專利名稱：一種用于短鏈rna檢測的歐米茄結(jié)構(gòu)寡核苷酸引物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種引物，特別涉及一種檢測短鏈RNA的引物及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
短鏈RNA在很多生物學(xué)、生理和病理過程中起著重要的基因調(diào)節(jié)作用。短鏈RNA中微小RNA(miRNA)是數(shù)量最多的一類。由于它與它的同類物DNA，RNA相比很短，發(fā)現(xiàn)起來較困難，因此近些年才發(fā)現(xiàn)它的存在。1993年，I in-4是第一個被發(fā)現(xiàn)的22nt短鏈RNA，它通過對靶基因lin-4信使RNA (mRNA)調(diào)節(jié)，在實(shí)驗(yàn)中對線蟲發(fā)育時間表的啟動和細(xì)胞分化起抑制作用。直到7年后，類似結(jié)構(gòu)和功能的短鏈RNA在人類細(xì)胞中有更多的發(fā)現(xiàn)，才認(rèn)定lin-4不是孤立的，并將其歸為基因調(diào)節(jié)子的一類分子，即微小RNA (miRNA)的成員。miRNA后來被發(fā)現(xiàn)在調(diào)節(jié)胚胎發(fā)生、發(fā)育、血管形成、細(xì)胞生長、細(xì)胞凋亡等方面具有功能活性。在一系列的病變過程中，如癌癥發(fā)生，免疫缺陷，病毒感染等也發(fā)揮作用。Lu等發(fā)現(xiàn)比起正常組織miRNA在腫瘤中總的是下調(diào)趨勢。進(jìn)而，用miRNA表達(dá)譜可以分辨出低分化的腫瘤分類，而用信使RNA表達(dá)譜分析同樣的樣本得不出準(zhǔn)確的結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)凸顯出miRNA表達(dá)譜用于癌癥診斷的巨大潛力。最近Resotta基因公司上市了一系列的miRNA癌細(xì)胞診斷試劑盒，并宣稱這些試劑盒可以準(zhǔn)確檢測轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞的來源。盡管miRNA的功能和作用機(jī)理仍然需要進(jìn)一步的研究闡明，但基于學(xué)術(shù)研究和醫(yī)學(xué)診斷原因，圍繞這些小分子檢測和應(yīng)用的研究越來越多。最近發(fā)現(xiàn)在體液中miRNA由于分子鏈短和argonaute復(fù)合體保護(hù)的原因，比起它們的信使RNA配對物要穩(wěn)定的多。關(guān)于將血清或血漿miRNA表達(dá)譜做為癌癥預(yù)測、癌細(xì)胞鑒別和分型等診斷工具的可能性評估已有不少報(bào)道。由于序列短，核苷酸變異小以及缺少內(nèi)控參照，只有22個核苷酸組成的miRNA，用現(xiàn)在最通用的檢測信使RNA (mRNA)的方法檢測根本不合適，例如，定量反轉(zhuǎn)錄實(shí)時PCR(qRT-PCR)雖然已經(jīng)被發(fā)展成檢測信使RNA(mRNA)表達(dá)和表達(dá)譜的黃金標(biāo)準(zhǔn)。而發(fā)現(xiàn)miRNA的方法多采用短鏈RNA克隆篩選，表達(dá)譜檢測方法包括深度測序(deep sequencing),液相或固相雜交(hybridization)或基于RT-PCR的微陣列芯片技術(shù)(RT-PCR basedmicroarrays)ο從技術(shù)的角度來看，miRNA RT-PCR已經(jīng)在miRNA表達(dá)譜和檢測的眾多策略中脫穎而出成為最準(zhǔn)確和最靈敏的方法。因此，微陣列芯片的數(shù)據(jù)通常采用單目標(biāo)RT-PCR測定(RT-PCR single-plex assay)來復(fù)核評價其準(zhǔn)確性。反轉(zhuǎn)錄是在反轉(zhuǎn)錄酶催化下，以RNA為模板的cDNA合成反應(yīng)。一個寡核苷酸鏈退火互補(bǔ)到RNA鏈上作為反應(yīng)起始點(diǎn)，然后cDNA從5’端到3’端，按照與RNA模板堿基互補(bǔ)的原則一個堿基接著一個堿基合成下去。在匹配區(qū)域堿基互補(bǔ)，引物和RNA模板才能形成雙鏈體，這是反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)啟動(引發(fā))的必要條件。一般為了提供足夠的Tm和特異性，保證在引物和目標(biāo)(而非其它RNA) RNA模板之間專一地形成更緊密和穩(wěn)定的雙鏈體，引物通常設(shè)計(jì)成20-30nt (堿基)的長度。短鏈RNA，尤其是miRNA是一類短鏈寡核苷酸，平均鏈長18-30nt。由于鏈太短它們不能被傳統(tǒng)的引物引發(fā)合成cDNA。為改善短鏈寡核苷酸的Tm有幾種修飾可以采取，例如，用LNA寡核苷酸(寡聚鎖核酸)，連接一個較長的通用寡核苷酸接頭到目標(biāo)RNA上；用polyA多聚酶延長miRNA，以及采用莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物。目前，市場上有幾種用完全不同RT引物，檢測miRNA的qRT_PCR試劑盒。公認(rèn)度最高的是來自Applied Biosystems公司的miRNA表達(dá)譜和檢測試劑盒,其產(chǎn)品特點(diǎn)是采用獨(dú)特的莖環(huán)RT引物設(shè)計(jì),它是由Chen博士在Applied Biosystem建立的莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物包含一個ABI專用莖結(jié)構(gòu)用于改善短鏈RNA的檢測。莖環(huán)引物的堿基堆砌效應(yīng)提高了完全配對結(jié)合的探針和目標(biāo)RNA的熱動力學(xué)穩(wěn)定性，進(jìn)而提高了 RT反應(yīng)的效率。檢測的靈敏度比用線性引物高出100倍，本發(fā)明的實(shí)施例中，所述的“莖環(huán)引物”即采用該引物結(jié)構(gòu)。雖然，對于莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物怎樣改善提高反轉(zhuǎn)錄的特異性和效率知道的不是太多，但它的發(fā)明人宣稱莖環(huán)結(jié)構(gòu)的引物能通過核苷堿基的堆砌效應(yīng)增加短探針的熔化溫度(Tm)值，可選擇性地促進(jìn)短鏈RNA的反轉(zhuǎn)錄。值得注意的是，在本申請的實(shí)驗(yàn)中，用合成的沒有鏈內(nèi)引發(fā)位點(diǎn)的RNA作為模版，線性的引物其引發(fā)的效果即使沒有比莖環(huán)引物的效果更好，也至少同樣好。 況且還沒有更多的實(shí)驗(yàn)支持這樣的作法會提高RT反應(yīng)精確度。這就很難理解堿基堆砌效應(yīng)如何提高反轉(zhuǎn)錄的效率。可能莖環(huán)引物對位于鏈內(nèi)目標(biāo)序列雜交(鏈內(nèi)引發(fā))的抑制，也是增加這些引物檢測短鏈RNA效能的部分原因。核糖核酸(RNA)可以作為模板通過反轉(zhuǎn)錄按照Watson-Crick堿基配對的原則合成產(chǎn)生單鏈的DNA。這種反轉(zhuǎn)錄(RT)必需一小段寡核苷酸(引物)結(jié)合到模板上的互補(bǔ)位點(diǎn)，形成穩(wěn)定的雙鏈體以此作為合成的起始點(diǎn)。一旦雙鏈體形成，只有幾個堿基很短的寡聚核苷酸就足以有效地起始DNA聚合反應(yīng)。在一定的反應(yīng)體系中，RT反應(yīng)的起始效率依賴于引物-RNA雙鏈體的穩(wěn)定性，而溫度極大地影響著雙鏈體穩(wěn)定性。引物-RNA雙鏈體的融化溫度(Tm)是指一半引物-RNA雙鏈體解離時的溫度。弓丨物的Tm值取決于引物的長度和引物-RNA之間形成雙鏈體的組成。當(dāng)與目標(biāo)配對結(jié)合，長度20-30個堿基的一段寡核苷酸就能提供足夠的熱穩(wěn)定性，滿足形成RT反應(yīng)起始點(diǎn)必需之引物-RNA雙鏈體。較短的寡核苷酸作為引物要滿足雙鏈體穩(wěn)定的要求就必須較低的溫度。在較低的溫度時，酶活性較低，DNA多聚反應(yīng)的效率很低，而且由于潛在目標(biāo)位點(diǎn)增多，DNA多聚反應(yīng)的專一性也低。同時在較低溫度時，多核苷酸折疊成超強(qiáng)的二級結(jié)構(gòu)，造成RT的產(chǎn)物比起較高溫度時的產(chǎn)物要短。寡核苷酸的長短對RT引發(fā)效率的影響不大，幾乎所有商業(yè)化的RT試劑盒都選擇了隨機(jī)的六聚物作為合成第一條DNA鏈的引物。在利用這種短的寡聚核苷酸作引物時，鏈內(nèi)引發(fā)是最大的問題，而短鏈多核苷酸模板的二級結(jié)構(gòu)并不會成為主要的問題。避免鏈內(nèi)引發(fā)，引物二聚體形成，提高末端引發(fā)精確度，是設(shè)計(jì)檢測多目標(biāo)短鏈RNA有效引物要解決的幾個關(guān)鍵問題。長度20-30個堿基的寡核苷酸可引發(fā)合成特異目標(biāo)片段，在37°C和以上溫度啟動PCR或RT提供足夠的復(fù)雜度和熱穩(wěn)定性。但這種寡核苷酸太長，對于以微小RNA (miRNA)為模板的短鏈RNA反轉(zhuǎn)錄來說不合適。對于檢測和分析miRNA來說其困難在于miRNA鏈的長度造成很大的熱動力學(xué)挑戰(zhàn)。較短的寡核苷酸可以作為引物在較低溫度下并不會對引發(fā)啟動效率產(chǎn)生不良影響，但是長度過短不可避免地會喪失復(fù)雜度。這種復(fù)雜度極大的喪失會導(dǎo)致在模板鏈的中間增加識別位點(diǎn)(鏈內(nèi)引發(fā)位點(diǎn))，造成非特異的擴(kuò)增。隨著鏈內(nèi)引發(fā)位點(diǎn)量的增多，競爭性消耗反應(yīng)資源，造成總的RT效率和特異性極大降低。所以說短線性引物不可用是由于鏈內(nèi)引發(fā)。miRNA復(fù)雜的生物起源涉及到miRNA原(pri-microRNA) ,miRNA前體(pre-microRNA)和成熟miRNA等，使它的檢測變得進(jìn)一步復(fù)雜。除了鏈內(nèi)引發(fā)，引物分辨引物-模板在3’末端錯配的能力對RT效率也是一個重要的因素。如上所述，這些現(xiàn)有的技術(shù)都存在各自的局限性，妨礙了更廣泛地應(yīng)用。如LNA修飾增加了寡核苷酸的退火溫度(Tm)但卻妨礙了酶的活性。線性引物由于其低特異性和模板鏈內(nèi)引發(fā)效應(yīng)(而非從模板3’端引發(fā))注定其不能用于短鏈RNA檢測的引物。莖環(huán)引物由于莖環(huán)結(jié)構(gòu)的幫助而傾向與目標(biāo)RNA的3’末端結(jié)合，但其比起線性引物至少在啟動效率方面并沒有優(yōu)勢可言，而且很難實(shí)現(xiàn)多引物多通道同時測定。
隨著miRNABase vl8的發(fā)布,我們知道僅在人類就發(fā)現(xiàn)超過1500種不同的miRNA。miRNA表達(dá)譜越來越復(fù)雜，如果在實(shí)際應(yīng)用中不引入較大的改變，用現(xiàn)在的基于莖環(huán)結(jié)構(gòu)引物進(jìn)行多目標(biāo)檢測，操作上越來越難以實(shí)現(xiàn)?；诠丫酆塑账犭s交進(jìn)行的表達(dá)譜工作犧牲了靈敏度和精確度。表達(dá)譜的結(jié)果通常還要再用RT-PCR證實(shí)。RT-PCR方法為較少數(shù)量的miRNA檢測提供了定量、靈敏的方法。但當(dāng)檢測涉及不斷增多的miRNA表達(dá)譜時，這種方法顯然難以處理。miRNA RT-PCR正逐漸退后擔(dān)當(dāng)確認(rèn)有效的角色。當(dāng)前，面臨miRNA研究的熱潮，迫切需要一種準(zhǔn)確、高通量的miRNA表達(dá)譜檢測和分析新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的發(fā)明目的之一在于針對上述存在的問題，提供一種能精確、多目標(biāo)檢測短鏈RNA的引物。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是這樣的一種用于短鏈RNA檢測的歐米茄結(jié)構(gòu)寡核苷酸引物，其從5’端至3’端依次為PCR引物目標(biāo)區(qū)、可變編碼區(qū)、歐米茄莖環(huán)、探針間隔區(qū)和探針區(qū)，其中，所述PCR引物目標(biāo)區(qū)的長度為20-30個堿基，所述可變編碼區(qū)的長度為O- 50個堿基，所述歐米茄莖環(huán)的莖的長度為4-12對配對的堿基，所述配對的堿基為順式結(jié)構(gòu)方式，順式結(jié)構(gòu)方式是指歐米茄莖環(huán)的功能作用是由其結(jié)構(gòu)所直接決定的，而非間接的通過別的方式進(jìn)行；所述歐米茄莖環(huán)的環(huán)的長度為3-20個不配對的堿基，所述探針間隔區(qū)的長度為至少I個堿基，所述探針區(qū)的長度為4-11個堿基。其中，實(shí)驗(yàn)及理論分析表明，PCR引物目標(biāo)區(qū)之所以選擇20-30個堿基，是因?yàn)?0-30個堿基所構(gòu)成的引物可以滿足用于一般PCR所需要的熱力學(xué)穩(wěn)定性和所提供的堿基復(fù)雜性足以區(qū)分?jǐn)U增特定的靶分子；同時，歐米茄莖環(huán)的環(huán)的長度之所以選擇3-20個堿基，是因?yàn)?個堿基是形成莖環(huán)所需的最小堿基數(shù)，6-7個堿基所組成的環(huán)是最理想的，多于20個堿基會對莖環(huán)的形成帶來負(fù)面影響。其中一個例子如圖I所示的引物，其堿基組成為SEQ. NO: I的序列，5’端到3’端，SEQ. ID NO: I
GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCTCTTTTTAGAGCCATCCTGTCAGT引物的最5’端是為PCR擴(kuò)增保留的正義鏈引物區(qū)，即PCR引物目標(biāo)區(qū)；
與所述歐米茄莖環(huán)結(jié)構(gòu)5’端上游相鄰的區(qū)域叫做可變編碼區(qū)，這個區(qū)域的核苷酸數(shù)量和種類，只要不影響莖環(huán)結(jié)構(gòu)的保持，都可自由調(diào)整變化，用來控制終產(chǎn)物的長度和組成，給終產(chǎn)物一個對應(yīng)的標(biāo)簽以此作為檢測不同目標(biāo)的引物標(biāo)簽(或者叫做代碼)；具牢固莖環(huán)結(jié)構(gòu)的歐米茄引物保證了編碼區(qū)可以自由地變化而對引物的引發(fā)特性不產(chǎn)生結(jié)構(gòu)性和功能性的影響。線性引物或其它設(shè)計(jì)的引物都可加入不同長度和組成的核苷酸，但額外核苷酸的加入不可避免對酶反應(yīng)效率產(chǎn)生負(fù)面作用或引起整體結(jié)構(gòu)改變。本發(fā)明利用一個牢固的歐米茄莖環(huán)將寡核苷酸引物結(jié)構(gòu)上分成兩個部分-探針部分和編碼部分。結(jié)構(gòu)上的分割允許在編碼區(qū)加入核苷酸并不會對整體結(jié)構(gòu)或探針雜交能力造成潛在的影響。在編碼區(qū)增加額外堿基引起的結(jié)構(gòu)張力可以被莖吸收緩沖，并不需要調(diào)整變化探針間隔和探針組成。這種長度標(biāo)注的RT-PCR產(chǎn)物可以進(jìn)一步用熒光質(zhì)譜分析，且達(dá)到I個堿基的分辨率
所述歐米茄莖環(huán)的莖是4-12對配對的堿基的莖狀結(jié)構(gòu)，其形成的原理在于設(shè)計(jì)時在這個區(qū)域安排一小段連續(xù)的寡核苷酸，自身退火時與同條寡核苷酸鏈上相鄰的一段區(qū)域，按照watson-crick堿基配對的原則配對形成局部的雙鏈體(也成為莖)，其功能是讓引物-RNA雙鏈體在目標(biāo)RNA的3’端形成，而不是在 目標(biāo)RNA鏈內(nèi)的匹配位點(diǎn)形成；
探針間隔區(qū)是歐米茄莖環(huán)結(jié)構(gòu)和探針區(qū)之間的一小段寡核苷酸，它是本發(fā)明的歐米茄引物引發(fā)功能所必需，至少一個堿基的探針間隔區(qū)對酶活性的釋放是必需的，最佳的探針間隔區(qū)長度根據(jù)所用結(jié)構(gòu)中莖的長度、形狀和大小不同而不同；
探針區(qū)由一小段寡核苷酸序列組成，該序列的設(shè)計(jì)按watson-crick堿基配對的原則，與目標(biāo)RNA 3’端的序列互補(bǔ)配對；探針的長度影響靈敏度和鏈內(nèi)引發(fā)效應(yīng)。較長的探針可以獲得較好的轉(zhuǎn)錄靈敏度。為形成更穩(wěn)定牢固的結(jié)構(gòu)形式，莖序列和長度可以變化，以獲得相同或更佳的效果。如表I所示，一般來說，隨著莖長堿基對增加，引物的結(jié)構(gòu)就越穩(wěn)定，提供的阻礙空間也變大。但通過對堿基成分的改變，可調(diào)節(jié)莖長和熱力學(xué)穩(wěn)定度之間的關(guān)系。例如改變堿基成分能讓12對配對的堿基莖長的結(jié)構(gòu)獲得類似9對配對的堿基莖長的熱力學(xué)穩(wěn)定性。在對等條件下可提供大得多的阻礙空間。例見表I。
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etcercTErrmiGgac 6-β,βο 5,06M5 此外，主干鏈上的修飾被證明可以增強(qiáng)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。一個具體的體現(xiàn)是歐米茄莖上不同位置的核苷酸堿基被鎖核酸替代，較少的配對堿基就可增強(qiáng)該結(jié)構(gòu)。這種變化足以改變對鏈內(nèi)或末端引發(fā)阻礙特性的表現(xiàn)。這方面，核糖核酸可以用來替代莖部位的脫氧核糖核酸得到相同或更好的效果。探針序列直接與目標(biāo)3’端反向互補(bǔ)，本性上是隨意的。探針序列的組成是與特定的目標(biāo)對應(yīng)的。有其它幾種改變探針的方法達(dá)到預(yù)期的效果。為提高或降低引發(fā)效率和引物二聚化，探針的核苷酸可以用修飾后的核苷酸代替，如鎖(LNA)核酸或RNA。對于一個行家能手來說，這些修飾可靈活地運(yùn)用，來提高整體的轉(zhuǎn)錄效率，特異性或克服二聚化以及其它由引物探針序列引起的雜信號。作為優(yōu)選6對配對的堿基莖的RNA和9對配對的堿基莖的DNA是最經(jīng)濟(jì)的結(jié)構(gòu)。本發(fā)明的發(fā)明目的之二在于，提供上述引物的應(yīng)用。所采用的技術(shù)方案為將至少 兩種引物組成混合物，所述至少兩種引物的探針區(qū)的喊基序列不同。作為優(yōu)選用于制備包含所述引物的試劑盒。本發(fā)明進(jìn)一步是關(guān)于任何包含歐米茄引物的試劑盒(套件)。本發(fā)明提及的任何歐米茄引物可以單獨(dú)制成商業(yè)化產(chǎn)品或作為特定應(yīng)用的試劑盒組件。本發(fā)明進(jìn)一步的具體體現(xiàn)是關(guān)于利用上述引物設(shè)計(jì)進(jìn)行單目標(biāo)反轉(zhuǎn)錄檢測，進(jìn)行短鏈RNA個體篩選分析，其應(yīng)用包括但不局限于分子生物學(xué)研究，醫(yī)學(xué)診斷，疾病預(yù)后和法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域。本發(fā)明另一個具體體現(xiàn)是關(guān)于利用上述引物進(jìn)行多目標(biāo)反轉(zhuǎn)錄檢測，進(jìn)行多目標(biāo)短鏈RNA篩選和表達(dá)譜分析，其應(yīng)用包括但不局限于分子生物學(xué)研究，醫(yī)學(xué)診斷，疾病預(yù)后和法醫(yī)鑒定等領(lǐng)域。作為優(yōu)選將所述引物用于檢測單個短鏈RNA或者同時檢測多個短鏈RNA。其原理如圖2所示，用本發(fā)明的歐米茄引物進(jìn)行RT-PCR過程中，第一步，為使歐米茄引物與RNA目標(biāo)位點(diǎn)雜交，將引物與目標(biāo)RNAs混合；引物探針區(qū)與RNA3 ’端和RNA鏈內(nèi)的互補(bǔ)序列區(qū)都能配對結(jié)合；在8熟3’端穩(wěn)固地配對結(jié)合形成的雙鏈體可以成為DNA反轉(zhuǎn)錄的引發(fā)點(diǎn)；而不完整或鏈內(nèi)配對結(jié)合轉(zhuǎn)化效率很低；最后，為做進(jìn)一步探測，用目標(biāo)專一的引物進(jìn)行PCR，將特定產(chǎn)生的cDNA擴(kuò)增；
即產(chǎn)生的DNA模板可以進(jìn)一步用實(shí)時定量PCR做單個或同時多個擴(kuò)增，PCR的產(chǎn)物可以用光譜分析，瓊脂糖凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠電泳方法對單個或多個短鏈RNA進(jìn)行檢測；產(chǎn)生的DNA模板可以進(jìn)一步用熒光標(biāo)記的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，這些PCR產(chǎn)物可以用自動化的DNA測序儀進(jìn)行DNA長度多態(tài)性分析，完成同時對多個短鏈RNA的檢測，
作為優(yōu)選所述突光染料包括但不局限于6-Fam , 5-Fam , Vic , Hex , Tamra ,熒光黃，LiZ ，Ned , Pet ，青色素3，青色素5，若丹明，德克薩斯紅等(AppliedBiosystem, Inc 的產(chǎn)品商品名為 6_Fam , 5-Fam , Vic , Hex , Tamra , LiZ , Ned ,Pet )。也可將已知合成的寡聚核苷酸加入到RNA樣本中混合，作為設(shè)立內(nèi)置對照的方法。示蹤對照的模板可以由核糖核酸組成，也可以是脫氧核糖核酸組成。進(jìn)一步的所述短鏈RNA為18-26個核苷酸組成的microRNA和mRNA降解片段，或者為非編碼的短鏈RNA，降解的DNA碎片片段。本發(fā)明的一個具體描述是在單通道檢測設(shè)置中，目標(biāo)多聚核苷酸是一種microRNA(miRNA，微小RNA)，加入一種獨(dú)特的歐米茄引物其探針序列與上述微小RNA 3’末端的序列反向互補(bǔ)配對。兩段序列靠近，探針與微小RNA 3’端雜交形成穩(wěn)定的雙鏈體。然后反轉(zhuǎn)錄酶利用微小RNA的序列作為模板，延長核苷酸鏈，合成DNA。這一步產(chǎn)生單鏈DNA (ssDNA)。這條單鏈DNA包含歐米茄引物5’端的序列和微小RNA 3’端反向互補(bǔ)序列?？梢赃M(jìn)一步通過檢測這一 DNA來作為顯示微小RNA在特定研究樣品或樣品混合物中的存在和定量的方法學(xué)基礎(chǔ)。本發(fā)明另一些具體的描述是在多通道檢測設(shè)置中，目標(biāo)多核苷酸是一組微小RNAs。加入同樣數(shù)目的歐米茄引物，它們具與各自對應(yīng)目標(biāo)微小RNA3’端反向互補(bǔ)的序列。多通道檢測中，歐米茄引物是以長度編碼或組成編碼，為后面的檢測提供標(biāo)識來識別不同的目標(biāo)。在本文中“多聚核糖核酸”(“Polynucleotides”)一詞指DNA多聚酶的可能底物包括但不局限于DNA，RNA, DNA-RNA雜合物，和修飾后的RNA和DNA等?！癛NA” 一詞指核糖核酸但也包括其它類型的多聚核糖
優(yōu)選之一，上述的目標(biāo)多聚核苷酸是非編碼短鏈RNA。非編碼短鏈RNA包括存在于真核細(xì)胞中的短鏈核RNA(snRNA)、短鏈核仁RNA (snoRNA)和短鏈非編碼RNA (ncRNA)。優(yōu)選之一，上述的目標(biāo)多聚核苷酸是信使RNA (mRNA)和信使RNA斷片。信使RNA被3’端poly (A)和有些，如組蛋白信使RNA是修剪后的poly (U)叢保護(hù)。這些鮮明的特征都可以用歐米茄引物檢測，并進(jìn)一步發(fā)展成對樣品中信使RNA定性和定量的方法。
本發(fā)明描述的上述結(jié)構(gòu)引物與已有的引物和線性引物極大不同。不同之處包括
1.本發(fā)明的歐米茄引物以一個堅(jiān)固的莖環(huán)為結(jié)構(gòu)特征，這個結(jié)構(gòu)可以阻礙酶的接近和維系結(jié)構(gòu)的構(gòu)造；
2.本發(fā)明的探針間隔是解除酶活性空間阻礙，使酶與探針-目標(biāo)雙鏈體接近必需的條
件；
3.歐米茄引物阻礙的程度由歐米茄莖的長度和環(huán)的大小決定；
4.本發(fā)明的歐米茄引物的結(jié)構(gòu)影響目標(biāo)位點(diǎn)引物-模板熱力學(xué)參數(shù)；
5.本發(fā)明的歐米茄引物不抑制酶的活性；
6.本發(fā)明的歐米茄引物辨別3’端是否錯配的機(jī)理在于酶接近的阻礙機(jī)制而非依賴增加Tm。具體的，本發(fā)明的引物與線性引物不同之處在于它具有一個特征性的莖環(huán)結(jié)構(gòu)作為整個引物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定器。綜上所述，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果是具有本發(fā)明的這種結(jié)構(gòu)的引物與線性引物相比，可以提供從RNA 3’端同等引發(fā)效能，同時又避免了鏈內(nèi)啟動和引物二聚體化。因此比起線性引物，在各種檢測設(shè)置時使用的引物量大大減少；歐米茄引物可以通過防止目標(biāo)鏈內(nèi)引發(fā)、抑制引物二聚體形成以及增加探針在3’末端目標(biāo)雜交精確度，提高轉(zhuǎn)錄特異性和靈敏度。在實(shí)際應(yīng)用中，就可以用較少的引物取得較高的RT效率和較好的特異性，同時在一個反應(yīng)體系中可加入檢測不同目標(biāo)的多個引物，由于引物標(biāo)簽的不同，可以同時區(qū)分不同的檢測目標(biāo)而來的PCR產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)多通道高通量檢測，大大提高了檢測效率。


圖I是其中一種歐米茄引物的結(jié)構(gòu)，其中，A :PCR引物目標(biāo)區(qū)或者叫做PCR正義鏈弓丨物區(qū)；B :可變編碼區(qū)；C :探針間隔區(qū)；D :探針區(qū)；E :歐米茄莖環(huán)；
圖2是本發(fā)明的歐米茄引物進(jìn)行miRNA RT-PCR擴(kuò)增過程示意 圖3是RNA寡聚鏈和DNA寡聚鏈穩(wěn)定性比較；
圖4是本發(fā)明的歐米茄引物莖長與探針間隔區(qū)的功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果 其中，4 nt板4對堿基對莖長的歐米茄引物；5 nt板5對堿基對莖長的歐米茄引物；6 nt板6對堿基對莖長的歐米茄引物；7 nt板7對堿基對莖長的歐米茄引物；8 nt板8對堿基對莖長的歐米茄引物。條帶I.按照文獻(xiàn)設(shè)計(jì)的莖環(huán)引物作為對照；條帶2.線性引物；條帶3.無探針間隔的歐米茄引物；條帶4.有I個堿基探針間隔的歐米茄引物；條帶5.有2個堿基探針間隔的歐米茄引物；條帶6.有3個堿基探針間隔的歐米茄引物；條帶7.有4個喊基探針間隔的歐米爺引物；條帶8.有5個喊基探針間隔的歐米爺引物；條帶9.有6個喊基探針間隔的歐米爺引物；條帶10.有7個喊基探針間隔的歐米爺引物；條帶11.有8個堿基探針間隔的歐米茄引物；條帶12.滅菌水作為陰性對照； 圖5是探針區(qū)長度對反轉(zhuǎn)錄效率和鏈內(nèi)引發(fā)影響的對比 圖中，A :莖環(huán)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，B :線性引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，C :歐米茄引物作為反轉(zhuǎn)錄引物；模板的稀釋度為 I 3χ106/μ I ; 2: 3χ105/μ I ;3: IxlO4/μ I ；4: 3χ103/μ I ;5:水作為陰性對照；
圖6是莖環(huán)引物，線性引物和歐米茄引物3’末端引發(fā)效率和精確度比較結(jié)果圖；其中，A :莖環(huán)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，B :線性引物作為反轉(zhuǎn)錄引物，C :歐米茄引物作為反轉(zhuǎn)錄引物。模板的稀釋度為 I: 3χ106/μ I ; 2: 3χ105/μ I ;3: IxlO4/μ I ；4: 3χ103/μ I ；5水作為陰性對照。圖7是歐米茄引物RT-PCR產(chǎn)物片段大小的熒光分析結(jié)果 圖8是二聚化實(shí)驗(yàn)結(jié)果 其中，條帶I :探針區(qū)9個喊基的莖環(huán)引物；條帶2 :探針區(qū)9個喊基的線性引物；條帶3:探針區(qū)9個喊基,6對喊基莖長的歐米爺引物；條帶4 :探針區(qū)10個喊基的莖環(huán)引物條帶5 :探針區(qū)10個喊基的線性引物；條帶6:探針區(qū)10個喊基,6喊基莖長的歐米爺引物；7 Η20對照.；條帶8 :探針區(qū)9個喊基的莖環(huán)引物；條帶9 :探針區(qū)9個喊基的線性引物；條帶10 :探針區(qū)9個喊基,8對喊基莖長的歐米爺引物；條帶11:探針區(qū)10個喊基的莖環(huán)引物；條帶12 :探針區(qū)10個喊基的線性引物；條帶13 :探針區(qū)10個喊基,8對喊基莖長的歐米茄引物；條帶14 =H2O對照。圖9是單細(xì)胞水平檢測Hl299細(xì)胞株RNU44 RNA實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖
板I :從10個細(xì)胞提取的RNA用10 μ I反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)體系，RT反應(yīng)產(chǎn)物用水稀釋10倍，取I μ I用30 μ IPCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。板2 :從I個細(xì)胞提取的RNA用10 μ I反轉(zhuǎn)錄(RT)反應(yīng)體系，RT反應(yīng)產(chǎn)物用水稀釋10倍，取I μ I用30 μ IPCR反應(yīng)體系擴(kuò)增。
表I.不同莖結(jié)構(gòu)的吉布斯自由能分布。對不同莖長度自由能的計(jì)算采用HiFold程序
(10)。莖長從4-12對堿基，分別以RNA和DNA兩種形式比較。這表明隨著莖長堿基對增加，引物的結(jié)構(gòu)就越穩(wěn)定。人類組蛋白信使RNA的6堿基莖環(huán)用作參考。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖，對本發(fā)明作詳細(xì)的說明。為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實(shí)施例，對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。實(shí)施例I :RNA寡聚鏈和DNA寡聚鏈穩(wěn)定性比較實(shí)驗(yàn)如圖3所示，6對配對的堿基莖的RNA和9對配對堿基莖的DNA是最經(jīng)濟(jì)的結(jié)構(gòu)。RNA和DNA的主干鏈有所不同，對維持二級結(jié)構(gòu)的能量貢獻(xiàn)也不相同。隨著莖區(qū)配對核苷酸增力口，吉布斯自由能下降。但是每個添加的堿基對結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的貢獻(xiàn)依據(jù)它的位置不同而有所不同，例如，4對堿基的凸莖RNA添加一個堿基對，自由能下降-0.9 kcal/mole (大卡/摩爾)，5個堿基的凸莖RNA添加一個堿基對，自由能量下降-3. 6 kcal/mole。6對堿基對的凸莖RNA是最經(jīng)濟(jì)的結(jié)構(gòu)，它以最少的核苷酸得到自由能最大收獲。6對堿基對的凸莖結(jié)構(gòu)是最常見的RNA結(jié)構(gòu)元素，如組蛋白信使RNA的3’端這種結(jié)構(gòu)代替了 polyA尾巴，防止由3’端到5’端的外切核苷酸衰退。miRNA基礎(chǔ)配對也僅必需6對核苷酸，它是一個完整螺旋的基本核苷酸數(shù)。而對于DNA，8對堿基對或9對堿基對的凸莖才能提供與RNA對應(yīng)物相當(dāng)?shù)淖杂赡軐?shí)施例2 :本發(fā)明的歐米茄引物的探針間隔區(qū)的功能實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)合成的TPL6其鏈內(nèi)一段序列與其3’端序列一樣，作為模板。
TPL6 序列(互補(bǔ)鏈)SEQ ID NO: 2
SiGTCAGrTAGAGCTAATTAAGACCTTCAI GTTC AGT CAGTTATT GC TTATCATCATCCAGGS-用8對堿基對莖長的歐米茄引物來模擬RT反應(yīng)，斜體字的核苷酸用來做探針間隔區(qū)。
I.GT-SCTSAGTCACGASSTA'TTCTftCGTSACTCAGCii.CGTCAST 荃環(huán)引卿對醒 e&Q ID NOi'S
2‘5Γ3CTSAGTCa-GA3GTSTTCTaGTGAGTSSC It SC : 4 3.GTSCT3AGTCACGA33TTASSCACTCTTTTmGASTGCCGTCAGTSEQ IC SO; 5 4 .GTjOT3&GTCJtCGA^3GTAT!rCxa3G CACTC3TTTTAG&aTGCCACJrCIIGTSEQ ID SO: to S.GT3CT3AGTCA2GA^SGTATTCSfSCACTCTTTTmGAST4SCCJiJSTCAeTSEy ID NO;
6 .GTdCT3J-.GTCACGA33TSTTCTA3GCSCT3TTΓΤ Α 3Α0TOCCATCOTCMSXSEQ XE· SO :3
.GTSCTSaGTCftCGAGGTATTCTASGCACTCTTiTTAGAG^SCCSTirGTCAGTSEC IC SC·: 3
3.GISCTS&GTCACiSA33TATTCTASC-iACTCTTf ima4S j>3CCATTCCQTOmT SEQ IE· MO: ID
9.GTGCTSAGTCRSGRZdS-ΤΛ T CTASPCACT^ΤΤΤΨΤΙ>,ΘΑ5Ψ5CCATTCCTOTCftGT SEQ Ti> SO: 11
10.GTSCT3AGTCA2GA3GTATTC,XASGCACTCTT2*T*rAG&3TGCC^^g.CTCACT SEC ID STC : 12
11,GT+.SCTSAGTCSmASyiSTTirTSSKSlCTCTTrrmGAGTGee^^^fil0101 SEW γε< SC: 13
12,H0 作為S曰對嚴(yán)用Ix TE緩沖液溶解RT引物，濃度為50 μ M。加I μ I引物到500 μ I Η20稀釋，每個RT反應(yīng)用I μ I稀釋后的引物。用滅菌水對TPL6進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋度IO7 -IO12作為模板。5 μ I RT反應(yīng)體系由Ix PCR緩沖液，O. IxTE, 50 nM歐米茄引物，0.05u/μ I Taq DNA多聚酶和不同稀釋度的TPL6模板組成。RT反應(yīng)的條件是37°C反應(yīng)10分鐘，20°C反應(yīng)I分鐘和37°C反應(yīng)10秒交替重復(fù)60次，37°C反應(yīng)30分鐘，42°C反應(yīng)20分鐘，然后保存在4°C。上述反應(yīng)完后，每管加入25 μ I含有PCR正義引物和反義引物的PCR反應(yīng)主液，最終體積30 μ 1，組成成分是Ix PCR緩沖液，0.05 u/μ I Taq DNA多聚酶，50 μ M每種PCR引物。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件是95°C反應(yīng)4分鐘，95°C反應(yīng)15秒_61°C反應(yīng)30秒-72°C反應(yīng)20秒交替重復(fù)30次，95°C反應(yīng)15秒-61°C反應(yīng)2分鐘_72°C反應(yīng)I分鐘交替重復(fù)5次，72°C反應(yīng)10分鐘，然后保存在4°C。PCR產(chǎn)物跑3%的瓊脂糖凝膠電泳，條件是Ix TB緩沖液，電壓100 V跑80分鐘，完后照相。結(jié)果見圖4.
4-8對堿基對不同莖長的歐米茄引物按上述操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測試它們的莖長、探針間隔對引發(fā)效能的影響。結(jié)果總結(jié)見圖4，合成的TPLl作為Taq DNA多聚酶的模板模擬反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。對不同莖長的歐米茄引物比較，用Taq DNA多聚酶延長引物完成DNA合成，隨后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。一個優(yōu)化后的6-12個堿基歐米茄莖可以阻礙酶靠近凸莖附近的引物-模版雙鏈體，正如圖4證明的，比起相應(yīng)的線性引物歐米茄引物的DNA多聚反應(yīng)效率降低。將配對識別的位點(diǎn)一個堿基一個堿基向遠(yuǎn)離歐米茄莖移動，多聚酶得以接近反應(yīng)位點(diǎn)，隨著探針間隔的延長酶的活性提高。在圖4中，忽略鏈內(nèi)引發(fā)現(xiàn)象，不同長度歐米加莖的引物以線性引物為對照，其引發(fā)的多聚反應(yīng)急劇降低，而隨著探針間隔的延長多聚反應(yīng)改善。這意味著抑制作用發(fā)生在歐米茄莖中心區(qū)，而探針間隔對空間的擴(kuò)展可以抵消這種抑制作用。莖的長度越長，抵消酶接近性抑制所需要的探針間隔核苷酸就越多。例如酶活性被8對堿基對的莖完全抑制，但加上5個或更多 堿基的探針間隔，酶活性就得以恢復(fù)。這表明莖的酶接近阻礙作用被探針到莖結(jié)構(gòu)的距離遠(yuǎn)近所影響。因此可以推測，探針間隔區(qū)加入越多的核苷酸，歐米茄引物的表現(xiàn)就越像它對應(yīng)的線性引物。引發(fā)檢測短鏈RNA最重要的一項(xiàng)要求就是避免鏈內(nèi)引發(fā)的發(fā)生。隨著探針間隔區(qū)的過度延長，歐米茄引物除了引物二聚體形成阻抑的特性外，將獲得線性引物所有的引發(fā)特性。但在一個較窄的范圍，比起3’末端的位點(diǎn)，歐米茄莖結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出對鏈內(nèi)位點(diǎn)更多的抑制作用。歐米茄莖阻礙的范圍取決于莖的長度和環(huán)的大小尺寸?？傊?，較長的莖覆蓋更大范圍的阻礙空間，提供更好的阻礙作用。延長探針間隔，使探針與莖環(huán)之間的距離更遠(yuǎn)將增加引物的鏈內(nèi)引發(fā)能力，使引物更像是一個線性化的引物。不表現(xiàn)出鏈內(nèi)引發(fā)的最大探針間隔區(qū)堿基數(shù)加上探針長度被視為歐米茄莖結(jié)構(gòu)的有效阻礙范圍。阻礙范圍被用來衡量不同歐米茄莖的鏈內(nèi)引發(fā)的抑制作用。圖4中，8對堿基莖的歐米茄引物的阻礙范圍是12個堿基，計(jì)算方法是6個堿基的探針間隔區(qū)加上6個堿基的探針長度。在這個引物的探針間隔區(qū)增加I個堿基就可能出現(xiàn)鏈內(nèi)引發(fā)現(xiàn)象。這個結(jié)果表明鏈內(nèi)位點(diǎn)和3’末端位點(diǎn)抑制作用的解除是以不同的程度進(jìn)行。這種現(xiàn)象的可能解釋是探針-目標(biāo)雙鏈體的穩(wěn)定性受目標(biāo)位點(diǎn)位置的影響。我們認(rèn)為阻礙酶接近是歐米加引物工作的原理之一。另外歐米茄莖也是引物-模板在3’端位點(diǎn)和鏈內(nèi)位點(diǎn)之間產(chǎn)生差異引發(fā)的原因。歐米茄莖環(huán)對其附近核苷酸的空間構(gòu)象有很大的影響。由于沒有額外的核苷酸處在歐米茄莖構(gòu)象影響范圍，對于3’末端的配對不會有問題。而鏈內(nèi)位點(diǎn)非配對的3’端伸進(jìn)歐米茄莖的構(gòu)象袋子里，使得在RNAs鏈中間形成雙鏈體很困難。這種構(gòu)像的扭曲可以改變歐米茄莖對鏈內(nèi)位點(diǎn)和3’端位點(diǎn)的阻礙范圍。實(shí)施例3探針區(qū)長度對反轉(zhuǎn)錄效率和鏈內(nèi)引發(fā)影響的對比實(shí)驗(yàn) 使用的探針類型是
A:莖環(huán)引物 +下列每個板所示的探針 B:線性引物 +下列每個板所示的探針 C:歐米茄引物 +下列每個板所示的探針 板1-5所用TLP5模板序列是(互補(bǔ)鏈)
3;末靖位點(diǎn)鏈內(nèi)位點(diǎn)
35~ACTCAGTTAGAGCl^lA^GACOTMOTCL4GTCAGIX4TTGCrriSMOTCCAGG SEQ 工D NO: 14引物探針序列如下
板 I. AGT 板 2. AGTC 板 3. AGTCA 板 4. AGTCAG 板 5. AGTCAGT
板6所用模板TLPl-沒有鏈內(nèi)位點(diǎn)，序列是(互補(bǔ)鏈)
3，- AGTCAGTTAGAGCTA,CX\.\GACCrTC；\T CtTCAGT CAGCflTTGCTlAT MttTCCAGG SEQ XD NO15
探針序列是
板 6. AGTCAGT
引物用IxTE溶解濃度50 μ M, 950C 10”變性，65°C保持5’，然后冷卻至室溫。加I μ I引物到500 μ I Η20稀釋，每個RT反應(yīng)用I μ I稀釋后的引物。用滅菌水對TPL5進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋度IO7 - IO12作為模板。5 μ I RT反應(yīng)體系由Ix PCR緩沖液，O. ΙχΤΕ，50 nM歐米茄引物，0.05 u/μ I Taq DNA多聚酶和不同稀釋度的TPL5模板組成。RT反應(yīng)的條件是37°C 10分鐘，20°C I分鐘和37°C 10秒交替重復(fù)60次，37°C 30分鐘，42°C20分鐘，然后保存在4°C。上述反應(yīng)完后，每管加入25 μ I含有PCR正義引物和反義引物的PCR反應(yīng)主液，最終體積30 μ 1，組成成分是Ix PCR緩沖液，0.05 u/μ I Taq DNA多聚酶，50 μ M每種PCR primer。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件是95°C 4分鐘，95°C 15秒_61°C30秒-72°C 20秒交替重復(fù)30次，95°C 15秒_61°C 2分鐘_72°C I分鐘交替重復(fù)5次，720C 10分鐘，然后保存在4°C。PCR產(chǎn)物跑3%的瓊脂糖凝膠電泳，條件是Ix TB緩沖液，電壓100 V跑80分鐘，完后照相。3-7個堿基長度探針的歐米茄引物按上述操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測試它們的莖長、探針間隔對引發(fā)效能的影響。結(jié)果總結(jié)見圖5。探針的長度影響靈敏度和鏈內(nèi)引發(fā)效應(yīng)。較長的探針可以獲得較好的轉(zhuǎn)錄靈敏度。正如圖5結(jié)果所示，隨著探針長度變長，由鏈內(nèi)引發(fā)RT產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物減少。在板6中，當(dāng)使用沒有鏈內(nèi)引發(fā)位點(diǎn)的模板時，效率會增加。相比之下，由于鏈內(nèi)引發(fā)位點(diǎn)的存在線性引物的打分就很差。RT弓丨物在RNA目標(biāo)3’末端的弓I發(fā)精確度是RT弓丨物整體可用的關(guān)鍵。圖6中，歐米茄引物擴(kuò)增配對的目標(biāo)非常好，比板3中懸臂錯配的引物或板I中截短錯配的引物，要好100倍。板3中，線性引物不能區(qū)分由懸臂引起的不同。也不奇怪線性引物對截短錯配的擴(kuò)增很低。關(guān)于這一點(diǎn)，莖環(huán)引物類似線性引物。表明歐米茄引物的優(yōu)勢在于辨別正確的末端，這種性能是多通道檢測應(yīng)用所需要的最重要特征。實(shí)施例4莖環(huán)引物，線性引物和歐米茄引物3’末端引發(fā)效率和精確度比較實(shí)驗(yàn) 合成的帶鏈內(nèi)目標(biāo)識別序列(下列序列中的粗體)的TPL5作為模板，莖環(huán)引物、線性引
物和歐米茄引物之間從3’端和鏈內(nèi)目標(biāo)序列轉(zhuǎn)錄引發(fā)的性能和精確度比較。TPL5模板在3’端和鏈中間都有9個一樣的堿基序列，預(yù)計(jì)都可與引物的探針區(qū)配對識別所用引物類型如下
A:莖環(huán)引物 +下列每個板所示的探針B:線性引物 +下列每個板所示的探針 C:歐米茄引物+下列每個板所示的探針 板I - 5所用模板序列是(互補(bǔ)鏈)
3’末端位點(diǎn)鏈內(nèi)位點(diǎn)
3s'4GTCAGTTAGAOTMmy%GACcrr rGncAGTCAGTTArrGCTMMCM0CAGG SEQ XD NO: 14 每個板所用引物的探針序列如下
板 I. CAGTCA 板 2.AGTCAG
板 3.GTCAGT
板 4.TCAGTT
板 5.CAGTTA
引物用IxTE溶解濃度50 μ M, 950C 10”變性，65°C保持5’，然后冷卻至室溫。加I μ I引物到500 μ I Η20稀釋，每個RT反應(yīng)用I μ I稀釋后的引物。用滅菌水對TPL5進(jìn)行10倍系列稀釋，稀釋度IO7 - IO12作為模板。5 μ I RT反應(yīng)體系由Ix PCR緩沖液，O. ΙχΤΕ，50 nM歐米茄引物，0.05 u/μ I Taq DNA多聚酶和不同稀釋度的TPL5模板組成。RT反應(yīng)的條件是37°C 10分鐘，20°C I分鐘和37°C 10秒交替重復(fù)60次，37°C 30分鐘，42°C20分鐘，然后保存在4°C。上述反應(yīng)完后，每管加入25 μ I含有PCR正義引物和反義引物的PCR反應(yīng)主液，最終體積30 Ul，組成成分是Ix PCR緩沖液，0.05 u/μ I Taq DNA多聚酶，50 μ M每種PCR primer。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件是95°C 4分鐘，95°C 15秒_61°C30秒-72°C 20秒交替重復(fù)30次，95°C 15秒_61°C 2分鐘_72°C I分鐘交替重復(fù)5次，720C 10分鐘，然后保存在4°C。PCR產(chǎn)物跑3%的瓊脂糖凝膠電泳，條件是Ix TB緩沖液，電壓100 V跑80分鐘，完后照相。3-10個堿基長度的探針按上述操作進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，測試它們的莖長、探針間隔對引發(fā)效能的影響。結(jié)果總結(jié)見圖6，結(jié)果表明，歐米茄引物可以分辨目標(biāo)3’末端的配對和錯配，用于板I的雜交探針和靶分子有一個堿基的空位，歐米茄引物可測到IxlO4個分子，相較于板2中完全配對的歐米茄引物，引發(fā)效率降低至少10倍。線性引物和莖環(huán)引物對空位配對的區(qū)別可達(dá)100倍。板3是靶分子突出錯配，歐米茄引物的區(qū)別能力達(dá)100倍。而線性引物和莖環(huán)引物均不能區(qū)分突出錯配。突出錯配越多，引物識別能力的差別越大。盡管線性引物和莖環(huán)引物對堿基空位錯配的識別能力約高于歐米茄引物，但歐米茄引物的綜合識別能力明顯優(yōu)于前二者。實(shí)施例5本發(fā)明的歐米茄引物RT-PCR產(chǎn)物片段大小的熒光分析
用合成的具有鏈內(nèi)目標(biāo)序列的上述的TPL5作為模板，比較歐米茄引物從3’端和鏈內(nèi)目標(biāo)序列轉(zhuǎn)錄引發(fā)的性能。突光標(biāo)記PCR引物,擴(kuò)增產(chǎn)生的產(chǎn)物用Abi Prizm 310 GeneticAnalyzer (基因分析儀)測定。對鏈內(nèi)啟動和末端啟動產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物片段大小分離和定量分析。結(jié)果如圖7所示，表明在做多樣品測定時，片段大小的分辨率可達(dá)到I個堿基。實(shí)施例6引物二聚化對比實(shí)驗(yàn)
比較6個堿基莖的歐米茄引物和8個堿基莖的歐米茄引物對二聚體化的抑制能力。不加入模板但將引物放入DNA多聚酶反應(yīng)體系。結(jié)果如圖8所示6對堿基莖的歐米茄引物擴(kuò)增的二聚體用箭頭A標(biāo)示；條帶10和條帶13中沒有引物二聚體擴(kuò)張帶，即8對堿基莖的歐米茄沒有引物二聚體擴(kuò)增帶，表明引物二聚體化能被8對堿基莖歐米茄引物的莖環(huán)抑制。線性引物擴(kuò)增二聚體用箭頭B標(biāo)示，表明與歐米茄引物具有相同的探針區(qū)的線性引物，相同條件下出現(xiàn)了二聚體，擴(kuò)增的歐米茄引物單聚體用箭頭C標(biāo)示；可以看出，本發(fā)明的牢固的莖環(huán)結(jié)構(gòu)可防止引物二聚體化。實(shí)施例7單細(xì)胞水平檢測Hl299細(xì)胞株中RNU44 RNA 測試的引物如下
1.LS143，莖環(huán)引物(對照)，SEQ ID NO: 16 CTAGAATACCTCGTGGTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAG AGTCAGTTAG
2.LS16，8對堿基莖-4個堿基的探針間隔-6個堿基的探針，SEQ ID NO: 17 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTC-GTCAGT
3.LS61，8對堿基莖-5個堿基的探針間隔-6個堿基的探針，SEQ ID NO: 18 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-GTCAGT
4.LS62，8對堿基莖-6個堿基的探針間隔-6個堿基的探針，SEQ ID NO: 19 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCCT-GTCAGT
5.LS64，8對堿基莖-8個堿基的探針間隔-6個堿基的探針，SEQ ID NO: 20 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCCTAT-GTCAGT
6.LS63，8對堿基莖-6個堿基的探針間隔-7個堿基的探針，SEQ ID NO: 21 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCCT-AGTCAGT
7.LS139，8對堿基莖-5個堿基的探針間隔_7個堿基的探針，SEQ ID NO: 22 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-AGTCAGT
8.LS140，8對堿基莖-5個堿基的探針間隔-8個堿基的探針，SEQ ID NO: 23 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-AGTCAGTT
9.LS141，8對堿基莖-5個堿基的探針間隔-9個堿基的探針，SEQ ID NO: 24 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-AGTCAGTTA
10.LS142，8對堿基莖-5個堿基的探針間隔-10個堿基的探針，SEQ ID NO: 25 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACTCTTTTTAGAGTGCC-ATTCC-AGTCAGTTAG
11.LS147，8對堿基莖-5個堿基的探針間隔-10個堿基的探針，SEQ ID NO: 26 GTGCTGAGTCACGAGGTATTCTAGGCACgCTTTTTTTAGcGTGCC-ATTCC-AGTCAGTTAG
12.H2O
歐米茄引物反轉(zhuǎn)錄引發(fā)的效能用H1299細(xì)胞株單細(xì)胞提取的總RNA進(jìn)行比較。H1299細(xì)胞用RPMI+10% FBS培養(yǎng)液培養(yǎng)。細(xì)胞用Trypsin-EDTA液處理收集，在PBS液中計(jì)數(shù)。然后細(xì)胞在 37°C用含 O. 4 u/ μ I proteinase K和 2 u/ μ I Rnase Inhibitor的細(xì)胞裂解液裂解20分鐘。Protenase K在75°C滅活10分鐘。相當(dāng)于10個細(xì)胞、I個細(xì)胞、O. I個細(xì)胞、O. 01個細(xì)胞、O. 001個細(xì)胞量的總RNA作為檢測RNU44的模板。上述RT引物用50 μ M in IxTE溶解，95°C變性10秒鐘，65°C保持5分鐘，然后冷卻到室溫。每種引物取Ιμ 用500 μ I Η20稀釋，取I μ I稀釋后的引物加入到每個IOul的RT反應(yīng)體系中。RT反應(yīng)的條件是37°C 10分鐘，20°C I分鐘和37°C 10秒交替重復(fù)60次，37°C 30分鐘，42°C 20分鐘，然后保存在4°C。取I μ I RT反應(yīng)的產(chǎn)物加入到30ul的含PCR正義和反義引物的反應(yīng)體系中，Taq DNA polymerase最終濃度為O. 05 u/μ I每種PCR引物濃度為50 μ M0 PCR擴(kuò)增反應(yīng)的條件是95°C 4分鐘，95°C 15秒_61°C 30秒_72°C 20秒交替重復(fù)30次，95°C 15秒-61°C 2分鐘_72°C I分鐘交替重復(fù)5次，72°C 10分鐘，然后保存在4°C。PCR產(chǎn)物用3% agarose膠，用Ix TB緩沖液，電泳條件為100 V, 80 min.。最后觀察照相。每個RT引物都擴(kuò)增出專一的RNU44單條帶。除了約60bp的引物單聚體，歐米茄引物沒有引物二聚體和非特異信號的出現(xiàn)。相反，在stem loop對照和水對照出現(xiàn)引物二聚體和非特異信號。用優(yōu)化后的歐米茄RT引物，可以成功檢測來自O(shè). 5-0. 00005個細(xì)胞RNA中的RNU44 RNA。如圖9所不，8對喊基莖加上6個喊基的探針間隔加上6個喊基探針的歐米茄引物給出最好的分辨率。從H1299細(xì)胞中擴(kuò)增RNU44 RNA的結(jié)果與用合成的模擬模板所做的結(jié)果是吻合的。
權(quán)利要求
1.一種用于短鏈RNA檢測的歐米茄結(jié)構(gòu)寡核苷酸引物，其特征在于其從5’端至3’端依次為PCR引物目標(biāo)區(qū)、可變編碼區(qū)、歐米茄莖環(huán)、探針間隔區(qū)和探針區(qū)，其中，所述PCR引物目標(biāo)區(qū)的長度為20-30個堿基，所述可變編碼區(qū)的長度為0-50個堿基，所述歐米茄莖環(huán)的莖的長度為4-12個配對的堿基，所述配對的堿基為順式結(jié)構(gòu)方式，所述歐米茄莖環(huán)的環(huán)的長度為3-20個不配對的堿基，所述探針間隔區(qū)的長度為至少I個堿基，所述探針區(qū)的長度為4-11個堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述用于短鏈RNA檢測的歐米茄結(jié)構(gòu)寡核苷酸引物，其特征在于所述歐米茄莖環(huán)的莖的為6對配對的堿基組成的RNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述用于短鏈RNA檢測的歐米茄結(jié)構(gòu)寡核苷酸引物，其特征在于所述歐米茄莖環(huán)的莖的為9對配對的堿基組成的DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述用于短鏈RNA檢測的歐米茄結(jié)構(gòu)寡核苷酸引物，其特征在于所述歐米茄莖環(huán)的莖的堿基具有LNA修飾。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述用于短鏈RNA檢測的歐米茄結(jié)構(gòu)寡核苷酸引物，其特征在于其堿基組成為SEQ. ID NO: I的序列。
6.權(quán)利要求I至5任意一項(xiàng)所述的引物的應(yīng)用，其特征在于將至少兩種引物組成混合物，所述至少兩種引物的探針區(qū)的堿基序列不同。
7.權(quán)利要求I至5任意一項(xiàng)所述的引物的應(yīng)用，其特征在于用于制備包含所述引物的試劑盒。
8.權(quán)利要求I或5所述的引物的應(yīng)用，其特征在于將所述引物用于檢測單個短鏈RNA或者同時檢測多個短鏈RNA。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于所述短鏈RNA為18-26個核苷酸組成的microRNA和mRNA降解片段，或者為非編碼的短鏈RNA，降解的DNA碎片片段。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種于短鏈RNA檢測的歐米茄結(jié)構(gòu)寡核苷酸引物，其從5’端至3’端依次為20-30個堿基的PCR引物目標(biāo)區(qū)、0-50堿基的可變編碼區(qū)、歐米茄莖環(huán)、至少1個堿基的探針間隔區(qū)和4-11個堿基探針區(qū)，所述歐米茄莖環(huán)的莖的長度為4-12個配對的堿基，所述歐米茄莖環(huán)的環(huán)的長度為3-20個不配對的堿基，本發(fā)明的這種結(jié)構(gòu)的引物可以避免鏈內(nèi)啟動和引物二聚體化，可以增加探針在3’末端目標(biāo)雜交精確度，提高轉(zhuǎn)錄特異性和靈敏度，可以用較少的引物取得較高的RT效率和較好的特異性，同時在一個反應(yīng)體系中可加入檢測不同目標(biāo)的多個引物，可以同時區(qū)分不同的檢測目標(biāo)而來的PCR產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)多通道高通量檢測，大大提高了檢測效率。
文檔編號C12Q1/68GK102618651SQ20121010831
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月19日
發(fā)明者唐放, 張松柏, 張菲菲, 蔣國彪 申請人:成都諾恩生物科技有限公司