專利名稱：一種雜合木聚糖酶atxb的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域中利用基因工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)酶分子進(jìn)行改造，獲得底物結(jié)合能力強(qiáng)、水解性能好的重組酶基因，生產(chǎn)重組木聚糖酶的方法。
背景技術(shù)：
木聚糖酶具有廣泛的エ業(yè)應(yīng)用價(jià)值(Subramaniyan S et al. 2002)。木聚糖酶應(yīng)用在飼料エ業(yè)中，可提高飼料(尤其是糠麩類)的營養(yǎng)價(jià)值，促進(jìn)動(dòng)物生長；在造紙和紙漿エ業(yè)中，木聚糖酶的使用可減少化學(xué)漂白劑的使用量，有利于環(huán)境保護(hù)；在食品エ業(yè)中，木聚糖酶可用于面包制作、果汁澄清、釀造業(yè)和制備功能性低聚木糖。但是在這些實(shí)際應(yīng)用中，木聚糖酶的底物并不是単一的木聚糖而是多糖復(fù)合物。如在糠麩類飼料原料中，除了可溶性木聚糖外，還有大量的不溶性木聚糖、淀粉、木質(zhì)素和纖維素等其它物質(zhì)(Coughlan etal., 1993)。因此如何提高木聚糖酶吸附在多糖復(fù)合體上尤其是不溶性木聚糖、淀粉、木質(zhì)素和纖維素等上，高效發(fā)揮木聚糖酶水解性能使其適應(yīng)エ業(yè)應(yīng)用至關(guān)重要。在エ業(yè)應(yīng)用上，木聚糖酶的理想特性是同時(shí)具有較寬的最適溫度和pH、良好的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性，以及具備較好的底物結(jié)合、水解性能，然而此類理想型的木聚糖酶很難從自然界直接獲取，需要利用基因工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)酶分子進(jìn)行改造，使木聚糖酶的性質(zhì)更好適應(yīng)相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展需要。木聚糖酶是可以將木聚糖降解成低聚木糖(xylooligosaccharides, XOs)和木糖(xylose) 一類水解酶的總稱。根據(jù)催化結(jié)構(gòu)域氨基酸同源性和疏水簇分析法，木聚糖酶屬于糖苷水解酶第10和第11家族(family)。ー些F/10家族木聚糖酶和纖維素酶在水解過程中，首先通過其底物結(jié)合域(木聚糖結(jié)合域、纖維素結(jié)合域)或結(jié)合位點(diǎn)錨定在多糖復(fù)合體上，使其催化中心更容易靠近底物，便于發(fā)揮水解功能(Kuno et al., 2000)。F/10家族的Pseudomonas f luorescens XylA含一個(gè)催化結(jié)構(gòu)域和一個(gè)木聚糖結(jié)合域，二者由一段富含絲氨酸的連接序列相連，將木聚糖結(jié)合域和連接序列分別除去后所得的截短型木聚糖酶對(duì)可溶木聚糖的水解能力無明顯變化，但它們對(duì)不溶性底物的結(jié)合、水解能力顯著降低(Kulkarni et al. ,1999)。國內(nèi)外關(guān)于木聚糖結(jié)合域的研究報(bào)道多集中在F/10家族木聚糖酶上(Din etal.，2000 ;劉明啟等，2003)。F/10家族木聚糖酶的木聚糖結(jié)合域可以結(jié)合不溶性木聚糖和微晶纖維素，其功能和纖維素酶的纖維素結(jié)合域類似，但絕多數(shù)G/11家族木聚糖酶不具備木聚糖結(jié)合域，因此在水解天然底物(如麥麩、稻谷和秸桿等)時(shí)，酶分子與纖維素和木 質(zhì)素之間存在空間位阻作用，妨礙酶分子的水解作用(Sunna ei a人，2000)。木聚糖酶的進(jìn)化可能是通過酶蛋白分子結(jié)構(gòu)域之間的隨機(jī)拼接重組而實(shí)現(xiàn)的(Gilkes et al.，1991 ；Kulkarni et a人，1999)，酶蛋白分子中結(jié)構(gòu)域的插入，剔除和置換都有可能導(dǎo)致酶蛋白結(jié)構(gòu)功能的顯著變化(Shen et al.，1991 ；Black et al.，1996 ；Black et al.，1997 ；Sunna etal. ,2000; Lemos et al. ,2003 ；Mangala et al. ,2003 ；Latorre-Garcia et al. ,2005)。因此，利用基因工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)酶分子進(jìn)行改造，使木聚糖酶能優(yōu)先吸附于纖維素上，就可使其與底物靠近，從而可以更有效地發(fā)揮水解作用。褐色高溫單抱菌木聚糖酶A (Thermomonospora fusca xylanase,是 G/11家族中為數(shù)不多存在木聚糖結(jié)合域和連接序列的酶分子。褐色高溫單孢菌木聚糖酶A雖然不具備水解纖維素的能力，但對(duì)其具有較高的吸附結(jié)合性能(Irwin et a人，1994)。綜上所述，利用基因工程或蛋白質(zhì)工程技術(shù)對(duì)酶分子進(jìn)行改造，獲得較強(qiáng)底物結(jié)合力和水解性能的雜合木聚糖酶是可行的。在飼料エ業(yè)中，這種人工構(gòu)建的雜合木聚糖酶兼?zhèn)淠揪厶敲负屠w維素酶活性具有特殊優(yōu)勢，單胃動(dòng)物日糧中纖維素酶和木聚糖酶可以協(xié)同作用提高飼料(尤其是糠麩類)消化吸收率，促進(jìn)動(dòng)物生長，大大降低成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是解決以上提出的問題，提供一種雜合木聚糖酶atxb的制備方法。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的
一種雜合木聚糖酶atxb的制備方法，包括將來源于褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結(jié)合域融合在雜合木聚糖酶atx的C-末端,獲得雜合木聚糖酶atxb(SED IDN0:2)。作為優(yōu)選，本發(fā)明還包括以下步驟
(1)雜合木聚糖酶基因atxb的構(gòu)建
以pBS-T/ atx載體(T-載體購自Promega公司)為模板，Xl和Χ2為引物擴(kuò)增atx片段；以pBS-T /tfx載體(T-載體購自PiOmega公司)為模板，X3和X4為引物擴(kuò)增xbd片段；以上述atx和xbd為模板，Xl和X4為引物，PCR擴(kuò)增得到雜合木聚糖酶基因aid (SED IDN0:1)；
Xl :5’ - CG'AATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCG-3’
X2 :5’ -GTTGTCACCGCCGCTGGTGCCAGAGGAAATCGTGACACTGGC-3’
X3 :5， -GGCACCAGCGGCGGTGACAACCCCG-3，
X4 :5’ -GCTGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCT-3’ ；
(2)采用pBS-T載體體系試劑盒(購自Promega公司)將割膠回收的atxb片段與T載體連接，得到pBS-T/ atxb載體；
(3)雜合木聚糖酶基因atxb在畢赤酵母(購自Invitrogen公司)中分泌表達(dá) pBS-T/ atxb載體經(jīng)及 0ガ/、/雙酶切、割膠回收目的條帶，回收的atxb與同樣經(jīng)
過雙酶切的PPIC9K連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPIC9K/atxb ;大量提取重組表達(dá)質(zhì)粒，用Bgl Π限制性內(nèi)切酶將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/atxb線性化，濃縮線性化重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K/atxb,電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞(購自Invitrogen公司)，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，陽性轉(zhuǎn)化子分泌表達(dá)雜合木聚糖酶atxb (SED ID N0:2)。本發(fā)明的有益效果(優(yōu)點(diǎn))如下
(I)采用SOE實(shí)現(xiàn)atx基因片段和褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結(jié)合域的連接，該方法在構(gòu)建雜合基因構(gòu)建過程中不額外引入氨基酸序列，這是其最大的優(yōu)勢；現(xiàn)在絕大多數(shù)雜合酶的構(gòu)建采用限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)的粘性末端連接，這樣會(huì)引入額外的喊基。(2)獲得的雜合酶對(duì)不溶性底物有較強(qiáng)的結(jié)合能力，且能夠水解纖維素，具備多功能酶的特征；現(xiàn)發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)野生木聚糖酶不具備結(jié)合、水解纖維素的能力。(3)該雜合酶水解樺木木聚糖所得的主要為低聚木糖，主要產(chǎn)物為木ニ糖和木三糖。木ニ糖和木三糖是功能性低聚木糖的主要成分，其益生作用顯著高于其他低聚木糖。(4)該雜合基因表達(dá)采用的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具備安全，不分泌毒性代謝產(chǎn)物且易培養(yǎng)的特點(diǎn)，較大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢。該特點(diǎn)使得雜合酶atxb的發(fā)酵生產(chǎn)具有明顯優(yōu)勢。


圖I是雜合木聚糖酶基因atxb序列及其推譯的氨基酸序列。圖2是本發(fā)明實(shí)施例的雜合木聚糖酶atx和atxb、木聚糖酶tfx分子結(jié)構(gòu)示意圖。圖3是本發(fā)明實(shí)施例的是木聚糖酶基因片段atx及atxb的PCR擴(kuò)增。圖4是本發(fā)明實(shí)施例的T0P10F’ /pPIC9K_atxb轉(zhuǎn)化子PCR鑒定。圖5是本發(fā)明實(shí)施例的pPIC9K_atxb雙酶切電泳圖。圖I中，方框氨基酸序列為連接序列，下畫線的氨基酸序列為木聚糖結(jié)合域，其余氨基酸序列(303-314除外)來自atx。圖2中，⑶為催化結(jié)構(gòu)域，LS為連接序列，XBD為木聚糖結(jié)合域。圖3中，M為DNA Marker, I以pBS-T/ atx載體為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(atx)，2以pBS-T /tfx載體為模板PCR擴(kuò)增產(chǎn)物{XBD、，3雜合木聚糖酶基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物(atxb)。圖4中，M為DNA Marker, 1-3為不同轉(zhuǎn)化子的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖5中，M為DNA Marker, I為雜合木聚糖酶基因atxb的PCR產(chǎn)物，2為pPIC9K-atxb 皆_EcoRI 和 Afoi / 雙酶切。
具體實(shí)施例方式下面通過具體實(shí)施方式
對(duì)本發(fā)明作進(jìn)ー步詳細(xì)說明
木聚糖結(jié)合域在酶分子與不溶底物結(jié)合中起至關(guān)重要的作用。在已成功構(gòu)建能編碼優(yōu)良性能木聚糖酶的重組基因基礎(chǔ)上(GenBank Accession No. AY858101 )，為了提高雜合木聚糖酶atx對(duì)纖維素類不溶性底物的結(jié)合和水解能力，將來源于褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結(jié)合域融合在雜合木聚糖酶atx的C-末端,并在畢赤酵母中分泌表達(dá)，獲得雜合木聚糖酶atxb，其具備結(jié)合水解纖維素的能力。本發(fā)明獲得高底物結(jié)合和水解性能的重組木聚糖酶atxb的方法，包括以下步驟 構(gòu)建融合木聚糖酶結(jié)合域的雜合木聚糖酶基因；
本發(fā)明的木聚糖酶基因是來源于褐色單孢菌和枯草芽孢桿菌的重組基因atx，重組基因能較好耐受飼料制粒等的高溫，重組基因GenBank登錄號(hào)為AY858101。
在分子結(jié)構(gòu)上,褐色高溫單孢菌木聚糖酶A (Genebank U01242)的顯著特征之ー就是存在連接序列和木聚糖結(jié)合域(Ghangas et al. , 1989 ；Irwin et al. ,1994)。在已獲得的雜合木聚糖酶基因atx中引入褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列木聚糖結(jié)合域編碼序列，獲得另外一個(gè)雜合木聚糖酶基因atxb (圖1,2)。為了便于atxb在畢赤酵母中的表達(dá)，在全長基因PCR擴(kuò)增的外側(cè)引物中(XI和X4)分別引入及^？/和#oi/限制性內(nèi)切酶識(shí)別位點(diǎn)。以pBS-T/ atx載體為模板，Xl和X2為引物擴(kuò)增atx片段，得到約600 bp條帶，理論長度為601 bp (圖3);以pBS-T /tfx載體為模板，X3和X4為引物擴(kuò)增xbd片段，得到約300 bp條帶，理論長度為362 bp (圖3);以上述atx和XBD為模板，Xl和X4為引物，PCR擴(kuò)增得到雜合木聚糖酶基因atxb，長度為942 bp，其編碼314個(gè)氨基酸(圖3)。 雜合木聚糖酶基因atxb在畢赤酵母中分泌表達(dá)。pBS-T atxb載體經(jīng)/雙酶切、割膠回收目的條帶?；厥盏腶txb與同樣經(jīng)過雙酶切的PPIC9K連接，并轉(zhuǎn)化并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為PPIC9K-atxb0大量提取重組表達(dá)質(zhì)粒，用Bgl Π限制性內(nèi)切酶將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K- atxb線性化，濃縮線性化重組表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K- atxb,電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GSl 15感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子。酵母中表達(dá)產(chǎn)物的木聚糖酶和纖維素酶活性測定。atxb木聚糖酶的最適溫度和最適pH分別為60°C和pH5. O ;木聚糖酶在pH4. 0-9. O范圍內(nèi)穩(wěn)定性較好。atxb能夠結(jié)合微晶纖維素并具有纖維素酶的活性，纖維素酶的最適溫度和最適pH分別為60°C和ρΗ6· O。以下三個(gè)實(shí)施例詳細(xì)闡明了本發(fā)明的具體實(shí)施方式
。實(shí)施例I :雜合木聚糖酶基因atxb的構(gòu)建
I、材料的準(zhǔn)備
基因材料雜合木聚糖酶基因atx和褐色高溫單孢菌木聚糖酶A基因，分別位于pBS-T /atx 載體和 pBS-T /tfx 載體中。菌種大腸桿菌T0P10F’購自Invitrogen公司。穿梭載體pPIC9K,購自Invitrogen公司，表達(dá)宿主菌畢赤酵母GS115,購自Invitrogen公司。高保真DNA聚合酶、平端DNA片段加A試劑盒購自上海Sangon公司，各種限制性內(nèi)切酶和T-載體購自Promega公司。化學(xué)試劑酵母浸膏和胰蛋白胨購自O(shè)XOID公司，組織培養(yǎng)用試劑和樺木木聚糖購自Sigma公司。其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。引物合成上海Sangon公司或上海博亞生物技術(shù)有限公司，測序由上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。2、雜合木聚糖酶基因atxb的構(gòu)建
根據(jù)雜合木聚糖酶基因atx序列和褐色高溫單孢菌木聚糖酶A木聚糖結(jié)合域序列設(shè)計(jì)4條引物，由上海Sangon公司合成。XI、X4為外側(cè)引物，X2、X3為嵌合引物，為了后續(xù)目的基因能夠定向插入到表達(dá)載體上，在外側(cè)引物Xl和X4中分別弓I入及^ /和No11限制性內(nèi)
切酶識(shí)別位點(diǎn)。
權(quán)利要求
1.一種雜合木聚糖酶atxb的制備方法，其特征在于將來源于褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結(jié)合域融合在雜合木聚糖酶atx的C-末端，獲得雜合木聚糖酶atxb (SED ID NO:2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的制備方法，其特征在于包括以下步驟 (1)雜合木聚糖酶基因atxb的構(gòu)建 以pBS-T atx載體為模板，Xl和X2為引物擴(kuò)增atx片段；以pBS_T tfx載體為模板，X3和X4為引物擴(kuò)增xbd片段；以上述atx和xbd為模板，Xl和X4為引物，PCR擴(kuò)增得到雜合木聚糖酶基因atxb (SED ID NO: I)；Xl :5’ - CG'AATTCGCTGTTACATCCAACGAGACCG-3’X2 :5’ -GTTGTCACCGCCGCTGGTGCCAGAGGAAATCGTGACACTGGC-3’X3 :5， -GGCACCAGCGGCGGTGACAACCCCG-3，X4 :5，-GCTGGCCGCGTGGTGGTGGTGGTGGTGCT-3，； (2)采用pBS-T載體體系試劑盒將割膠回收的atxb片段與T載體連接，得到pBS_Tatxb載體； (3)雜合木聚糖酶基因atxb在畢赤酵母中分泌表達(dá) pBS-T atxb載體經(jīng)EcoRI、Not I雙酶切、割膠回收目的條帶，回收的atxb與同樣經(jīng)過雙酶切的PPIC9K連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，獲得的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pPIC9K-atxb ;大量提取重組表達(dá)質(zhì)粒，用Bgl II限制性內(nèi)切酶將重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K_atxb線性化，濃縮線性化重組表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-atxb，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性轉(zhuǎn)化子，得到雜和木聚糖酶atxb (SED ID NO:2)。
全文摘要
一種雜合木聚糖酶atxb的制備方法，將來源于褐色高溫單孢菌木聚糖酶A的連接序列和木聚糖結(jié)合域融合在雜合木聚糖酶atx的C-末端，獲得雜合木聚糖酶atxb。該雜合酶水解樺木木聚糖所得的主要為低聚木糖，主要產(chǎn)物為木二糖和木三糖，木二糖和木三糖是功能性低聚木糖的主要成分，其益生作用顯著高于其他低聚木糖；另外，該雜合基因表達(dá)采用的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)具備安全，不分泌毒性代謝產(chǎn)物且易培養(yǎng)的特點(diǎn)，較大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有明顯的優(yōu)勢，該特點(diǎn)使得雜合酶atxb的發(fā)酵生產(chǎn)具有明顯優(yōu)勢。
文檔編號(hào)C12N9/42GK102676479SQ20121018416
公開日2012年9月19日 申請日期2012年6月2日 優(yōu)先權(quán)日2012年6月2日
發(fā)明者劉明啟, 孫建義, 翁曉燕, 詹儀花 申請人:浙江大學(xué)