一種海南黃花梨和越南黃花梨的分子鑒定方法和鑒定引物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種海南黃花梨和越南黃花梨的分子鑒 定方法和鑒定引物。
【背景技術(shù)】
[0002] 海南黃花梨，又名降香黃檀（Dalbergia ordorifera T.Chen)是豆科黃檀屬 (Da化ergia L.)植物，為高大喬木，特產(chǎn)我國(guó)海南，是眾所周知的最為名貴的紅木種類，目 前市場(chǎng)上每公斤海南黃花梨木材的銷售價(jià)格已經(jīng)超過(guò)1萬(wàn)元人民幣。海南黃花梨高昂的市 場(chǎng)價(jià)格所造成的巨大利益驅(qū)動(dòng)，導(dǎo)致市場(chǎng)上大量出現(xiàn)走私售假的不法行為。我們通過(guò)走訪 紅木市場(chǎng)和商家企業(yè)發(fā)現(xiàn)，目前市場(chǎng)上超過(guò)90%的海南黃花梨均產(chǎn)于越南、價(jià)格不到海南 黃花梨一半的越南黃花梨(又名越南黃檀化化ergia tonkinensis Prain)走私到我國(guó)并冒 充海南黃花梨。假冒現(xiàn)象如此普遍的原因則在于，傳統(tǒng)的木材解剖等鑒定手段原則上只能 鑒定到大類，不可能鑒定到具體的物種。例如，對(duì)于一個(gè)樣品，利用傳統(tǒng)的木材鑒定方法，可 將其鑒定為黃檀類或香枝木類木材，而不可能準(zhǔn)確鑒定為海南黃花梨或越南黃花梨。
[0003] 生物的DNA含有大量的遺傳密碼信息，運(yùn)些遺傳密碼信息可W用于物種之間甚至 同一個(gè)物種不同個(gè)體之間的鑒定，廣為人知的人類親子鑒定便是其中一例。對(duì)于木材的鑒 定，傳統(tǒng)的木材鑒定方法，包括木材解剖、物理和化學(xué)指標(biāo)檢測(cè)，都只能鑒定到大類，即屬于 某一類型的木材，而不可能準(zhǔn)確鑒定到具體的原生樹種。相比而言，針對(duì)性地開發(fā)特殊的植 物質(zhì)體DNA測(cè)序引物，測(cè)得目標(biāo)物種特異的DNA序列，通過(guò)和標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行DNA比對(duì)，能夠更 準(zhǔn)確地進(jìn)行木材樣品的原生樹種鑒定。運(yùn)是因?yàn)椋?)質(zhì)體DNA為植物所特有，在進(jìn)行DNA序列 測(cè)序和比對(duì)分析的時(shí)候方便排除木材中附帶的木材內(nèi)生真菌DNA的影響；（2)質(zhì)體DNA在植 物中的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核DNA，對(duì)一些保存狀況不甚理想的木材樣品，也方便獲得足夠的DNA 進(jìn)行樣品分析；（3)植物質(zhì)體DNA為環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中的每個(gè)基因僅有一個(gè)拷貝，避免了核基因 多個(gè)拷貝的存在而產(chǎn)生的假陽(yáng)性現(xiàn)象。
[0004] 因此，如能開發(fā)一種利用海南黃花梨與越南黃花梨質(zhì)體DNA序列的差異而對(duì)二者 進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定方法將能彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法的不足，提供一種有效的鑒定手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對(duì)傳統(tǒng)木材鑒定方法不能準(zhǔn)確鑒定區(qū)分海南黃花梨和越南黃 花梨的不足，提供一種基于質(zhì)體基因 rpoC2和PetD序列差異的海南黃花梨和越南黃花梨的 分子鑒定方法和鑒定引物。
[0006] 本發(fā)明的海南黃花梨和越南黃花梨的分子鑒定方法，包括W下步驟：
[0007] a、對(duì)待鑒定樣品進(jìn)行總DNA提??；
[000引b、PCR擴(kuò)增：W步驟a提取的總DNA為模板，分別用巧oC2序列的正/反向引物和PetD 序列的正/反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分別得到擴(kuò)增產(chǎn)物;所述的rpoC2序列的正向引物的堿基 序列如SEQ ID NO.5所示，所述的rpoC2序列的反向引物的堿基序列如SEQ ID NO.6所示，所 述的petD序列的正向引物的堿基序列如SEQ ID NO.7所示，所述的petD序列的反向引物的 堿基序列如SEQ ID NO.8所示；
[0009] C、序列比對(duì):將擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序，然后將測(cè)序的巧oC2序列與SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO.3進(jìn)行比對(duì)，將測(cè)序的petD序列與SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4進(jìn)行比對(duì);如果巧oC2序列 與SEQ ID NO. 1-致、petD序列與SEQ ID NO. 2-致，則該待鑒定樣品為海南黃花梨；如果 巧oC2序列與SEQ ID NO.3-致、petD序列與SEQ ID NO.4-致，則該待鑒定樣品為越南黃花 梨。
[0010] 優(yōu)選，所述的步驟a的對(duì)待鑒定樣品進(jìn)行總DNA提取后，還用陽(yáng)G試劑對(duì)總DNA進(jìn)行 純化并使DNA終濃度為50-200ngAU。
[001U 優(yōu)選，所述的步驟b的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：含有5xPrimcSTAR貧Buf f er (Mg2+ plus)化l、dNTP MixUire(2.5mM)化 1、正向引物（IOiiM)O.化1、反向引物（IOiiM)O.化1、總DNA 模板化1和PfimcSTAR嚴(yán)HS DNA化171116^36(2.51]/41)0.2扣1，其余由滅菌蒸饋水補(bǔ)足至 2化1;反應(yīng)條件為：951：3111111;941：3〇3,5〇-521：3〇3,72°(：1111111，35個(gè)循環(huán)；72°(：1〇111111。
[0012] 本發(fā)明還提供了海南黃花梨和越南黃花梨的鑒定引物，所述的鑒定引物包括 巧oC2序列的正/反向引物和petD序列的正/反向引物，所述的rpoC2序列的正向引物的堿基 序列如SEQ ID NO.5所示，所述的rpoC2序列的反向引物的堿基序列如SEQ ID NO.6所示，所 述的petD序列的正向引物的堿基序列如SEQ ID NO.7所示，所述的petD序列的反向引物的 堿基序列如SEQ ID NO.8所示。
[0013] 本發(fā)明首次對(duì)海南黃花梨和越南黃花梨的兩個(gè)質(zhì)體基因 rpoC2和petD進(jìn)行了測(cè)序 分析，發(fā)現(xiàn)質(zhì)體基因 rpoC2和petD均在海南黃花梨和越南黃花梨之間存在顯著差異。利用運(yùn) 種特性，用rpoC2的正/反向引物和petD的正/反向引物分別對(duì)未知黃檀類或香枝木類木材 樣品的總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，將擴(kuò)增到的未知樣品的rpoC2序列與 海南黃花梨和越南黃花梨標(biāo)準(zhǔn)樣品的rpoC2序列比對(duì)，擴(kuò)增到的未知樣品的petD序列與海 南黃花梨和越南黃花梨標(biāo)準(zhǔn)樣品的petD序列比對(duì)，根據(jù)比對(duì)的序列一致性結(jié)果即可判斷該 未知樣品是海南黃花梨還是越南黃花梨。
[0014] 對(duì)于DNA未降解的木材樣品，本發(fā)明的方法可在10個(gè)工作日內(nèi)獲得其質(zhì)體基因 巧OC2和petD序列，通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行比較，可有效鑒別待鑒定樣品與海南黃花梨和越南 黃花梨標(biāo)準(zhǔn)樣品的DNA相似性的支持率達(dá)到99% W上。首次解決了依靠傳統(tǒng)木材解剖手段 無(wú)法鑒別海南黃花梨和越南黃花梨的難題，為木材市場(chǎng)、商家、消費(fèi)者、公安機(jī)關(guān)、海關(guān)和科 研機(jī)構(gòu)提供一種高效可靠的海南黃花梨和越南黃花梨鑒別方法，具有很強(qiáng)的應(yīng)用價(jià)值。本 發(fā)明的方法還可在建立標(biāo)準(zhǔn)樣品DNA信息庫(kù)的基礎(chǔ)上，用于鑒定豆科其他重要近緣經(jīng)濟(jì)植 物原生種類，例如觀賞植物羊蹄甲屬、糧油植物大豆屬等。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1是海南黃花梨和越南黃花梨的rpoC2序列比對(duì)結(jié)果，D〇-rpoC2表示海南黃花梨 (Dalbergia ordorifera T.畑en)的;rpoC2序列，Dt-;rpoC2表示越南黃花梨（DaAergia tonkinensis Pr曰in)的rpoC2序列。
[0016] 圖2是海南黃花梨和越南黃花梨的petD序列比對(duì)結(jié)果，Do-petD表示海南黃花梨 (Dalbergia ordorifera T.畑 en)的petD序列，Dt-petD 表示越南黃花梨（Dalbergia tonkinensis Pr曰in)的petD序列。
【具體實(shí)施方式】
[0017] W下實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步說(shuō)明，而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0018] W下實(shí)施例中海南黃花梨或越南黃花梨木材樣品的總DNA提取、純化，PCR擴(kuò)增和 PCR產(chǎn)物純化步驟如下：
[0019] 1、總DNA 提取
[0020] (1)利用銀片將2g樣品銀成碎末，裝入2ml離屯、管，加入適量的液氮，在自動(dòng)研磨機(jī) 中充分研磨成粉末狀。
[0021] (2)將研磨成粉末狀的樣品置于50ml離屯、管中，采用CTAB法提取總DNA。
[0022] (3)每管加入CTAB 16ml，e-琉基乙醇32化1，蛋白酶K 20iil，65°C水浴12-2地。
[0023] (4)水浴結(jié)束后取出離屯、管，冷卻至室溫。
[0024] (5)加入13ml氯仿/異戊醇（體積比為24:1)，顛倒混勻后，置于-20°C冷凍處理5~ 10min〇
[0025] (6)將離屯、管置于冷凍離屯、機(jī)上4r、12000rpm離屯、15min。
[00%] (7)將離屯、后的上清液轉(zhuǎn)移至新的50ml離屯、管中，重復(fù)步驟(5)、（6)。
[0027] (8)加入與上清液等體積的異丙醇，置于-20°C，冷凍處理12-2地。
[002引 （9)將離屯、管置于冷凍離屯、機(jī)上4°C、10000巧m離屯、lOmin，棄上清液。
[0029] (10)3ml體積分?jǐn)?shù)70%乙醇清洗0歴沉淀，并轉(zhuǎn)入21111離屯、管（分2管），4°(：、 1000化pm離屯、IOmin，棄上清液，再加入體積分?jǐn)?shù)70 %乙醇重復(fù)清洗一次。
[0030] (11)將離屯、管置于真空干燥機(jī)中，5(TC干燥5min，得到總DNA，加入80~12化1 TE 緩沖液溶解DNA。4 °C或-20°C保存。
[00川 2、總DNA純化
[0032] (1)將還未純化的總DNA轉(zhuǎn)入1.5ml離屯、管中，加入等體積的陽(yáng)G試劑(該陽(yáng)G試劑的 濃度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)20 %，PEG分子量為8000)混勻。
[0033] (2)將離屯、管置于水浴鍋中37°C處理15min。
[0034] (3) 12000巧 m 離屯、5min，棄上清液。
[0035] (4)重復(fù)步驟(1)~(3)兩次。
[0036] (5)加入IOOiil預(yù)冷的80 %乙醇，混勻。12000巧m離屯、15min，去上清液。
[0037] (6)重復(fù)步驟(5)。
[003引 （7)將離屯、管置于真空干燥機(jī)中，50°C干燥5min，加入扣1純水溶解DNA。使用 Nano化OP 2000檢測(cè)純化后的DNA濃度，如果濃度低于50ng/山，則不需再加純水稀釋DNA;如 果濃度高于2(K)ngAil，則加純水稀釋至2(K)ngAil。
[0039] 3、總DNA 的 PCR 擴(kuò)增
[0040] 選用大連寶生物公司（Takara)的高保真性PCR聚合酶Mm謀TA及狡HS DNA Polymerase, W純化后的總DNA為模板DNA、W單個(gè)目標(biāo)基因（rpoC2或petD)的正/反向引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0041 ] (I)PCR反應(yīng)體系如表1所示：
[00創(chuàng)表1PCR反應(yīng)體系
[0043]
[0044] 所述的擴(kuò)增巧〇C2的引物對(duì)為：rpoC2-TulF/巧oC2-TulR，包括正向引物巧oC2-TulF 為：5'-GAAGGTCATGCAGGTGGAGT-3'；反向引 物 rpoC2-TulR 為：5'-CCAAAGTCGTGTGGGAAAAAGT-3 ' ；所述的擴(kuò)增petD的引物對(duì)為：9610-化巧/9610-化11?，包括正 向引物petD-Tul :5'-TCCTTTGTATGTAAAAAGTCCCGA-3' ；反向引物petD-TulR:5'-ATCCGGCTCGAGCAAGAATC-3'。
[0045] (2)PCR反應(yīng)條件設(shè)置
[0046] PCR