專利名稱：抗口蹄疫AsiaI型病毒的雙峰駝VHH重鏈抗體及其制備方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種抗體及其制備方法和用途，特別涉及ー種抗ロ蹄疫AsiaI型病毒的雙峰駝VHH重鏈抗體。此外，本發(fā)明還涉及到該抗體的制備方法、功能鑒定和用途。本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
ロ 蹄疫(Foot-and-Mouth Disease, FMD)是由 ロ 蹄疫病毒(Foot-and-MouthDisease Virus, FMDV)引起的以偶蹄動(dòng)物發(fā)病為主的ー種急性、熱性、高度接觸性、烈性動(dòng)物傳染病，是世界范圍內(nèi)對(duì)畜牧業(yè)發(fā)展威脅最大的ー種動(dòng)物傳染病。ロ蹄疫傳染性極強(qiáng)、發(fā)病率極高，對(duì)幼畜的致死率有時(shí)可達(dá)100%，故被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為動(dòng)物14種A類傳染病之首，我國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生部門也將其列為ー類傳染病。FMDV是小RNA病毒科，ロ蹄疫病毒書的成員，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)7個(gè)血清型，即O、A、C，SAT1、SAT2、SAT2、和AsiaI型，不同血清型之間不存在交叉反應(yīng)和保護(hù)。完整AsiaI型病毒粒子包括衣殼和RNA兩部分，其中結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP3和VPl構(gòu)成病毒衣殼衣殼蛋白是刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性中和抗體的最主要部分，也是區(qū)分血清型的抗原表位所在。目前，流行ロ蹄疫國(guó)家主要通過接種滅活疫苗作為防止疫病發(fā)生的唯一手段。經(jīng)過了高密度、大范圍的不斷疫苗接種，疫病流行得到有效控制，但偶蹄獸家畜活體帶毒感染動(dòng)物仍然隱藏在畜群中，是最危險(xiǎn)的潛在傳染源。消滅ロ蹄疫的發(fā)達(dá)國(guó)家，通過疫苗免疫和捕殺病原陽性動(dòng)物的方式達(dá)到疾病浄化，但世界范圍內(nèi)爾頻繁的畜產(chǎn)品自由貿(mào)易，使這些國(guó)家時(shí)刻面臨疫病爆發(fā)的危險(xiǎn)。面對(duì)如此嚴(yán)峻的疫病形式，建立快速、敏感、特異的病原診斷方法就變得尤為重要。OIE推薦的抗原診斷方法，包括病毒分離、多克隆抗血清為基礎(chǔ)的美聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和病毒核酸檢測(cè)方法RT-PCR，這些方法需要在具有專門儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)人員的條件下進(jìn)行操作，同時(shí)需要用其余的血清型抗體作為對(duì)照。如果能夠獲得具有某一血清型具有型特異性的抗體，那么就可以推動(dòng)對(duì)于ロ蹄疫疫情的診斷速度和準(zhǔn)確性，從而及早采取措施控制疾病流行，減少造成的經(jīng)濟(jì)損失。1993年，Hamers等發(fā)現(xiàn)駱駝和鯊魚等體內(nèi)存在ー種天然缺失輕鏈，僅有重鏈的抗體，稱為重鏈抗體(HCAbs)。這類抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)僅由重鏈可變區(qū)單域結(jié)構(gòu)域組成，稱為單域重鏈抗體(variable domain of the heavy chain of HCAbs, VHH)。雖然缺失可變區(qū)，VHH卻仍同普通抗體一祥保持著良好和特異的抗原結(jié)合能力，它是目前可以得到的具有完整功能的最小抗體分子片段，分子量?jī)H為15kD，是常規(guī)抗體的1/10，單克隆抗體的1/3，分子高度4. 8nm,直徑2. 2納米,也稱為納米抗體(nanobody)。該類抗體具有伸展的抗原互補(bǔ)結(jié)合區(qū)以及更高的組織穿透性和更小的分子個(gè)體，可以結(jié)合一些常規(guī)抗體無法接觸的抗原表位，充分發(fā)揮抗體的生物學(xué)功能。另外，VHH具有易表達(dá)、水溶性好、耐高溫、耐極度pH值等獨(dú)特性質(zhì)，其作為小型化基因工程抗體在基礎(chǔ)研究、小分子抗體藥物和高靈敏度診斷試劑研發(fā)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。目前，駱駝VHH單域重鏈抗體研究在歐美國(guó)家已成為研究熱點(diǎn)。Lorena利用輪狀病毒VP6蛋白免疫羊駝獲得了具有中和活性的VHH，能夠用來治療小鼠腹瀉。早期診斷和治療效果跟蹤始終是癌癥診斷的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)。Cortez-Retamoz利用小分子量VHH具有良好組織滲透性、高親和カ和不損傷正常組織的特性，以其作為顯影劑可在體內(nèi)快速而準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤位置。由于VHH均具有高抗原特異性和親和力，可用于靶向腫瘤特異抗原，將腫瘤治療藥物直接作用于病灶，發(fā)揮有效的殺傷腫瘤作用。國(guó)內(nèi)在駱駝VHH研究仍處于起步階段。嚴(yán)安等利用H5N1禽流感病毒抗原免疫羊駝，構(gòu)建了抗H5N1VHH免疫庫(kù)，并初級(jí)庫(kù)中存在具有潛在中和活性的抗H5N1VHH抗體，為H5N1的早期診斷和臨床治療奠定基礎(chǔ)。利用雙峰駝制備Asia I型免疫抗體庫(kù)，從而篩選得到能夠與ロ蹄疫Asia I型病毒抗原特異性結(jié)合VHH重鏈抗體，來研制病原快速診斷方法在國(guó)內(nèi)外尚無報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之ー是提供ー種抗ロ蹄疫AsiaI型病毒的雙峰駝VHH重鏈抗體；
本發(fā)明的目的之ニ是提供編碼所述雙峰駝VHH重鏈抗體的核苷酸序列；本發(fā)明的目的之三提供所述的雙峰駝VHH重鏈抗體或其編碼序列在制備檢測(cè)ロ蹄疫AsiaI型病毒試劑中的應(yīng)用。為了達(dá)到所述的目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)手段本發(fā)明利用噬菌體展示技術(shù)建立AsiaI VHH免疫抗體庫(kù)，經(jīng)過三次大量連接和轉(zhuǎn)化，隨機(jī)選擇15個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果表明，15個(gè)克隆的片段均為編碼重鏈抗體的可變區(qū)的基因，計(jì)算得到庫(kù)容為I. 13X108的駱駝免疫單域抗體庫(kù)，將該抗體庫(kù)命名為NA L-Asial，從中篩選出具有高特異性和抗原結(jié)合能力的單域抗體。本發(fā)明的一種抗ロ蹄疫病毒AsiaI型的雙峰駝VHH重鏈抗體，其特征在于所述的抗體具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列(a) SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或(b)與SEQ ID NO. I所示的序列同源性在98%以上的氨基酸序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的與SEQ ID NO. I所示的序列同源性在98%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。本發(fā)明提供了編碼所述的雙峰駝VHH重鏈抗體的核苷酸序列。在本發(fā)明中，優(yōu)選的，所述的核苷酸序列具有SEQ ID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQID NO. 6所示的序列。進(jìn)ー步的，本發(fā)明還提供了一種重組表達(dá)載體，其特征在于含有以上所述的核苷酸序列。更進(jìn)一歩，本發(fā)明還提供了ー種宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為含有以上所述的核苷酸序列的真核或原核細(xì)胞。優(yōu)選的，所述的宿主細(xì)胞為含有以上所述的表達(dá)載體的真核或原核細(xì)胞，更優(yōu)選的所述的宿主細(xì)胞為大腸桿菌TGl或大腸桿菌HB2151。再進(jìn)ー步的，所述的雙峰駝VHH重鏈抗體在制備檢測(cè)或診斷ロ蹄疫AsiaI型病毒感染試劑中的應(yīng)用。及所述的核苷酸序列在制備檢測(cè)或診斷ロ蹄疫AsiaI型病毒感染試劑中的應(yīng)用。
本發(fā)明首次利用重組的AsiaI型病毒樣顆粒抗原免疫雙峰駝，利用噬菌體展示技術(shù)建立AsiaI VHH免疫抗體庫(kù)，篩選與ロ蹄疫AsiaI型病毒抗原具有良好親和カ的高特異性單域抗體，本發(fā)明的Asia I VHH重鏈抗體對(duì)于研究Asia I病毒感染機(jī)理和建立高度敏感和特異的抗原快速檢測(cè)或診斷試劑具有重要意義。


圖I為雙峰駝外周血淋巴細(xì)胞RNA提取結(jié)果；I 總 RNA ；2 DL2000 標(biāo)準(zhǔn)分子量圖2為VHH基因第一輪PCR擴(kuò)增結(jié)果；M DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量；I. PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
圖3為VHH基因第二輪PCR擴(kuò)增結(jié)果；I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量圖4為VHH基因第三輪PCR擴(kuò)增結(jié)果； I PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M DL2000標(biāo)準(zhǔn)分子量圖5.為雙峰駝VHH 4、5和6號(hào)克隆的PCR電泳結(jié)果；M DL2000Marker圖6為雙峰駝VHH 4、5和6克隆的SDS-PAGE結(jié)果；M =Protein Marker (85\50\35\25\20kDa) ；IB :包涵體；S :可溶性；C1~2 :空載體表達(dá)對(duì)照?qǐng)D7為pE-Sumo的載體示意圖。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)驗(yàn)并結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)ー步說明，應(yīng)該理解的是，這些實(shí)施例僅用于例證的目的，決不限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員理解，在本發(fā)明權(quán)利要求所限定的精神和范圍內(nèi)可對(duì)其進(jìn)行許多改變，修改，甚至等效變更，但都將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)施例II.材料與方法I. I 材料I. I. I試驗(yàn)動(dòng)物、抗原、佐劑和AsiaI抗體檢測(cè)試劑盒I峰雄性雙峰駝(I周歲)，I峰雌性雙峰駝(6月齡)；重組AsiaI/YNBS/58株VLPs抗原，AsiaI/YNBS/58 (ロ蹄疫病毒AsiaI/YNBS/58株全基因組序列分析，常惠蕓等，病毒學(xué)報(bào)，2007(5) :407-411)全病毒滅活抗原；206佐劑；FMDV AsiaI型抗體液相ELISA檢測(cè)試劑盒由蘭州獸醫(yī)研究所研制提供。I. I. 2菌株、輔助噬菌體和試劑大腸桿菌TGl和HB2151、輔助噬菌體M13K07、載體pHEN2，由王祥斌博士惠贈(zèng)。表達(dá)載體pE-Sumo (Kanr, LifeSensors, Inc,載體圖譜如圖7所示。)，限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB、淋巴細(xì)胞分離液(I. 077)購(gòu)自上海生エ、Trizol、鎳親和層析樹脂、DNA片段回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒為OMEGA產(chǎn)品、PCR相關(guān)試劑購(gòu)自寶生物公司、分子生物學(xué)試劑來自Sigma公司；其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。I. 2 方法I. 2. I抗原接種劑量、免疫程序和血清抗體效價(jià)的測(cè)定在雙峰駝的頸部皮下、背部皮下、腹部皮下和后腿皮下進(jìn)行分點(diǎn)接種重組AsiaI/YNBS/58株VLPs抗原，重組VLPs抗原由表達(dá)的VPl抗原、VP3抗原以及VP2-VP4抗原通過自組裝后形成的病毒樣顆?？乖?VLPs)，其中編碼VPl抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示，編碼VP3抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示，編碼VP2-VP4抗原的核苷酸序列如SEQ ID NO. 9所示，每個(gè)部位不少于3個(gè)接種點(diǎn)。首次免疫前和毎次免疫后采集靜脈血，用FMDVAsiaI型抗體液相ELISA檢測(cè)試劑盒檢測(cè)血清抗體效價(jià)，第四次免疫后5天，靜脈采血。具體動(dòng)物免疫程序和抗原接種劑量見表I :表I雙峰駝免疫程序和抗原劑量
免疫次數(shù)
Γ 免免.......i 免 _ 免
割 iHug)5080HO 200
與 免M隔時(shí)PtJ (人)O2135 49I. 2. 2淋巴細(xì)胞分離第四次免疫后5天，靜脈采集抗凝血，用比重為1.077的淋巴細(xì)胞分離液，通過密度梯度離心分離外周血淋巴細(xì)胞，用MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌分離的淋巴細(xì)胞，然后置于6孔板中在37°C孵育I小時(shí)，去除細(xì)胞碎片和大部分單核細(xì)胞，取懸浮細(xì)胞上清液并且計(jì)數(shù)后備用。I. 2. 3細(xì)胞總RNA的提取和RT-PCR利用Trizol抽提分離的淋巴細(xì)胞總RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增合成cDNA。I. 2. 4VHH基因擴(kuò)增，噬菌體展示載體的構(gòu)建和庫(kù)容量計(jì)算根據(jù)參考文獻(xiàn)(抗H5N1禽流感病毒VHH抗體庫(kù)的構(gòu)建，嚴(yán)安等，中國(guó)免疫學(xué)雜志2011 年果 27 卷；及 A single-step procedure of recombinant library constructionfor the selection of efficiently produced llama VH Dinders directed againstcancer markers， Damjana Kastelic et.al， Journal of Immunological Methods350 (2009)54-62 ；及 Llama-Derived Single-Chain Antibody Fragments Directed toRotavirus VP6 Protein Possess Broad Neutralizing Activity In Vitro and ConferProtection against Diarrhea in Mice， Lorena Garaicoechea et.al， JOURNAL OFVIROLOGY，Oct. 2008，p. 9753 - 9764)設(shè)計(jì)3對(duì)引物，以擴(kuò)增得到的cDNA為模板擴(kuò)增VHH基因片段，進(jìn)行三輪擴(kuò)增，引物序列見表2。表2VHH基因片段擴(kuò)增用引物擴(kuò)增輪次づ_(tái)片段(一)
第-輪擴(kuò)增 Hl SOTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG-3^兩條片段(900,600)，
GI 5f-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-35| i收 600
H2 S'-ggattgttaitacicgcggcccagccggccatggct-450 (Sjn)
第.輪ぎ.增SAKGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-35
H3 5f-gccccgtgatggigalgatgaigtgcg
gcTGAGGAGACRGTGACCWG^l Pl S'-ggaiigiiallaclcgcg -3'450 (Noil)■:輪il 'if! TN i^aMCggccgcgacaclggactacagalccicllctgaga· tgagiuttgucigcggccccglgatggtgaigalg-35以cDNA為模板，H1、G1為上下游引物擴(kuò)增得到大小分別為600bp和900bp的2條帶，回收600bp條帶作為模板，進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增。以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，H2、H3為上下游引物得到約大小450bp條帶。以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以P1，TN為上下游引物進(jìn)行第三輪擴(kuò)增，得到約450bp條帶。將第三輪PCR產(chǎn)物經(jīng)過Sfil/Notl雙酶切后，連入pHEN2載體，利用電轉(zhuǎn)化方法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TGl中，電轉(zhuǎn)結(jié)束后，菌液37°C，180r/min搖床培養(yǎng)Ih，離心濃縮后涂氨芐抗性的2YTG平板(2%葡萄糖+AmpkZXYTdYTGX同時(shí)取10 μ L稀釋至I X IO4倍進(jìn)行涂板，37°C過夜培養(yǎng)，用于計(jì)算庫(kù)容。37°C倒置培養(yǎng)16小時(shí)后，用IOmL的2XYT培養(yǎng)基將培養(yǎng)板上長(zhǎng)出的菌苔刮洗干凈，加入終濃度25%的甘油，分裝保存在_70°C備用，此為獲得的抗FMDV AsiaI型抗體VHH重鏈抗體免疫庫(kù)。電轉(zhuǎn)化后的隨機(jī)挑選電轉(zhuǎn)后的克隆，抽提質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，鑒定抗體庫(kù)的多祥性，根據(jù)多樣性和克隆數(shù)目來計(jì)算庫(kù)容量。I. 2. 5制備噬菌體抗體庫(kù)和初步篩選(I)取一支凍存的VHH重鏈抗體庫(kù)，接種于500mL的2YTG培養(yǎng)基中，37°C，250rpm/min震蕩培養(yǎng)至菌體濃度為OD6tltlたO. 8-0. 9。(2)加入輔助噬菌體M13K07至終濃度5\109 扣/111し37で靜置301^11 ;然后在37°C條件下，200rpm/min,溫和培養(yǎng)60min。(3) 2200g, 15min離心收集細(xì)菌沉淀,重新用等體積的2YT_AK( 100 μ g Ampr, 50 μ gKanr)培養(yǎng)基懸浮沉淀，30°C，300rpm/min過夜培養(yǎng)。(4) 7000g, 4°C離心15min，將上清轉(zhuǎn)移至IL預(yù)冷的三角瓶中，加入O. 3體積的噬菌體沉淀，溫和混勻后，冰浴lh。(5) 7000g, 4°C離心15min,棄凈上清,用8mL PBS重懸沉淀。(6) 12000g離心10分鐘，收集上清，然后滴定抗體庫(kù)滴度，分成小份的噬菌體保存
在 4°C。I. 2. 6抗體庫(kù)的淘洗(I)抗原包被在96孔酶標(biāo)板中用碳酸鹽緩沖液(pH9. 6)1 4包被ロ蹄疫AsiaI全病毒滅活抗原，100 μ L/孔，4°C包被過夜,制成抗體淘洗板。(2)封閉棄去孔內(nèi)液體，加入10(^17孔封閉液び85了+5%脫脂奶粉+5%蔗糖)，37°C 封閉 2h?；旌鲜删w抗體庫(kù)和等體積的封閉液，30°C預(yù)封閉30min (注意第一輪淘洗噬菌體顆粒的數(shù)量應(yīng)該比文庫(kù)大小高100倍，例如如果文庫(kù)大小為IOltlCfU,淘洗時(shí)最好加入IO12Cfu,)。(3)將預(yù)封閉后的抗體庫(kù)混合物100 μ L/孔加入抗體淘洗板,室溫孵育60min,用PBST洗滌15次，PBS洗滌5次，3min/次。(4)洗脫lmL0. IM pH2. 2HC1-Glycin (鹽酸甘氨酸緩沖系統(tǒng))洗脫，室溫?fù)u動(dòng)lOmin，洗出洗脫液，80yL左右IM Tris (三羥甲基氨基甲烷)中和至7. 4 ;將免疫管用對(duì)I. 2mL數(shù)生長(zhǎng)期的XLl-Blue直接感染，同時(shí)將HCl-Glycin (含4%BSA)洗脫并且中和的噬菌體抗體9倍體積對(duì)數(shù)期XLl-Blue感染。共4份樣品室溫感染lOmin，轉(zhuǎn)入37°C、150rpm培養(yǎng)lh，分別取1%，0. 1%，0. 01%涂板計(jì)算產(chǎn)出量。剩余部分混合離心后濃縮到為lmL，分別涂于 2 塊 12cm 直徑 LBATGCLB 培養(yǎng)基中添加 Ampr :100 μ g/mL ；Tetr :10 μ g/mL ；Glucose 0. 5% ；)固體培養(yǎng)板，37°C培養(yǎng)過夜(約12h)。
(5)呈現(xiàn)將培養(yǎng)過夜培養(yǎng)板上的菌落刮下，部分投入下一輪篩選，剰余部分凍存。將部分菌液加入到IOOmL LBATG培養(yǎng)液中至菌濃度為0D_=0. 35左右，于37°C培養(yǎng)約Ih至OD600=O. 5 (菌量為I X IOVmL),加入50:1輔助噬菌體M13K07,混勻后室溫靜置15min,于37°C、150rpm/min培養(yǎng)Ih后離心獲得沉淀。在90mL的LBATK ;混勻后等分為3份其中ー份加入 IPTG 至終濃度為 O. ImM 和 Glucose 至 O. 25% (g/1OOmL) (6 μ L O. 5Μ IPTG，300M125%葡萄糖);ー份加入IPTG至終濃度為O. ImM ;第三份為空白對(duì)照；三份樣本繼續(xù)于 300C，180rpm/min，培養(yǎng)過夜(約 12h)。(6) 4°C, 14000rpm/min, 30min離心細(xì)菌培養(yǎng)物，收培養(yǎng)上清；加入1/5體積預(yù)冷的PEG/NaCl (20%PEG8000+2. 5mol/L NaCl)緩沖溶液，混勻后冰預(yù)60min，沉淀噬菌體；4°C，14000rpm/min離心20min，重懸沉淀于IOmL的含2%BSA和15%甘油的PBS緩沖液中，常溫下IOOOOrpm離心IOmin,去除沉淀,獲取上清,O. 22 μ m膜過濾除菌,取10 μ L進(jìn)行曬菌體抗體庫(kù)滴度測(cè)定，其余分裝成小份，凍存_70°C備用。按以上步驟進(jìn)行“結(jié)合-洗滌-洗脫(感染)”，反復(fù)進(jìn)行三輪。I. 2. 7噬菌體ELISA鑒定陽性克隆a)挑取經(jīng)篩選后的克隆于96孔深孔板中，每孔250 μ L2X YTATG培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)至OD600=O. 5，按照M0I=20 I加入輔助噬菌體，室溫靜置15min, 37°C, 150rpm/min培養(yǎng)lh，加入等體積2XYTATG，30°C，搖床200rpm培養(yǎng)過夜約。次日，10000rpm/min離心IOmin收取上清，加入BSA至終濃度2%，加入Tween-20至終濃度O. I %，37°C靜置15min，備用。b)包被ロ蹄疫AsiaI全病毒滅活抗原包被液稀釋至I : 4，加入96孔酶標(biāo)板中，100 μ L/孔，4°C包被過夜。c)次日，棄包被液，用DPBS溶液220 μ L/孔洗3次，用5%脫脂奶粉+0. l%Tween-20封閉，100 μ L/孔，37°C封閉2h。d)棄去封閉液，加入經(jīng)封閉后的單克隆噬菌體抗體，100 μ L/孔，37°C靜置2h。e)棄去液體，用DPBS洗6次，220 μ I/孔。f)將鼠抗M13-HRP抗體用封閉緩沖液按I : 5000稀釋，100 μ L/孔，37°C作用lh。g)棄去液體，酶標(biāo)板用DPBS洗6次。h)棄去洗滌液，加入底物OPD顯色液，100 μ L/孔，室溫靜置顯色。用100 μ L/孔2moIH2SO4終止顯色。酶標(biāo)儀測(cè)定光吸收值。I. 2. 8篩選的AsiaIVHH重鏈抗體在E. coli中表達(dá)和鑒定上述實(shí)驗(yàn)共獲得陽性克隆，通過序列分析比較，篩選特異性的抗FMDV AsiaI型抗體VHH重鏈抗體序列。利用PCR將這些序列擴(kuò)增，膠回收PCR擴(kuò)增后片段，然后雙酶切酶切，酶切后的目的片段與E. coli表達(dá)載體pSMK連接，構(gòu)建VHH重鏈抗體重組表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到E. coli中進(jìn)行表達(dá)。利用SDS-PAGE和Western blotting鑒定表達(dá)的VHH抗體蛋白，利用雙抗體夾心ELISA試驗(yàn)鑒定表達(dá)抗體的結(jié)合能力和型特異性。I. 2. 9重組AsiaIVHH重鏈抗體結(jié)合抗原能力和型特異性鑒定I. 2. 9. I雙抗體夾心ELISA鑒定VHH抗體結(jié)合AsiaI/YNBS/58全病毒抗原能力(I)抗體包被純化VHH抗體包被酶標(biāo)板(I μ g/孔)，100 μ L/孔，兔抗FMDV AsiaI 全病毒抗原多克隆抗血清作為陽性對(duì)照(I 1000), SUMO蛋白作為陰性對(duì)照(I μ g/孔)，4°C過夜包被；(2)加入抗原I XPBST洗滌4次，220 μ L/孔，最后一次棄凈孔內(nèi)液體，拍干，按照
I 5加入AsiaI全病毒滅活抗原，37°C作用60min，洗板；(3)加入豚鼠抗體按照I : 1000比例加入豚鼠抗AsiaI多克隆抗體，37°C作用60min,洗板；(4)加酶標(biāo)ニ抗1 1000加入兔抗豚鼠HRP標(biāo)記ニ抗，37°C作用60min，洗板；(5)顯色加入OPD底物顯色37°C作用15min ；(6)終止并讀數(shù)加入2Mol/L H2SO4終止反應(yīng)，0D490讀取吸光度值。2.結(jié)果2. I完整淋巴細(xì)胞總RNA的提取提取外送免疫后雙峰駝外周血淋巴細(xì)胞的總RNA，凝結(jié)電泳分析提取的總RNA無基因組污染，大小與預(yù)期相符，見圖I。2. 2VHH重鏈抗體基因PCR擴(kuò)增以cDNA為模板，HU Gl為上下游引物，進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增，得到大小600bp和900bp左右2條帶，見圖2?；厥?00bp條帶，作為模板，進(jìn)行第二輪PCR。以第一輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為模板，H2、H3為上下游引物得到約450bp條帶，見圖3。以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，以P1、TN為上下游引物得到約450bp條帶，見圖4，此時(shí)VHH基因兩端分別引入了 Sfil/Notl限制性酶切位點(diǎn)。2. 3噬菌體展示抗體庫(kù)多多樣性的確定和庫(kù)容量經(jīng)過三次大量連接和轉(zhuǎn)化，隨機(jī)選擇15個(gè)克隆測(cè)序結(jié)果表明，15個(gè)克隆的片段均為編碼重鏈抗體的可變區(qū)的基因，計(jì)算得到庫(kù)容為I. 13X108的駱駝免疫單域抗體庫(kù)，將該抗體庫(kù)命名為NA L~AsiaI。2. 4抗體庫(kù)的淘洗采用噬菌體文庫(kù)NAL-AsiaI淘洗能與AsiaI抗原特異性結(jié)合的噬菌體顆粒，測(cè)定每輪篩選的噬菌體的回收率，經(jīng)過3輪淘選，表明選擇性吸附的噬菌體量明顯增加(表3)，能與AsiaI抗原特異性結(jié)合的噬菌體的得到了富集。表3三輪淘洗噬菌體富集結(jié)果
權(quán)利要求
1.抗ロ蹄疫AsiaI型病毒的雙峰駝VHH重鏈抗體，其特征在于所述的抗體具有以下(a)或(b)所示的氨基酸序列 (a)SEQ ID NO. I所示的氨基酸序列；或 (b)與SEQID NO. I所示的序列同源性在98%以上的氨基酸序列。
2.如權(quán)利要求I所述的雙峰駝VHH重鏈抗體，其特征在于所述的與SEQID NO. I所示的序列同源性在98%以上的序列包括SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 3所示的序列。
3.編碼權(quán)利要求I或2所述的雙峰駝VHH重鏈抗體的核苷酸序列。
4.如權(quán)利要求3所述的核苷酸序列，其特征在于所述的核苷酸序列具有SEQID NO. 4或SEQ ID NO. 5或SEQ ID NO. 6所示的序列。
5.一種重組表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列。
6.ー種宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為含有權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列的真核或原核細(xì)胞。
7.如權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于所述的宿主細(xì)胞為含有權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體的真核或原核細(xì)胞。
8.權(quán)利要求I或2所述的雙峰駝VHH重鏈抗體在制備檢測(cè)或診斷ロ蹄疫AsiaI型病毒感染試劑中的應(yīng)用。
9.權(quán)利要求3或4所述的核苷酸序列在制備檢測(cè)或診斷ロ蹄疫AsiaI型病毒感染試劑中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗口蹄疫AsiaI型病毒的雙峰駝VHH重鏈抗體及其制備方法和用途，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首次利用重組的AsiaI型病毒樣顆?？乖庖唠p峰駝，利用噬菌體展示技術(shù)建立AsiaI VHH免疫抗體庫(kù)，篩選與口蹄疫AsiaI型病毒抗原具有良好親和力的高特異性單域抗體，本發(fā)明所述的抗體具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列或與SEQ ID NO.1所示的序列同源性在98%以上的氨基酸序列。本發(fā)明的AsiaI VHH重鏈抗體對(duì)于研究AsiaI病毒感染機(jī)理和建立高度敏感和特異的抗原快速檢測(cè)或診斷試劑具有重要意義。
文檔編號(hào)C12N5/10GK102702349SQ20121014852
公開日2012年10月3日 申請(qǐng)日期2012年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2012年5月15日
發(fā)明者劉湘濤, 周廣清, 孫世琪, 尚佑軍, 尹雙輝, 楊順利, 田宏, 靳野 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所