專利名稱：快速檢測鹿源性鹿產品真?zhèn)蔚膒cr試劑盒及制備方法
技術領域：
本發(fā)明公開一種快速檢測鹿源性鹿產品真?zhèn)蔚腜CR試劑盒，用于快速準確識別鹿產品，屬于生物檢測試劑盒技術領域。
背景技術：
鹿產品是鹿的一些組織或者器官，主要包 括有鹿茸，鹿心，鹿腎，鹿胎，鹿筋，鹿鞭，鹿尾，鹿肉和鹿血等。由于鹿產品大多為名貴中藥材，價格昂貴，所以市場上屢見用偽劣產品來冒充名貴的鹿產品。目前，鹿產品的鑒定大多采用傳統(tǒng)方法，主要包括性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定。雖然傳統(tǒng)鑒定方法簡單、快捷、成本低，但影響傳統(tǒng)鑒定方法的因素很多(如人為因素、環(huán)境因素、營養(yǎng)因素)，因而不能準確地判斷鹿產品的偽劣情況。比如在鹿產品的加工過程中，其性狀、顯微結構、理化性質等常常發(fā)生改變，利用傳統(tǒng)鑒定方法來鑒定鹿產品可能會出現(xiàn)誤判。然而，分子鑒定方法(基于DNA的方法)不受這些因素的影響，且具有準確性大、靈敏度高、穩(wěn)定性好、通用性強等特點。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供一種檢測鹿源性鹿產品真?zhèn)蔚目焖贆z測方法，解決了鹿產品中是否含有梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿、馴鹿的成分問題。本發(fā)明還提供了上述快速檢測鹿產品的PCR試劑盒的制備方法，通過一個PCR方法反應體系采用一步反應來鑒別鹿產品中的鹿源性成分。本發(fā)明提供的快速檢測鹿源性產品的PCR試劑盒，其特征在于
包括DNA提取液、PCR反應液和陰性標準品
所述的DNA提取液
(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8) : 12-13份Tris堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgC12，4-5份NaCl,余份為水；
(2)細胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；
所述的PCR反應液
ddH20、10 X PCR Buffer、dNTPs、上游引物、下游引物、酶；
具體引物序列為
上游引物5 ’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3，
下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
陰性標準品為無菌雙蒸水。本發(fā)明所述快速檢測鹿源性鹿產品的PCR試劑盒的制備方法，包括以下步驟
I)DNA提取液
(1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水；
(2)細胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液；
2)PCR反應液
(1)引物設計
在梅花鹿，赤鹿，馬鹿，塔里木馬鹿和馴鹿線粒體D-Ioop區(qū)設計引物，包括一個上游引物和一個下游引物。序列如下
上游引物5’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
(2)PCR反應液
ddH20 9. 3ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，上游引物(20 uM)
0.5ul，下游引物(20 uM) 0. 5ul，酶(5U/ul) 0.2ul。(3)陰性標準品為無菌雙蒸水。本發(fā)明的鹿源性鹿產品PCR檢測的使用方法
(1)從待檢樣品中提取基因組DNA；
(2)制備PCR反應體系
取步驟(I)中的DNA Iul和陰性對照加入到PCR反應液中，用PCR儀進行擴增；
(3)設定反應程序進行PCR擴增，反應程序均如下
940C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 70°C 30s, 70°C 5min，擴增 30 個循環(huán)。(4)反應結束后取5 Ul PCR產物在1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，紫外燈下觀察結果。結果判定擴增出長度為307bp的為梅花鹿、或馬鹿的產品，即為正品；若擴增出長度為230bp則為塔里木馬鹿、赤鹿或馴鹿的產品。本發(fā)明的積極效果在于采用PCR技術擴增梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿以及馴鹿的各線粒體DNA的特異分子片段制成試劑盒，用于檢測被檢樣品中是否含有上述各動物成分，并能檢測混合樣品；具有操作簡單、靈敏度高，速度快特點。


圖I為引物的種間特異性；
圖2為梅花鹿引物的種內通用性；
圖3為塔里木馬鹿、赤鹿、馴鹿引物的種內通用性；
圖4為馬鹿引物的種內通用性。
具體實施例方式下面結合具體實施實例，進一步闡述本發(fā)明
實施例I :試劑盒的組成與配制
I) DNA提取液的配制
(I)低鹽緩沖液(pH 7. 6)800ml蒸餾水溶解I. 21gTris堿(三羥甲基氨基甲烷)、3. 38gNa2EDTA (乙二胺四乙酸二鈉)、0. 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加濃鹽酸調pH至所需值，加蒸餾水定容至1L。(2)細胞裂解液200ml低鹽緩沖液中加入Ig SDS(十二烷基硫酸鈉)，Iml Tritonx-100 (聚乙二醇對異辛基苯基醚)。提取方法200ul 抗凝血和400ul低鹽緩沖液加入到I. 5ml離心管中，充分混勻后1000RPM離心lOmin，棄上清；加入500ul低鹽緩沖液，混勻后于室溫下1000RPM離心5min，重復一次；小心吸出上清，加入300ul細胞裂解液，混勻后于65°C水浴IOminJPA 75ul飽和NaCl，充分混勻后12000RPM離心5min，將上清轉移到新的I. 5ml離心管中，加入2倍體積無水乙醇，充分混勻后于10000RPM離心2min，棄上清，加入500ul冰浴70%乙醇，顛倒混勻數(shù)次后于10000RPM離心lmin，棄上清；65°C烘箱中干燥5min，加入IOOul ddH20后于65°C水浴溶解15min。2) PCR 反應液
(1)引物設計
根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中已公布的線粒體D-Ioop區(qū)序列采用Bioedit 7. 0. 9. O軟件進行序列比對。然后再梅花鹿(AB378372)的D-Ioop區(qū)上，利用Oligo 6. O軟件設計梅花鹿，赤鹿，馬鹿，塔里木馬鹿和馴鹿的特異性引物。其中包括一個下游引物，一個上游引物。引物對要具有種內通用性和種間特異性。序列如下
上游引物5 ’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3，
下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
(2)PCR反應液
ddH20 9. 3ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，上游引物(20 uM)
0.5ul，下游引物(20 uM) 0. 5ul，酶(5U/ul) 0.2ul。(3)陰性標準品為無囷雙蒸水。實施例2 =PCR最佳反應條件的建立。對于一個PCR反應來說，最重要的反應條件就是退火溫度和延伸溫度，因此從這兩個方面來設定PCR反應的最佳條件。最佳反應條件的設定首先應遵循種間特異性和種內通用性原則，然后在此基礎上選擇擴增效果最理想時的溫度設定為引物的最佳反應溫度。I) DNA 的提取
按照實施例I的方法從血液中提取了梅花鹿的基因組DNA。2 ) PCR反應體系的制備
將步驟I)中提取的DNA Iul加入到實施例I中的PCR反應液中，構成15ul的反應體系。3) PCR反應最佳退火溫度的設定。退火溫度的梯度范圍為54-68°C，每隔2°C設一個梯度，反應在Eppendorf AG儀器上進行擴增。程序如下
940C 5min ；94°C 30s, 54-68°C 30s, 72°C 30s, 72°C 5min，擴增 30 個循環(huán)。反應結束后取5 Ul PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)中記錄實驗結果，根據(jù)凝膠中條帶的亮度確定每對引物的最佳退火溫度。4) PCR反應最佳延伸溫度的設定。僅確定最佳退火溫度還不足以達到最佳反應條件的設定原則，因此需要對該引物的延伸溫度進行最優(yōu)化。延伸溫度的梯度范圍為65-72 °C，每隔I °C設一個梯度，反應在Eppendorf AG儀器上進行擴增,程序如下
940C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s,65-72°C 30s,65-72°C 5min，擴增 30 個循環(huán)。反應結束后取5 Ul PCR產物在1%瓊脂糖凝膠中進行電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)中記錄實驗結果，根據(jù)凝膠中條帶的亮度確定該引物對的最佳延伸溫度。5)最佳PCR反應條件的確立。
綜合分析3、4結果，確立PCR反應條件為
940C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 70°C 30s, 70°C 5min，擴增 30 個循環(huán)。實施例3 :試劑盒的特異性試驗
I)證明引物具有種間特異性。(I)為證明本發(fā)明的引物具有種間特異性，按照實施例I的方法提取了梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿、馴鹿、水鹿、坡鹿、白唇鹿、麋鹿、點鹿、豬、牛、羊、雞的血液基因組DNA,提取的DNA用于制備PCR反應體系，無菌水作為陰性對照。(2)PCR反應體系的制備取步驟(I)提取的DNA Iul加入到實施例I中的PCR反應液中，構成15ul體系。(3)按照反應程序94°C 5min ；94°C 30s，56°C 30s, 70°C 30s, 70°C 5min,擴增30個循環(huán)。進行PCR擴增。(4)結果如圖I :N :梅花鹿；C :馬鹿；Y :塔里木馬鹿；E :赤鹿；R :馴鹿；1 :水鹿；
2:坡鹿；3 :白唇鹿；4 :糜鹿；5 :點鹿；6 :豬；7 :牛；8 :羊；9 :雞；10 陰性對照；M Marker I(600，500，400，300，200，100 bp)；
在梅花鹿和馬鹿基因組DNA的反應中，引物擴增出307 bp特異性片段，而在塔里木馬鹿、赤鹿和馴鹿基因組DNA的反應中擴增出230 bp特異性片段，而水鹿、坡鹿、白唇鹿、麋鹿、點鹿、豬、牛、羊、雞的基因組DNA均為陰性。2 )證明引物的種內通用性。引物除了在種間具有特異性之外，還必須同時具有種內通用性，因此對引物的種內通用性也進行了評估。(I)按照實施例I的方法提取了 9個梅花鹿(3個左家梅花鹿、3個東豐梅花鹿、3個興凱湖梅花鹿)血液基因組DNA、3個塔里木馬鹿血液基因組DNA、3個赤鹿血液基因組DNA、3個馴鹿血液基因組DNA、15個馬鹿(3個東北馬鹿、3個青海馬鹿、3個甘肅馬鹿、3個阿爾泰馬鹿、3個天山馬鹿)血液基因組DNA。提取的DNA用于制備PCR反應體系，無菌水作為陰性對照。(2)PCR反應體系的制備取步驟(I)提取的DNA Iul加入到實施例I中的PCR反應液中，構成15ul反應體系。(3)按照反應程序94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 70°C 30s, 70°C 5min,擴增30個循環(huán)。進行PCR擴增。(4)結果如圖2 :梅花鹿(1-3 :左家梅花鹿；4_6 :東豐梅花鹿；7_9 :興凱湖梅花鹿)，10 :陰性對照；圖3 :塔里木馬鹿(1-3)，赤鹿(4-6)，馴鹿(7-9)，10 :陰性對照；圖4 :馬鹿(1-3 :東北馬鹿；4-6 :青海馬鹿；7-9 :甘肅馬鹿；10-12 :阿爾泰馬鹿；13-15 :天山馬鹿)，16 :陰性對照；M :Marker I (600，500，400，300，200，100 bp)；
左家梅花鹿、東豐梅花鹿、興凱湖梅花均擴增出307 bp特異性片段；東北馬鹿、青海馬鹿、甘肅馬鹿、阿爾泰馬鹿、天山馬鹿均擴增出307 bp特異性片段；塔里木馬鹿、赤鹿、馴鹿均擴增出230 bp特異性片段；重復性強，說明本發(fā)明的引物具有種內通用性
權利要求
1.一種快速檢測鹿源性鹿產品真?zhèn)蔚腜CR試劑盒，其特征在于包括以下引物 上游引物5 ’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3， 下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’。
2.權利要求I所述的快速檢測鹿源性鹿產品真?zhèn)蔚腜CR試劑盒，其特征在于包括DNA提取液、PCR反應液和陰性標準品 所述的DNA提取液 (1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水； (2)細胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液； 所述的PCR反應液 ddH20、10 X PCR Buffer、dNTPs、上游引物、下游引物、酶； 具體引物序列為 上游引物5 ’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3， 下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’ 陰性標準品為無菌雙蒸水。
3.權利要求I所述的快速檢測鹿源性鹿產品真?zhèn)蔚腜CR試劑盒的制備方法，包括以下步驟 1)DNA提取液 (1)低鹽緩沖液(pH7. 6-7. 8 ): 12-13份Tri s堿(三羥甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA(乙二胺四乙酸二鈉)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份為水； (2)細胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸鈉，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇對異辛基苯基醚)，1000份低鹽緩沖液； 2)PCR反應液 (1)引物設計 引物設計在梅花鹿，赤鹿，馬鹿，塔里木馬鹿和馴鹿線粒體D-Ioop區(qū)設計引物，包括一個上游引物和一個下游引物；序列如下 上游引物5’ - CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’ 下游引物5’ - CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’ (2)PCR反應液ddH20 9. 3ul, 10 X PCR Buffer I. 5ul, dNTPs (100 uM) 2. Oul，上游引物(20 uM)。0.5ul，下游引物(20 uM) 0. 5ul，酶(5U/ul) 0. 2ul ； (3)陰性標準品為無菌雙蒸水。
全文摘要
本發(fā)明公開一種快速檢測鹿源性鹿產品真?zhèn)蔚腜CR試劑盒，用于快速準確識別鹿產品，采用PCR技術擴增梅花鹿、馬鹿、塔里木馬鹿、赤鹿以及馴鹿的各線粒體DNA的特異分子片段制成試劑盒，用于檢測被檢樣品中是否含有上述各動物成分，并能檢測混合樣品；具有操作簡單、靈敏度高，速度快特點。
文檔編號C12Q1/68GK102618653SQ20121010856
公開日2012年8月1日 申請日期2012年4月15日 優(yōu)先權日2012年4月15日
發(fā)明者吳瓊, 楊福合, 査代明, 蘇偉林, 榮敏, 邢秀梅 申請人:邢秀梅