專利名稱：一種間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)技術(shù)。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有的間充質(zhì)干細胞分泌素的美容產(chǎn)品(如蘋果干細胞)已經(jīng)為大眾所接受，而且學(xué)術(shù)界對于來自間充質(zhì)干細胞的分泌素的潛在醫(yī)療用途正展開深入的探討，近年已有分泌素的正面醫(yī)療效果的文獻出現(xiàn)，如改善皮膚皺紋，心衰竭，腦退化，視力，壽命延長，等等。近年有大量文獻亦指出分泌素的其它潛在醫(yī)藥價值，暫時研究得最深入的便是其改善心臟衰竭的功用，研究指出干細胞分泌物中所含的外吐小體(exosome)具有一定醫(yī)療用途如美國專利2011/0003008A1所揭示的。雖然間充質(zhì)干細胞分泌素的市場潛力很大，但是其大量培養(yǎng)存在較大的困難，主要表現(xiàn)為人類間充質(zhì)干細胞在生長時所需要較大的表面積。 現(xiàn)有間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)主要是讓間充質(zhì)干細胞在培養(yǎng)瓶中生長數(shù)天，而后將培養(yǎng)液更換為不含牛血清的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24至48小時后取其上清液便是間充質(zhì)干細胞分泌素。現(xiàn)有技術(shù)的缺點主要表現(xiàn)為I、主要利用細胞培養(yǎng)瓶去收集分泌素，而由于間充質(zhì)干細胞的依附生長之特性，大量生產(chǎn)分泌素所需要的細胞數(shù)目會花上非常多的培養(yǎng)瓶及空間，培養(yǎng)起來花時而且成本聞昂；2、收集分泌素時需要大量的培養(yǎng)液，成本非常高；3、分泌素中的蛋白質(zhì)在濃縮時會大量流失，而且產(chǎn)品中帶有高鹽分及細胞培養(yǎng)液等雜質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，提供一種能大量生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品純度高的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法。本發(fā)明實現(xiàn)發(fā)明目的采用的技術(shù)方案是，一種間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟a.在生物反應(yīng)器中對間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)，得到目標(biāo)數(shù)量的間充質(zhì)干細胞，以磷酸鹽緩沖液對生物反應(yīng)器中的間充質(zhì)干細胞和微載體進行清洗；b.向生物反應(yīng)器中注入細胞培養(yǎng)基底液和磷酸鹽緩沖液繼續(xù)培養(yǎng)；c.收集生物反應(yīng)器中的上清液，并將所述上清液濃縮得到蛋白質(zhì)濃縮液；d.以純水稀釋所述蛋白濃縮液，置于生物反應(yīng)器中，重復(fù)步驟b、c，得到的蛋白濃縮液中的蛋白即為間充質(zhì)干細胞分泌素。優(yōu)選地，所述步驟a之前還包括培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細胞，并將間充質(zhì)干細胞注入到含有細胞培養(yǎng)液和微載體的生物反應(yīng)器中，生物反應(yīng)器中的間充質(zhì)干細胞不少于I千萬個每升。優(yōu)選地，所述間充質(zhì)干細胞為脂肪間充質(zhì)干細胞、牙髓間充質(zhì)干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞或牙齦間充質(zhì)干細胞。優(yōu)選地，所述細胞培養(yǎng)液包含MEM培養(yǎng)基底液、牛血清以及抗生素。優(yōu)選地，所述步驟a中控制生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)速為40_60rpm，溫度36_38攝氏度，并提供二氧化碳氣體供應(yīng)的條件下對間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)。優(yōu)選地，所述步驟a還包括在對間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)的過程中，于第24小時和第72小時分別向生物反應(yīng)器中注入新的細胞培養(yǎng)液。優(yōu)選地，所述步驟b中細胞培養(yǎng)基底液為DMEM細胞培養(yǎng)基底液，所述DMEM細胞培養(yǎng)基底液與所述磷酸鹽緩沖液的體積比為1/5至1/2。
優(yōu)選地，所述步驟c中通過以下方法進行濃縮將上清液通過切向流過濾膜的方法進行濃縮，得到蛋白濃縮液。優(yōu)選地，所述步驟d還包括對所述間充質(zhì)干細胞分泌素進行蛋白定量和分裝的步驟，最后通過冷凍干燥將所述間充質(zhì)干細胞分泌素制成粉末，低溫保存。本發(fā)明的有益效果是I、本發(fā)明利用了生物反應(yīng)器技術(shù)替代傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)瓶去制作間充質(zhì)干細胞分泌素，大幅縮減成本及所需空間；例如要制作來自兩億個干細胞的分泌素，在傳統(tǒng)的方法上需要500個T150的細胞培養(yǎng)瓶；而本發(fā)明只需要一個3公升的生物反應(yīng)器，只相等于20個T150細胞培養(yǎng)瓶的體積；2、本發(fā)明的間充質(zhì)干細胞兼容性高，可配合不同的間充質(zhì)干細胞作為源材料而制作出不同的間充質(zhì)干細胞分泌素如脂肪間充質(zhì)干細胞，臍帶間充質(zhì)干細胞，牙髓間充質(zhì)干細胞，胎盤間充質(zhì)干細胞等等；3、本發(fā)明于收集間充質(zhì)干細胞分泌素的過程中，通過向生物反應(yīng)器中注入細胞培養(yǎng)基底液和磷酸鹽緩沖液可以稀釋生物反應(yīng)器中的培養(yǎng)液，達到安全地持續(xù)刺激間充質(zhì)干細胞細胞分泌蛋白的作用，從而能提高充質(zhì)干細胞細胞分泌素的產(chǎn)量；4、傳統(tǒng)的方法只針對蛋白的濃縮而沒有去鹽的考慮，但是培養(yǎng)液中殘余的離子會讓產(chǎn)品使用者的血液離子濃度在短時間內(nèi)被大幅提升，影響體內(nèi)器官(尤其是心臟)的健康；本發(fā)明通過純水稀釋蛋白濃縮液的步驟，使產(chǎn)物得到去鹽純化處理(去鹽效果達95%以上)，能有效地去除分泌素中的非間充質(zhì)干細胞，大幅提高產(chǎn)品的安全性及效果，讓所生產(chǎn)出的分泌素能夠適合各方面的應(yīng)用。5、本發(fā)明所制作出的間充質(zhì)干細胞分泌素凍干粉含有完整的外吐小體，是間充質(zhì)干細胞分泌素的有效成份。
具體實施例方式實施例I:培養(yǎng)2億個脂肪間充質(zhì)干細胞分泌素首先將4百萬個脂肪間充質(zhì)干細胞置于含有細胞培養(yǎng)液的T-150培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)液包含有10%的牛血清、1%的抗生素以及alpha-MEM培養(yǎng)基底液，培養(yǎng)出3千萬個脂肪間充質(zhì)干細胞；然后將上述脂肪間充質(zhì)干細胞轉(zhuǎn)移至放有3克微載體和400亳升細胞培養(yǎng)液的3公升生物反應(yīng)器中，在轉(zhuǎn)速維持于40rpm的條件下培養(yǎng)；于第24小時及第72小時分別向生物反應(yīng)器中注入200毫升及500毫升的細胞培養(yǎng)液.持續(xù)細胞培養(yǎng)至脂肪間充質(zhì)干細胞數(shù)目到達2億個的水平(約需6天)；當(dāng)脂肪間充質(zhì)干細胞數(shù)目達標(biāo)時利用磷酸鹽緩沖液將脂肪間充質(zhì)干細胞及其附著的微載體清洗三次，然后向生物反應(yīng)器中注入2升磷酸鹽緩沖液及I升DMEM/F12培養(yǎng)基底液，繼續(xù)培養(yǎng)，于48小時后收集生物反應(yīng)器中的上清液，利用0.22um的濾膜過濾上清液以移除當(dāng)中殘余的脂肪間充質(zhì)干細胞，再使用帶有濾孔為5kDa的濾膜的切向流過濾器將上清液中的蛋白濃縮及去鹽，最后將濃縮液的蛋白利用冷凍干燥機制成粉末并保存于-80度，得到脂肪間充質(zhì)干細胞分泌素成品。實施例2:培養(yǎng)2億個牙髓間充質(zhì)干細胞分泌素本實施例與實施例I的培養(yǎng)方法大致相同，只是利用了牙髓間充質(zhì)干細胞代替脂肪間充質(zhì)干細胞，于3公升生物反應(yīng)器中的生長時間可由總時間9天減少至6天，而收集牙髓間充質(zhì)干細胞分泌素的時間可增加至72小時。實施例3:培養(yǎng)2千萬個臍帶間充質(zhì)干細胞分泌素本實施例的培養(yǎng)方法與實施例I也大致相同，只是利用了臍帶間充質(zhì)干細胞代替脂肪間充質(zhì)干細胞，將剛解凍的4百萬個臍帶間充質(zhì)干細胞直接放入含有0. 8克微載體和300亳升培養(yǎng)液的500亳升生物反應(yīng)器中培養(yǎng)，于72小時生物反應(yīng)器更新細胞培養(yǎng)液，生物反應(yīng)器中的生長時間可由總時間9天增長至10至12天.實施例4:培養(yǎng)2億個牙齦間充質(zhì)干細胞分泌素本實施例的培養(yǎng)方法與實施例I也大致相同，只是利用了牙齦間充質(zhì)干細胞代替脂肪間充質(zhì)干細胞，收集牙齦間充質(zhì)干細胞分泌素后的微載體上的牙齦間充質(zhì)干細胞可用膠原蛋白酶消化I小時以釋出其中的牙齦間充質(zhì)干細胞，得到的細胞可被再培養(yǎng)或冷凍備用。作為上述實施方式中培養(yǎng)方法的替代方案，還可以用透析膜代替切向流過濾器將間充質(zhì)干細胞分泌素進行去鹽，以及可以用食品干燥機代替凍干粉機將充質(zhì)干細胞分泌素制成粉末。最后應(yīng)說明的是以上實施例僅用以說明本發(fā)明而并非限制本發(fā)明所描述的技術(shù)方案；因此盡管本說明書參照上述的各個實施例對本發(fā)明已進行了詳細的說明，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，仍然可以對本發(fā)明進行修改或等同替換；而一切不脫離本發(fā)明的精神和范圍的技術(shù)方案及其改進，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍中。權(quán)利要求
1.一種間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述培養(yǎng)方法包括以下步驟 a.在生物反應(yīng)器中對間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)，得到目標(biāo)數(shù)量的間充質(zhì)干細胞，以磷酸鹽緩沖液對生物反應(yīng)器中的間充質(zhì)干細胞和微載體進行清洗； b.向生物反應(yīng)器中注入細胞培養(yǎng)基底液和磷酸鹽緩沖液繼續(xù)培養(yǎng)； c.收集生物反應(yīng)器中的上清液，并將所述上清液濃縮得到蛋白質(zhì)濃縮液； d.以純水稀釋所述蛋白濃縮液，置于生物反應(yīng)器中，重復(fù)步驟b、c，得到的蛋白濃縮液中的蛋白即為間充質(zhì)干細胞分泌素。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟a之前還包括培養(yǎng)得到間充質(zhì)干細胞，并將間充質(zhì)干細胞注入到含有細胞培養(yǎng)液和微載體的生物反應(yīng)器中，生物反應(yīng)器中的間充質(zhì)干細胞不少于I千萬個每升。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞為脂肪間充質(zhì)干細胞、牙髓間充質(zhì)干細胞、臍帶間充質(zhì)干細胞或牙齦間充質(zhì)干細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述細胞培養(yǎng)液包含MEM培養(yǎng)基底液、牛血清以及抗生素。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟a中控制生物反應(yīng)器轉(zhuǎn)速為40-60rpm，溫度36-38攝氏度，并提供二氧化碳氣體供應(yīng)的條件下對間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟a還包括在對間充質(zhì)干細胞進行培養(yǎng)的過程中，于第24小時和第72小時分別向生物反應(yīng)器中注入新的細胞培養(yǎng)液。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟b中細胞培養(yǎng)基底液為DMEM細胞培養(yǎng)基底液，所述DMEM細胞培養(yǎng)基底液與所述磷酸鹽緩沖液的體積比為1/5至1/2。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟c中通過以下方法進行濃縮將上清液通過切向流過濾膜的方法進行濃縮，得到蛋白濃縮液。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，其特征在于，所述步驟d還包括對所述間充質(zhì)干細胞分泌素進行蛋白定量和分裝的步驟，最后通過冷凍干燥將所述間充質(zhì)干細胞分泌素制成粉末，低溫保存。
全文摘要
本發(fā)明提供一種能大量生產(chǎn)，且生產(chǎn)成本低、產(chǎn)品純度高的間充質(zhì)干細胞分泌素的培養(yǎng)方法，利用了生物反應(yīng)器技術(shù)替代傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)瓶去制作間充質(zhì)干細胞分泌素,大幅縮減成本及所需空間；且使用的間充質(zhì)干細胞兼容性高，能安全地持續(xù)刺激間充質(zhì)干細胞細胞分泌蛋白，提高了充質(zhì)干細胞細胞分泌素的產(chǎn)量。
文檔編號C12P21/00GK102732586SQ20121021313
公開日2012年10月17日 申請日期2012年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月26日
發(fā)明者周向榮, 鄧銘權(quán), 陳詠敏 申請人:亞太干細胞科研中心有限公司