專利名稱：一種快速檢測鹿產(chǎn)品的多重pcr試劑盒及制備方法
技術領域：
本發(fā)明公開一種快速檢測鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒，用于快速準確識別鹿產(chǎn)品，同時還公開了該試劑盒的制備方法，屬于生物檢測試劑盒技術領域。
背景技術：
鹿產(chǎn)品是鹿的一些組織或者器官，主要包括有鹿茸，鹿心，鹿腎，鹿胎，鹿筋，鹿鞭，鹿尾，鹿肉和鹿血等。由于鹿產(chǎn)品大多為名貴中藥材，價格昂貴，所以市場上屢見用偽劣產(chǎn)品來冒充名貴的鹿產(chǎn)品。目前，鹿產(chǎn)品的鑒定大多采用傳統(tǒng)方法，主要包括性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定。雖然傳統(tǒng)鑒定方法簡單、快捷、成本低，但影響傳統(tǒng)鑒定方法的因素很多(如人為因素、 環(huán)境因素、營養(yǎng)因素)，因而不能準確地判斷鹿產(chǎn)品的偽劣情況。比如在鹿產(chǎn)品的加工過程中，其性狀、顯微結(jié)構、理化性質(zhì)等常常發(fā)生改變，利用傳統(tǒng)鑒定方法來鑒定鹿產(chǎn)品可能會出現(xiàn)誤判。然而，分子鑒定方法(基于DNA的方法)不受這些因素的影響，且具有準確性大、 靈敏度高、穩(wěn)定性好、通用性強等特點。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種快速檢測鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒，解決了梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、馴鹿及赤鹿以及豬、牛、羊、雞等常見假冒混合產(chǎn)品的快速檢測問題。本發(fā)明還提供了上述快速檢測鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒的制備方法，通過兩個多重PCR方法反應體系(鹿源性反應梅花鹿，馬鹿，塔里木馬鹿，赤鹿和馴鹿；豬、牛、羊、雞源性反應豬、牛、羊、雞)，采用一步反應來鑒別鹿產(chǎn)品中的其他動物成分。本發(fā)明提供的快速檢測鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒，其特征在于
包括DNA提取液、鹿源性多重PCR反應液和豬、牛、羊、雞源性多重PCR反應液和陰性標準品
1、所述的DNA提取液
(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水；
(2)細胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；(3)蛋白酶K:2份蛋白酶K，100份水；
2、所述的鹿源性多重PCR反應液
ddH20、10 XPCR Buffer、dNTPs、引物 DF、引物 CCF、弓丨物 CYF、引物 DR、引物 RTF、弓丨物 RTR、Taq 酶
具體引物序列為
1)梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿和馴鹿特異mtD-loop
DF (上游)5’ -CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
2)馬鹿特異mtD-loopCCF (上游)5’ -CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
3)塔里木馬鹿特異mtD-loop:
CYF (上游)5，-CTCAACATCCAITTTACATCTTACATTA-3’
DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
4)馴鹿線粒體特異mtl6SrDNA:
RTF (上游)5’ -GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR (下游)5’ -TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’ ；
3、豬、牛、羊、雞源性多重PCR反應液
ddH20、10XPCR Buffer、dNTPs、引物 SSF、引物 SSR、引物 OAF、引物 OAR、引物 GGF、引物 GGR、引物 BTF、引物 BTR、Taq 酶；
具體引物序列為
①豬特異mtl2S rRNA-tRNA-Val
SSF (上游)5’ -CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR (下游)5，-ACAITGTGGGATCTTCTAGGT-3，
②牛特異tRNA-Val-16S rRNA
BTF (上游)5’ -GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR (下游)5’ -CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
③羊特異tRNA-Lys-ATP8
OAF (上游)5’ - TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR (下游)5’ - ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
④雞特異12SrRNA
GGF (上游)5’ _ TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR (下游)5’ -GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3，
4、陰性標準品為無菌雙蒸水。本發(fā)明所述快速檢測鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒的制備方法，包括以下步驟
I)鹿源性多重PCR反應液
(I)引物設計
設計梅花鹿，赤鹿，馬鹿，塔里木馬鹿和馴鹿的特異性引物；其中包括一個共同的下游引物(DR)，一個上游引物(DF)和兩個物種特異性上游引物(赤鹿CCF，塔里木馬鹿CYF)；
①梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿和馴鹿特異mtD-loop
DF (上游)5’ -CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
②馬鹿特異mtD-loop
CCF (上游)5’ -CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
③塔里木馬鹿特異mtD-loop。CYF (上游)5’ -CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’CN 102605098 A
④馴鹿線粒體特異mtl6S rDNA
RTF (上游)5’ -GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR (下游)5’ -TAGGGCGGGATATGITTGTGTATC-3’
(2)鹿源性多重PCR反應液
ddH20 8. 7ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，引物 DF(20 uM)
0.2ul，引物 CCF(20 uM) 0. 2ul，引物 CYF(20 uM) 0. 2ul，引物 DR(20 uM) 0.4ul，引物 RTF (20 uM) 0. 3ul，引物 RTR(20 uM) 0. 3ul，Taq 酶(5U/ul) 0.2ul。(3)陰性標準品為無囷雙蒸水；
2)豬、牛、羊、雞源性多重PCR反應液
(1)引物設計
豬、羊、雞的特異性引物
①豬特異mtl2S rRNA-tRNA-Val
SSF (上游)5’ -CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR (下游)5，-ACAITGTGGGATCTTCTAGGT-3，
②牛特異tRNA-Val-16S rRNA
BTF (上游)5’ -GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR (下游)5’ -CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
③羊特異tRNA-Lys-ATP8
OAF (上游)5’ - TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR (下游)5’ - ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
④雞特異12SrRNA
GGF (上游)5’ _ TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR (下游)5’ -GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3，
(2)豬牛羊雞源性多重PCR反應液
ddH20 8. Iul, 10 X Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，引物 SSF(20 uM)
0.lul，引物 SSR(20 uM) 0. I ul，引物 0AF(50 uM) 0. 5ul，引物 0AR(50 uM) 0.5 ul，引物 GGF (20 uM) 0. 2ul，引物 GGR(20 uM) 0. 2 ul，引物 BTF(20 uM) 0. 3ul，引物 BTR(20 uM) 0. 3 ul, Taq 酶 0.2ul。(3)陰性標準品為無囷雙蒸水。本發(fā)明的多重PCR檢測的使用方法
(1)從待檢樣品中提取基因組DNA；
(2)制備多重PCR反應體系
①取步驟I中的DNAIul和陰性對照加入到鹿源性多重PCR反應液中，用PCR儀進行擴增；
②取步驟I中的DNAIul和陰性對照加入到豬牛羊雞源性多重PCR反應液中，用PCR 儀進行擴增；
(3)設定反應程序進行PCR擴增，鹿源性多重PCR和豬牛羊雞源性多重PCR反應程序均如下
94。C 5 min ；94° C 30s, 56° C 30s,67° C Imin ;67。C 5min，擴增 30 個循
7環(huán)。(4)將PCR擴增結(jié)果分別在1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，紫外燈下觀察結(jié)果，綜合分析鹿源性多重PCR和豬牛羊雞源性多重PCR結(jié)果，即得出待檢樣品中含有的動物成分。結(jié)果判定如果只擴增出307bp的特異性片段，說明含有梅花鹿成分；如果同時擴增出307 bp和246 bp兩個特異性片段，說明含有馬鹿成分；如果擴增出272bp的特異性片段，說明含有塔里木馬鹿成分；如果擴增出141bp的特異性片段，說明含有馴鹿的成分；如果擴增出290bp的特異性片段，說明含有豬的成分；如果擴增出225bp的特異性片段，說明含有羊的成分；如果擴增出183bp的特異性片段，說明含有雞的成分；如果擴增出124bp的特異性片段，說明含有牛的成分。本發(fā)明的積極效果在于采用多重PCR技術，擴增梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿以及馴鹿和豬、牛、羊、雞的各線粒體DNA的特異分子片段，制成試劑盒，用于檢測被檢樣品中是否含有上述各動物成分，能檢測混合樣品；具有操作簡單、靈敏度高，速度快特點。


圖I為鹿源性多重PCR反應的種間特異性；
圖2為鹿源性多重PCR反應的種內(nèi)通用性；
圖3為豬牛羊雞源性多重PCR反應的種間特異性。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施實例，進一步闡述本發(fā)明
實施例I :試劑盒的組成與配制
I) DNA提取液的配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 6)800ml蒸餾水溶解I. 21gTris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 38g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0. 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加濃鹽酸調(diào)pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入Ig SDS (十二烷基硫酸鈉)，Iml Triton X-100 (聚乙二醇對異辛基苯基醚)。(3)蛋白酶K:將100 mg蛋白酶K溶于5 ml無菌去離子水中，-20°C保存。提取方法200ul抗凝血和400ul低鹽緩沖液加入到I. 5ml離心管中，充分混勻后 1000RPM離心lOmin，棄上清；加入500ul低鹽緩沖液，混勻后于室溫下1000RPM離心5min， 重復一次；小心吸出上清，加入300ul細胞裂解液，混勻后于65°C水浴IOminJPA 75ul飽和NaCl，充分混勻后12000RPM離心5min，將上清轉(zhuǎn)移到新的I. 5ml離心管中，加入2倍體積無水乙醇，充分混勻后于10000RPM離心2min，棄上清，加入500ul冰浴70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次后于10000RPM離心lmin，棄上清；65°C烘箱中干燥5min，加入IOOul ddH20后于65°C 水浴溶解15min。2)鹿源性多重PCR反應液
(I)引物設計
根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的線粒體D-Ioop區(qū)序列采用Bioedit 7. 0. 9. 0軟件進行序列比對。然后在梅花鹿(AB378372)的D-Ioop區(qū)上，利用Oligo 6. 0軟件設計梅花鹿，赤鹿，馬鹿，塔里木馬鹿和馴鹿的特異性引物。其中包括一個共同的下游引物(DR)，一個上游引物(DF)和兩個物種特異性上游引物(赤鹿CCF，塔里木馬鹿CYF)；
①梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿和馴鹿特異mtD-loop
DF (上游)5’ -CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
②馬鹿特異mtD-loop
CCF (上游)5’ -CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
③塔里木馬鹿特異mtD-loop。CYF (上游)5’ -CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
④馴鹿線粒體特異mtl6SrDNA
RTF (上游)5’ -GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR (下游)5’ -TAGGGCGGGATATGITTGTGTATC-3’
(2)鹿源性多重PCR反應液
ddH20 8.7ul,10 X Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2.Oul,引物 DF(20 uM) 0. 2ul，引物 CCF(20 uM) 0. 2ul，引物 CYF(20 uM) 0. 2ul，引物 DR(20 uM) 0.4ul，引物 RTF(20 uM) 0. 3ul，引物 RTR(20 uM) 0. 3ul，Taq 酶(5U/ul) 0. 2ul,
(3)陰性標準品為無菌雙蒸水；
3)豬、牛、羊、雞源性多重PCR反應液
(1)引物設計
豬、羊、雞的特異性引物
①豬特異mtl2S rRNA-tRNA-Val
SSF (上游)5’ -CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR (下游)5，-ACAITGTGGGATCTTCTAGGT-3，
②牛特異tRNA-Val-16S rRNA
BTF (上游)5’ -GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR (下游)5’ -CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
③羊特異tRNA-Lys-ATP8
OAF (上游)5’ - TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR (下游)5’ - ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
④雞特異12SrRNA
GGF (上游)5’ _ TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR (下游)5’ -GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3，
(2)豬牛羊雞源性多重PCR反應液
ddH20 8. lul, 10 X Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，引物 SSF(20 uM)
0.lul，引物 SSR(20 uM) 0. I ul，引物 0AF(50 uM) 0. 5ul，引物 0AR(50 uM) 0.5 ul，引物 GGF(20 uM) 0. 2ul，引物 GGR(20 uM) 0. 2 ul，引物 BTF(20 uM) 0. 3ul，引物 BTR(20 uM) 0. 3 ul, Taq 酶 0. 2ul ;(3)陰性標準品為無菌雙蒸水。實施例2 :試劑盒的特異性試驗
1、鹿源性多重PCR反應中各引物對的種間特異性和種內(nèi)通用性。(I)證明鹿源性多重PCR反應中各引物對具有種間特異性。①按照實施例I的方法分別從血液中提取了梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿、馴鹿、水鹿、坡鹿、白唇鹿、麋鹿、點鹿、豬、牛、羊、雞的基因組DNA。提取的DNA分別用于制備下列反應體系，無菌水為陰性對照。②制備反應體系步驟①提取的DNA I. Oul加入到實施例I中鹿源性多重PCR反應液中。③按照程序94。C5 min ；94° C 30s,56° C 30s,67° C Imin ;67。C 5min,擴增30個循環(huán)。進行PCR擴增。④結(jié)果(如圖1):1 :梅花鹿；2 :馬鹿；3 :塔里木馬鹿；4 :赤鹿；5 :馴鹿；6 :水鹿；7 坡鹿；8 :白唇鹿；9 :糜鹿；10 :點鹿；11 :豬；12 :牛；13 :羊；14 :雞；15 :陰性對照；M Marker I (600，500，400，300，200，100 bp);梅花鹿基因組DNA樣品擴增出307 bp的特異性片段， 與單一 PCR—致；馬鹿基因組DNA樣品擴增出307 bp和246 bp兩個特異性片段，這是因為引物對DF/DR和CCF/DR都能夠擴增出馬鹿特異性片段，也與單一 PCR —致；塔里木馬鹿和馴鹿基因組DNA樣品分別只擴增出272 bp的特異性片段和141 bp的特異性片段，這是因為在多重PCR時，對同一模板來說，反應強的引物能夠抑制反應弱的引物對其進行擴增， DF/DR對塔里木馬鹿和馴鹿的PCR擴增較弱，反應強的引物對CYF/DR和RTF/RTR能夠抑制 DF/DR對各自目的模板的PCR擴增；赤鹿基因組DNA樣品擴增出230 bp的特異性片段；其他基因組DNA和對照組均為陰性。(2)證明鹿源性多重PCR反應中各引物對具有種內(nèi)通用性。①按實施例I方法提取了 9個梅花鹿(3個左家梅花鹿、3個東豐梅花鹿、3個興凱湖梅花鹿)血液DNA、3個塔里木馬鹿血液DNA、3個赤鹿血液DNA、3個馴鹿血液DNA、15個馬鹿(3個東北馬鹿、3個青海馬鹿、3個甘肅馬鹿、3個阿爾泰馬鹿、3個天山馬鹿)血液DNA， 分別制備下列反應體系，無菌雙蒸水為陰性對照。②制備反應體系步驟①提取的DNA I. Oul加入到實施例I中鹿源性多重PCR反應液中。③按照程序94°C 5 min ；94° C 30s,56° C 30s,67° C lmin ；67° C 5min,擴增30個循環(huán)。進行PCR擴增。④結(jié)果(如圖2) A :梅花鹿(N1-3 :左家梅花鹿；N4_6 :東豐梅花鹿；N7_9 :興凱湖梅花鹿)；B :塔里木馬鹿(Y1-3)，赤鹿(E1-3)，馴鹿(Rl-3) ；C :馬鹿(C1-3 :東北馬鹿;C4_6 青海馬鹿；C7-9 :甘肅馬鹿；C10-12 :阿爾泰馬鹿；C13-15 :天山馬鹿)；0 :陰性對照；M : Marker I (600，500，400，300，200，100 bp) ;9 個梅花鹿基因組 DNA 均擴增出 307bp 的特異性片段；15個馬鹿基因組DNA樣品擴增出307 bp和246 bp兩個特異性片段；3個塔里木馬鹿基因組DNA均擴增出272 bp的特異性片段；3個馴鹿基因組DNA均擴增出141 bp的特異性片段；3個赤鹿基因組DNA均擴增出230 bp的特異性片段。均與目的條帶大小相符。2、證明豬牛羊雞源性多重PCR反應中各引物對具有種間特異性。①為證明豬牛羊雞源性多重PCR反應中的各引物對具有種間特異性，按照實施例I的方法分別提取了豬、牛、羊、雞的血液DNA，無菌雙蒸水為陰性對照，制備下列反應體系。②制備反應體系步驟①提取的DNA I. Oul加入到實施例I中豬牛羊雞源性多重 PCR反應液中。③按照程序94。C5 min ;94。C 30s,56° C 30s,67° C lmin, 67。C 5min,擴增30個循環(huán)。進行PCR擴增。④結(jié)果(如圖3) 1 :豬；2 :羊；3 ■ 雞；4 :牛；5 :陰性對照；M =Marker I (600,500, 400，300，200，100 bp);豬、羊、雞、牛基因組 DNA 樣品分別擴增出了 290 bp、225bp、183bp、 124bp的特異性片段，均與單一 PCR時的特異性片段一致。實施例3 :多重PCR的靈敏性。I、評估鹿源性多重PCR反應的靈敏性。(I)按照實施例I的提取方法分別提取了梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿和馴鹿的血液基因組DNA。分別進行梯度稀釋，稀釋情況如下10、5、1、0. 5,0. 2,0. 1,0. 05,0. 02 ng0(2)分別制備反應體系步驟(I)提取的DNA I. Oul加入到實施例I中鹿源性多重PCR反應液中。(3)按照程序94° C 5 min ；94° C 30s,56° C 30s,67° C lmin,67° C 5min,擴增30個循環(huán)。進行PCR擴增。(4)結(jié)果梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿和馴鹿基因組DNA樣品的最小檢測限度分別為 0. 05,0. 05,0. 1,0. 5 和 0. 02 ng。2、評估豬牛羊雞源性多重PCR反應的靈敏性。(I)按照實施例I的提取方法分別提取豬、牛、羊、雞的血液基因組DNA，分別進行梯度稀釋，稀釋情況如下10、5、1、0. 5、0. 2 ng。(2)分別制備反應體系步驟(I)提取的DNA I. Oul加入到實施例I中豬牛羊雞源性多重PCR反應液中。(3)按照程序94° C 5 min ；94° C 30s,56° C 30s,67° C lmin,67° C 5min,擴增30個循環(huán)。進行PCR擴增。(4)結(jié)果豬、牛、羊和雞基因組DNA樣品的最小檢測限度分別為1、0. 5、1和5 ng。以下實驗表明本發(fā)明的有效性和可行性實驗例I鹿產(chǎn)品DNA的提取。為了了解市場上鹿產(chǎn)品的欺詐情況，從市場上隨機購買了 71個鹿產(chǎn)品24個鹿茸產(chǎn)品、12個鹿胎產(chǎn)品、8個鹿鞭產(chǎn)品、7個鹿筋產(chǎn)品、7個鹿尾產(chǎn)品、7個鹿血粉產(chǎn)品、6個其他鹿產(chǎn)品(鹿腎、鹿心、鹿心丸、鹿肉干)。I、DNA 提取
將各種鹿產(chǎn)品取少量在液氮中研磨，越細越好。取50mg處理好的產(chǎn)品裝于I. 5ml離心管中，加入500ml細胞裂解液，再加入蛋白酶K 10ul，充分混勻，55°C水浴消化過夜；加入等體積酚仿(I: I )，充分混勻，室溫12000RPM離心5min，抽提2次，加入2倍體積無水乙醇， 混勻直至出現(xiàn)絮狀沉淀，室溫12000RPM離心2min，棄上清；加入500ul冰浴70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次，10000RPM離心lmin，棄上清，65°C烘箱干燥5min，加入IOOul ddH20,65°C水浴15min溶解。實驗例2鹿產(chǎn)品的檢測。I、多重PCR反應體系的制備。①鹿源性多重PCR反應體系實驗例I中提取的鹿產(chǎn)品DNA I. Oul加入到實施例 I中鹿源性多重PCR反應液中。②豬、牛、羊、雞源性多重PCR反應體系實驗例I中提取的鹿產(chǎn)品DNA I. Oul加入到實施例I中豬牛羊雞源性多重PCR反應液中。2、均設定反應程序94。C 5 min ;94。C 30s,56° C 30s,67° C lmin, 67° C 5min，擴增30個循環(huán)。擴增結(jié)果在1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下綜合鹿源性多重 PCR反應體系和豬牛羊雞源性多重PCR反應體系結(jié)果進行分析。結(jié)果如表1，2，3，4，5，6，7。3、結(jié)果表I中可知，市場中大部分的鹿茸產(chǎn)品為馴鹿茸，絕大多數(shù)深加工的鹿茸產(chǎn)品如鹿茸丸、鹿茸(軟)膠囊、鹿茸粉為偽品，5個產(chǎn)品中還包含豬或/和羊源性成分，偽品檢出率達到79%。表2可知，鹿胎產(chǎn)品的偽品檢出率達到83%，其中梅花鹿胎粉經(jīng)檢測沒有梅花鹿源性成分卻含有馬鹿源性成分，新西蘭赤鹿胎經(jīng)檢測為梅花鹿胎，鹿胎軟膠囊經(jīng)檢測只含有牛源性成分。表3可知，鹿鞭產(chǎn)品的偽品檢出率達到100%，其中新西蘭赤鹿鞭經(jīng)檢測為梅花鹿鞭，新西蘭赤鹿鞭片經(jīng)檢測含有馬鹿源性成分，還有的產(chǎn)品含有牛和/或雞源性成分。表4可知，鹿筋產(chǎn)品的偽品檢出率為57%，其中一個經(jīng)檢測為牛筋制成。表5可知,鹿尾產(chǎn)品的偽品檢出率較小，為28. 5%，其中新西蘭鹿尾經(jīng)檢測為馬鹿尾。表6可知，鹿血產(chǎn)品的偽品檢出率也較高，達到57%，7個樣品中有3個含有牛源性成分。表7可知，其中 3個鹿腎經(jīng)檢測只有I個是梅花鹿腎，鹿心產(chǎn)品經(jīng)檢測為豬心，鹿肉干也不是由梅花鹿肉制成，而是由馬鹿肉和赤鹿肉制成。表I鹿茸產(chǎn)品的檢測結(jié)果
權利要求
1.一種快速檢測鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒，其特征在于包括以下引物1)梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿和馴鹿特異mtD-loopDF (上游)5’ -CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’2)馬鹿特異mtD-loopCCF (上游)5’ -CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’3)塔里木馬鹿特異mtD-loop:CYF (上游)5，-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’4)馴鹿線粒體特異mtl6SrDNA:RTF (上游)5’ -GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’RTR (下游)5’ -TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’。
2.權利要求I所述的快速檢測鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒，其特征在于包括DNA提取液、鹿源性多重PCR反應液和豬、牛、羊、雞源性多重PCR反應液和陰性標準品所述的DNA提取液(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水；(2)細胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；(3)蛋白酶K:2份蛋白酶K，100份水；所述的鹿源性多重PCR反應液ddH20、10 XPCR Buffer、dNTPs、引物 DF、引物 CCF、弓丨物 CYF、引物 DR、引物 RTF、弓丨物 RTR、Taq 酶；具體引物序列為1)梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿和馴鹿特異mtD-loopDF (上游)5’ -CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’2)馬鹿特異mtD-loopCCF (上游)5’ -CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’3)塔里木馬鹿特異mtD-loop:CYF (上游)5，-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’4)馴鹿線粒體特異mtl6SrDNA:RTF (上游)5’ -GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’RTR (下游)5’ -TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’ ；豬、牛、羊、雞源性多重PCR反應液ddH20、10XPCR Buffer、dNTPs、引物 SSF、引物 SSR、引物 OAF、引物 OAR、引物 GGF、引物GGR、引物 BTF、引物 BTR、Taq 酶；具體引物序列為1)豬特異mtl2S rRNA-tRNA-Val SSF (上游)5’ -CTACATAAGAATATCCACCACA-3’SSR (下游)5，-ACATTGTGGGATCTTCTAGGT-3，2)牛特異tRNA-Val-16S rRNA BTF (上游)5’ -GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’BTR (下游)5’ -CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’3)羊特異tRNA-Lys-ATP8 OAF (上游)5’ - TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’OAR (下游)5’ - ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’4)雞特異12S rRNA GGF (上游)5’ _ TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’GGR (下游)5’ -GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3，陰性標準品為無菌雙蒸水。
3.權利要求2所述快速檢測鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)鹿源性多重PCR反應液(1)引物設計設計梅花鹿，赤鹿，馬鹿，塔里木馬鹿和馴鹿的特異性引物；其中包括一個共同的下游引物(DR)，一個上游引物(DF)和兩個物種特異性上游引物(赤鹿CCF，塔里木馬鹿CYF)；①梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿和馴鹿特異mtD-loopDF (上游)5’ -CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’②馬鹿特異mtD-loopCCF (上游)5’ -CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’③塔里木馬鹿特異mtD-loopCYF (上游)5’ -CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’DR (下游)5，-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’④馴鹿線粒體特異mtl6SrDNA RTF (上游)5’ -GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’RTR (下游)5’ -TAGGGCGGGATATGITTGTGTATC-3’(2)所述的鹿源性多重PCR反應液ddH20、10 XPCR Buffer、dNTPs、引物 DF、引物 CCF、弓丨物 CYF、引物 DR、引物 RTF、弓丨物 RTR、Taq 酶2)所述的DNA提取液(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水；(2)細胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對異辛3基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；(3)蛋白酶K :2份蛋白酶K，100份水；3)豬、牛、羊、雞源性多重PCR反應液(1)引物設計豬、羊、雞的特異性引物①豬特異mtl2S rRNA-tRNA-Val SSF (上游)5’ -CTACATAAGAATATCCACCACA-3’SSR (下游)5，-ACATTGTGGGATCTTCTAGGT-3，②牛特異tRNA-Val-16S rRNA BTF (上游)5’ -GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’BTR (下游)5’ -CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’③羊特異tRNA-Lys-ATP8 OAF (上游)5’ - TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’OAR (下游)5’ - ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’④雞特異12SrRNA GGF (上游)5’ _ TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’GGR (下游)5’ -GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3，(2)PCR反應液Taq 酶 5υ/μ 1,10XPCR buffer, dNTPs 100 μΜ，引物 0AF、0AR 50 μ M，引物 SSF、SSR、 GGF、GGR、BTF、BTR 均為 20 μ M ；4)陰性標準品為無菌雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開一種快速檢測鹿產(chǎn)品的多重PCR試劑盒，用于快速準確識別鹿產(chǎn)品，同時還公開了該試劑盒的制備方法，采用多重PCR技術擴增梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿以及馴鹿和豬、牛、羊、雞的各線粒體DNA的特異分子片段制成試劑盒，用于檢測被檢樣品中是否含有上述各動物成分，能檢測混合樣品；具有操作簡單、靈敏度高，速度快特點。
文檔編號C12Q1/68GK102605098SQ20121010856
公開日2012年7月25日 申請日期2012年4月15日 優(yōu)先權日2012年4月15日
發(fā)明者吳瓊, 楊福合, 査代明, 蘇偉林, 榮敏, 邢秀梅 申請人:邢秀梅