專利名稱：一種高效擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的新方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一類促使間充質(zhì)干細(xì)胞體外大量增殖的新方法及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是一種具有自我更新和遷徙能力的多能成體干細(xì)胞，能夠分化形成多種組織細(xì)胞并釋放有益于組織再生修復(fù)的細(xì)胞活性因子，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。因其沒有倫理學(xué)的約束，并且可以分化成具有相關(guān)功能的細(xì)胞或組織，從而成為實驗和臨床研究的重點。MSCs來源于多種組織，包括骨髓、臍帶血、外周血、脂肪等，但無論哪一種來源，其取材數(shù)量都是有限的，很難滿
足臨床移植所需的細(xì)胞數(shù)量要求。雖然MSCs在臨床治療上的前景和地位已經(jīng)明確，但由于人體內(nèi)干細(xì)胞來源數(shù)量有限，僅靠傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法難以在短時間內(nèi)滿足臨床移植上對細(xì)胞數(shù)量的要求。因此，MSCs的體外擴(kuò)增方法的探索一直是干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱點問題。國內(nèi)外已竟相開展這方面研究工作，取得了一些進(jìn)展。目前，Chen等利用旋轉(zhuǎn)式生物反應(yīng)器擴(kuò)增人骨髓MSCs，另外添加干細(xì)胞因子(Stem ce 11 factor, SFC)、白細(xì)胞介素-3 (Interleukin-3, IL-3)和 IL-6,檢測發(fā)現(xiàn)Stro-l+Q)44+a)34-的MSCs在8d后可擴(kuò)增9倍,成纖維細(xì)胞集落形成率(Colony-formingefficiency-fibroblast per day, CFE-F/day)是未用生物反應(yīng)器擴(kuò)增的對照組的I. 44倍，擴(kuò)增后的細(xì)胞可表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞早期標(biāo)志波形蛋白(Vimentin)和Endoglin(SH2),而分化細(xì)胞的標(biāo)志如II型膠原、骨鈣素(Osteocalcin，Oc)和C/EBP-α等則未檢測到，并且這些細(xì)胞可分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞及成脂肪細(xì)胞。Yu等也利用生物反應(yīng)器成功在體外擴(kuò)增出MSCs，如利用攪拌式生物反應(yīng)器培養(yǎng)人胎盤來源的MSCs，與用培養(yǎng)皿擴(kuò)增的對照組細(xì)胞相比較，培養(yǎng)144h后攪拌式生物反應(yīng)器擴(kuò)增的細(xì)胞數(shù)量是培養(yǎng)皿的I. 73倍，并且MSCs的表型特征不變。通過氣升式環(huán)流中空纖維膜生物反應(yīng)器對兔骨髓MSCs進(jìn)行三維動態(tài)培養(yǎng)，7d后可擴(kuò)增16倍，擴(kuò)增后大部分細(xì)胞呈CD29+、CD44+、CD45-，保持MSCs的表型，并具有較強(qiáng)的成骨、成軟骨和成脂的多向分化能力。這些研究表明，通過生物反應(yīng)器不但可使MSCs在數(shù)量上得到擴(kuò)增，還能夠保證MSCs維持原本的表型和分化能力，符合臨床移植用MSCs的基本生物學(xué)特征。除了生物反應(yīng)器，科學(xué)家們還發(fā)現(xiàn)了其他方法也有助于實現(xiàn)MSCs體外擴(kuò)增。研究發(fā)現(xiàn)通過表面抗原篩選可以提高M(jìn)SCs擴(kuò)增效率。一般認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原情況與造血干細(xì)胞相反，即 CD31、CD34 為陰性，CD29、CD44、CD71、CD90、CD105、CD106、CD271 等為陽性。根據(jù)這一特性，Jarocha等通過免疫磁珠分離純化CD105+CD271+的人骨髓MSCs并擴(kuò)增，表達(dá)CD105和CD271的成纖維細(xì)胞集落生成單位(Colony-forming unitfibroblastic,CFU-F)是未純化細(xì)胞的3-4倍。此外，其他一些影響MSCs體外擴(kuò)增的因素也陸續(xù)被報道。有研究者通過改善培養(yǎng)基質(zhì)實現(xiàn)MSCs的體外擴(kuò)增，Zangi等用纖維蛋白微珠可有效將MSCs從大鼠骨髓中分離并且擴(kuò)增。Kocaoemer等用人AB血清和凝血酶激活的富含血小板血衆(zhòng)(Thrombin-activated platelet-rich plasma)分別作為擴(kuò)增用血清,對人脂肪來源的MSCs進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果表明第6代MSCs的擴(kuò)增倍數(shù)分別為66. 6± 15. 7和68. I ±6. 7，而用胎牛血清擴(kuò)增的倍數(shù)僅為24. 4±0. 7。除基質(zhì)材料與血清的優(yōu)化外，一些生長因子也有利于MSCs的擴(kuò)增。如Tamama等證實表皮細(xì)胞生長因子(Epidermal growth factor,EGF)可通過使ERK及AKT磷酸化的途徑刺激人骨髓MSCs增殖，F(xiàn)arre等報道成纖維細(xì)胞生長因子-4 (Fibroblast growth factor-4, FGF-4)可使MSCs的復(fù)制周期顯著縮短且不改變其多向分化潛能。最近，Zscharnack等還發(fā)現(xiàn)氧濃度也可影響MSCs的擴(kuò)增,他們通過比較5%和20%的氧氣濃度下MSCs的擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)5%的氧濃度下MSCs形成的CFU-F比20%的氧氣濃度多2倍，并且老化程度也比20%的氧氣濃度輕。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的旨在針對MSCs體外大量擴(kuò)增，以及在擴(kuò)增時出現(xiàn)自主分化和伴隨的衰老及遷徙能力減退等問題，提供一種利用低劑量組蛋白去乙?；种苿┙鉀QMSCs體外大量擴(kuò)增的新方法。為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明公布了一種通過向MSCs培養(yǎng)基中添加低劑量組蛋白去乙?；种苿?Largazole，TSA)，經(jīng)過7天培養(yǎng)，可使MSCs體外增殖21倍，并保持其自我更新能力。為臨床疾病治療提供足夠數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明涉及MSCs增殖的方法，包含將適量的小分子化合物添加到MSCs的培養(yǎng)基中。如上所述的添加物，其化合物類型是組蛋白去乙?；敢种苿?HDACi)。研究發(fā)現(xiàn)，低劑量的去乙?；敢种苿㏕richostatin A(TSA)能使神經(jīng)干細(xì)胞重新表達(dá)0ct4等干性相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子，并使這些細(xì)胞額外獲得了形成造血細(xì)胞的能力。低濃度去乙酰化酶抑制劑VPA(150yg/mL)可以提高造血干細(xì)胞的自我更新和增殖能力。用組蛋白乙?；种苿゛nacardic acid(AA)的細(xì)胞治療法，可避免由c_MYC、PcG和pl6INK4A基因引起的復(fù)制性衰老，使干細(xì)胞保持較強(qiáng)的自我更新能力。從而推測干細(xì)胞分化和相關(guān)基因核心蛋白乙?；潭扔兄匾穆?lián)系。如上所述的添加物，其是組蛋白去乙?；种苿┲械腖argazole、TSA、VPA、NaBu等將其應(yīng)用于MSCs的培養(yǎng)基中。如上所述的添加物，其組蛋白去乙?；种苿㎜argazole或TSA在培養(yǎng)基中的濃度范圍是lpM/ml 10nM/ml之間。如上述所述的MSCs，其特征是優(yōu)先選取人成體MSCs ；如上述所述的MSCs，其特征是優(yōu)先選取成體骨髓MSCs ；如上述所述的MSCs，其特征是優(yōu)先選取人胎盤MSCs ；如上述所述的MSCs，其特征是優(yōu)先選取人脂肪MSCs ；如上述所述的MSCs，其特征是優(yōu)先選取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。根據(jù)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(hUC-MSCs)的生物學(xué)特性，細(xì)胞衰老分為三個階段早期(10代以內(nèi))，中期(10-15代)，晚期(16代以后)細(xì)胞到晚期后，各種生物學(xué)特性發(fā)生明顯變化，多能性基因表達(dá)量下降，衰老分化基因明顯增加。


圖I是實施方法一中評價不同濃度的Largazole對細(xì)胞增殖能力的影響圖。圖2是實施方法一中評價不同濃度的TSA對細(xì)胞增殖能力的影響圖。圖3是實施方法一中進(jìn)一步驗證上面兩種藥物的最佳濃度圖。圖4是實施方案二中CCK8法測定P16的各組細(xì)胞生長曲線圖。圖5是實施方案三中評價不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞增殖的影響圖。圖6是實施方案四中MSCs經(jīng)HDACi處理后4代相關(guān)基因表達(dá)的變化圖。圖7是實施方案四中MSCs經(jīng)HDACi處理后16代相關(guān)基因表達(dá)的變化圖。
具體實施例方式實施方法一.不同藥物濃度作用于細(xì)胞后對其增殖的影響a)選取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P4，以3000個/孔種植于96孔板中(設(shè)5個副孔)每孔100 μ L培養(yǎng)基(F12，10%胎牛血清(Hyclone)，青霉素，鏈霉素)，在細(xì)胞貼壁后對照組更換新鮮培養(yǎng)基，處理組培養(yǎng)基中分別含有終濃度分別為100nm/ml、IOnm/ml、1000pm/ml、100pm/ml、10pm/ml的Largazole,置于5%的C02、飽和濕度、37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后，通過CCK8法在酶標(biāo)儀上以490nm波長檢測細(xì)胞吸光度值(OD)，評價不同濃度的Largazole對細(xì)胞增殖能力的影響(圖I.)。參照圖I.可知Largazole在pm級濃度均有一定的增殖作用，且在10pm/ml附近促進(jìn)細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。b)選取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P4，以3000個/孔種植于96孔板中(設(shè)5個副孔)，在細(xì)胞貼壁后對照組更換新鮮培養(yǎng)基，處理組培養(yǎng)基中分別含有終濃度分別為100nm/ml、50nm/ml、20nm/ml、10nm/ml、5nm/ml的TSA，置于5%的C02、飽和濕度、37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5d后，通過CCK8法在酶標(biāo)儀上以490nm波長檢測細(xì)胞吸光度值(OD)，評價不同濃度的TSA對細(xì)胞增殖能力的影響(圖2.)。參照圖2可知，TSA在10nm/ml時OD值最高，也表明在此濃度下促進(jìn)細(xì)胞增殖能力最強(qiáng)。c)為了進(jìn)一步驗證上面兩種藥物的最佳濃度，選取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞P4，以
4.2X IO4個/孔種植于六孔板，貼壁后各組分別換用不同的培養(yǎng)基對照組普通培養(yǎng)基(F12，10%胎牛血清(Hyclone)，青/鏈霉素)TSA處理組含有終濃度為IOpM Largazole的普通培養(yǎng)基Largazole處理組含有終濃度為IOnM TSA的普通培養(yǎng)基置于5%的C02、飽和濕度、37度培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)48h，然后將細(xì)胞用胰酶消化，用血細(xì)胞計數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，評價各組細(xì)胞增殖能力的變化(圖3.)。如圖3.可知，處理組的細(xì)胞增殖率明顯高于對照組。實施方案二 . CCK8法測定P16的細(xì)胞生長曲線，取P16生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，用0. 25 %的胰酶消化制備單細(xì)胞懸液，以2000個/孔接種于96孔板貼壁后，各組分別換用不同的培養(yǎng)基對照組普通培養(yǎng)基(F12，10%胎牛血清(Hyclone)，青/鏈霉素)TSA處理組含有終濃度為IOpM Largazole的普通培養(yǎng)基Largazole處理組含有終濃度為IOnM TSA的普通培養(yǎng)基置于5%的C02、飽和濕度、37度培養(yǎng)箱中。每天各組取3孔細(xì)胞分別加入10μ LCCK8試劑，37度孵育4h，用酶標(biāo)儀檢測每孔吸光度值。以時間(天)為橫坐標(biāo)，OD值(代表細(xì)胞相對數(shù)量)為縱坐標(biāo)，連續(xù)觀察7天，繪制各組細(xì)胞生長曲線(圖4.)。從圖4可知，生長曲線分為潛伏期、對數(shù)生長期和平臺期，潛伏期在1-2天，對數(shù)生長期在2-5天，然后進(jìn)入平臺期，處理組TSA和Largazole在對數(shù)生長期細(xì)胞分別擴(kuò)增了 18和21倍，明顯高于對照組?？梢姷蛣┝拷M蛋白乙?；种苿┛梢栽诙虝r間內(nèi)極大地增加MSCs的數(shù)量。實施方案三.評價不同培養(yǎng)條件對細(xì)胞增殖的影響實驗在6孔板中進(jìn)行，每孔種入4. 2 X IO4個細(xì)胞，分組方法同方案2，各組均設(shè)3個平行組。細(xì)胞培養(yǎng)4天后進(jìn)行計數(shù)，再以相同的細(xì)胞個數(shù)進(jìn)行種板傳代，連續(xù)培養(yǎng)18代，計算CPDL (cumulative population doubling level),從而評價不同條件對細(xì)胞增殖的影響(圖5.)。在處理組，細(xì)胞的增殖潛能明顯高于對照組，隨著傳代的增加，處理組的增殖潛能依然良好。 實施方案四.MSCs經(jīng)HDACi處理后相關(guān)基因方面的改變。選取人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞按照方案2分組對照組普通培養(yǎng)基(F12，10%胎牛血清(Hyclone)，青/鏈霉素)TSA處理組含有終濃度為IOpM Largazole的普通培養(yǎng)基Largazole處理組含有終濃度為IOnM TSA的普通培養(yǎng)基將MSCs種入60mm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁后，分別換成各組藥用培養(yǎng)基孵育3天后，去上清液，用PBS沖洗兩遍,加入Iml的trizol,用吸管進(jìn)行吹打,使細(xì)胞脫壁,然后將其移至1.5ml的EP管中，室溫靜置5min。通過氯仿，異丙醇，乙醇將細(xì)胞中的RNA提取出來，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行RT-PCR和Real_timePCR實驗，檢測干細(xì)胞相關(guān)基因CXCR4，TERT,0CT4，Nanog的表達(dá)水平的變化(圖6.圖7.)。如圖6，7所示在MSCs的早期和晚期，遷徙因子CXCR4，與衰老相關(guān)的TERT，以及與多潛能性相關(guān)的干性基因0CT4，Nanog在處理組的表達(dá)量明顯增高。并且在細(xì)胞早期和晚期HDACi對MSCs保持自我更新和增殖能力都有著一定的作用。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明公布了一種高效擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的新方法，將適量的小分子化合物添加到MSCs的培養(yǎng)基中，從而使MSCs高效擴(kuò)增。
2.如權(quán)利I所述的小分子化合物，其特征是組蛋白去乙?；种苿?。
3.如權(quán)利I所述的小分子化合物，其特征是將組蛋白去乙?；种苿┑腖argazole、TSA、VPA、NaBu等添加于MSCs的培養(yǎng)基中。
4.如權(quán)利I所述的小分子化合物，其特征是組蛋白去乙酰化抑制劑Largazole或TSA在培養(yǎng)基中的最終濃度范圍是在ΙρΜ/ml ΙΟηΜ/ml之間。
5.如權(quán)利I所述的MSCs，其特征是選取成體MSCs。
6.如權(quán)利I所述的MSCs，其特征是選取人成體MSCs。
7.如權(quán)利I所述的MSCs，其特征是選取人臍帶MSCs。
8.如權(quán)利I所述的MSCs，其特征是選取人骨髓MSCs。
9.如權(quán)利I所述的MSCs，其特征是選取人胎盤MSCs。
10.如權(quán)利I所述的MSCs，其特征是選取人脂肪MSCs。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，公開了一種高效擴(kuò)增間充質(zhì)干細(xì)胞的新方法。在體外擴(kuò)增中，通過向間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中添加低劑量的組蛋白去乙?；种苿梢杂行У靥岣唛g充質(zhì)干細(xì)胞的體外擴(kuò)增，并保持其自身的自我更新能力。為臨床疾病治療提供足夠數(shù)量的間充質(zhì)干細(xì)胞。
文檔編號C12N5/0775GK102876629SQ20121018493
公開日2013年1月16日 申請日期2012年6月6日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月6日
發(fā)明者李富榮, 齊暉, 王云帥, 鄧春艷 申請人:深圳市人民醫(yī)院