 U TaqDNA 聚合酶 O. 2μ L.50 ng/μ L 的 DNA 模板 I μ L，用超純水補(bǔ)足 20 μ L ;PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性3min ;每一循環(huán)94°C 30 s，55°C 40 s,72°C 50 s;共35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸8min ；
4、PCR產(chǎn)物經(jīng)I.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用glassmilk(上海申能博彩生物有限公司)純化試劑盒回收，送測(cè)序；
5、重復(fù)步驟2-4，獲得各魚類樣本的線粒體COI基因序列，匯總建立該水域各種魚類DNA指紋庫；
6、在調(diào)查水域采集魚卵樣本，保存于95%酒精中帶回實(shí)驗(yàn)室，分別取魚卵約IOOmg按步驟2-4所述的實(shí)驗(yàn)方法獲得魚卵線粒體CO I基因的序列；
7、將魚卵線粒體COI基因序列與已經(jīng)建立的CO I基因DNA指紋庫進(jìn)行比對(duì)，若基因序列一致性大于或等于99%，即可判斷屬于同一個(gè)種，從而鑒定出魚卵種類。本發(fā)明提供的魚卵分子鑒定方法準(zhǔn)確度高，實(shí)驗(yàn)周期短，對(duì)樣本要求低，克服了現(xiàn)有方法的局限性，顯示了其準(zhǔn)確、便捷、快速的優(yōu)勢(shì)。
權(quán)利要求
1.一種魚卵分類分子鑒定方法，其特征在于包括以下步驟 (1)分別提取調(diào)查水域魚類的DNA，選擇線粒體DNA中細(xì)胞色素氧化酶亞單位I基因COI為特征片段，通過PCR擴(kuò)增后測(cè)序，建立線粒體CO I基因DNA指紋庫； (2)提取需要鑒定的魚卵的DNA，PCR擴(kuò)增COI基因后測(cè)序； (3)將所述魚卵的COI基因序列與所述指紋庫中的基因序列進(jìn)行比對(duì)，若基因序列一致性大于或等于99%，即可判斷屬于同一個(gè)種，從而鑒定出魚卵種類。
2.如權(quán)利要求I所述的魚卵分類分子鑒定方法，其特征在于所述提取的魚類或魚卵的DNA，為總DNA或線粒體DNA。
3.如權(quán)利要求I所述的魚卵分類分子鑒定方法，其特征在于所述PCR擴(kuò)增所用的引物為上游引物(5 ' - 3 ' ) AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC ;下游引物(5 ' - 3 ')CCTGCAGGAGGAGAYCC。
全文摘要
本發(fā)明公布了一種魚卵分類分子鑒定方法，首先分別提取調(diào)查水域魚類的DNA，選擇線粒體DNA中細(xì)胞色素氧化酶亞單位I基因(COI)為特征片段，通過擴(kuò)增后測(cè)序，建立線粒體COI基因DNA指紋庫，然后提取需要鑒定的魚卵的DNA，擴(kuò)增COI基因后測(cè)序，與指紋庫中的序列進(jìn)行比對(duì)，從而鑒定出魚卵種類。本發(fā)明的方法操作簡(jiǎn)單，分類鑒定準(zhǔn)確。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102864240SQ20121038230
公開日2013年1月9日 申請(qǐng)日期2012年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月11日
發(fā)明者張敏瑩, 施煒綱, 徐東坡, 劉凱, 周彥鋒, 段金榮, 方第安 申請(qǐng)人:中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心