專利名稱：一種鑒別粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf1a的分子標記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種鑒別粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因/PZVa的分子標記方法，屬于生物技術(shù)工程領(lǐng)域，專用于含沿Va基因BT型粳稻恢復(fù)系種質(zhì)資源鑒定以及品種選育。背景技術(shù)：
近年來，隨著人們生活水平的提高，我國城鄉(xiāng)居民對稻米消費呈現(xiàn)由秈米向粳米轉(zhuǎn)變的趨勢(張峭等，農(nóng)業(yè)展望，2007，I 9-14 ;吳樂等，農(nóng)業(yè)技術(shù)經(jīng)濟，2011，5 :87_96)。粳米市場看好，也為粳稻的生產(chǎn)拓展了更為廣闊的空間。目前，我國粳稻種植面積在830萬hm2左右，其中以常規(guī)粳稻品種為主，而具有較大增產(chǎn)潛力的雜交粳稻種植面積只有33萬hm2， 所占比例不足4% (鄧華風(fēng)等，雜交水稻，2006，21 (1):1-6)。因此，加強雜交粳稻(特別是三系雜交粳稻)品種的選育，以增加雜交粳稻的競爭優(yōu)勢，實現(xiàn)雜交粳稻的跨越式發(fā)展，對保障我國糧食安全，促進農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收具有十分重要的意義。優(yōu)異親本的培育是選配三系雜交粳稻優(yōu)勢組合的基礎(chǔ)。目前我國雜交粳稻應(yīng)用的雄性不育細胞質(zhì)主要是BT型(來自印度春秈品種，Chinsurah Boro II),其次是滇I型 (來自云南高海拔秈稻)(袁隆平等，雜交水稻育種栽培學(xué)，1988，83-84 ;李錚友，滇型雜交水稻育種，2000，1-15)。這兩種不育細胞質(zhì)均屬于配子體不育類型，具有相似的恢保關(guān)系，其育性恢復(fù)受I對核基因控制(賀和初，云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1988，3 (1):54-68)。在育種中， 雜交粳稻的不育系大多是由在生產(chǎn)上推廣的開花、異交習(xí)性較好的常規(guī)粳稻通過回交轉(zhuǎn)育而成，它本身就具有較好的農(nóng)藝性狀；而在恢復(fù)系方面，由于粳稻中一般不存在相應(yīng)的恢復(fù)源，其恢復(fù)基因是通過人工雜交的方法從秈稻中導(dǎo)入的，在引入恢復(fù)基因的同時不可避免的也滲入了秈稻中一些不利的遺傳成分(王才林等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1989，22 (5):8-13)。因此，選育優(yōu)良粳稻恢復(fù)系的關(guān)鍵就在于對恢復(fù)基因進行快速、準確的鑒定和選擇。早期BT型粳稻恢復(fù)基因的鑒定主要依靠測交，并對后代植株的結(jié)實情況進行考察，這一方法不僅需要兩個生長季節(jié)，同時還要對大量單株進行雜交，其過程相當煩瑣。后來為簡化育種程序，就借助于不育細胞質(zhì)來選育同質(zhì)恢，但由于細胞質(zhì)遺傳背景相同必定導(dǎo)致組合雜種優(yōu)勢的降低(李建紅等，作物學(xué)報，2005，31 (7) :851-857)。而利用與恢復(fù)基因緊密連鎖或共分離的分子標記則可以克服上述缺點，有效的減少恢復(fù)系選育的時間和強度，大大提高育種工作的預(yù)見性。為提高BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf-I的選擇效率，已有研究者利用其連鎖的分子標記嘗試輔助育種(Akagi et al. , Genome, 1996, 39(6): 1205-1209 ；Ichikawa et al. , Molecular Breeding, 1997, 3(3): 195-202 ；Komori et al. , Euphytica, 2003, 129(2): 241-247 ；Akagi et al. , Theor. AppL Genet. , 2004, 108(8): 1449-1457 ;Tan et al.，Plant breeding, 2004，123(4) : 338-341 ;程寶山等，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，34 (1):1-7)。這確實在一定程度上提高了選擇的可靠性。然而，由于這些標記大都只是與目的基因連鎖，因此存在許多缺陷。一方面，這些標記都是通過定位/PZW 基因時獲得的，在實際育種群體中往往缺乏多態(tài)性，另一方面，由于是連鎖標記，不能保證對Rf-I基因的篩選達到100%的準確性。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，人們開始對水稻育性恢復(fù)的遺傳機制有了新的認識。WangeiW. {The Plant cell, 2006，18(3) : 676-687)利用圖位克隆的方法解析了 BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf-I的育性恢復(fù)機理，該基因由兩個相關(guān)的育性恢復(fù)基因 Rfla和/ / 組成，編碼定向線粒體的PPR蛋白，其中TPZVa編碼的蛋白RFlA以內(nèi)切方式切驚\B-atp6/orf79 mRNA來阻止0RF79蛋白的產(chǎn)生使育性恢復(fù)，而Rflb編碼的蛋白RFlB則通過降解mRNA使育性恢復(fù)，在RFlA和RFlB同時存在時，RFlA具有優(yōu)先作用。與可以恢復(fù)胞質(zhì)雄性不育的近等基因系OP/W/P/-2)相比，不能恢復(fù)胞質(zhì)雄性不育的近等基因系(r/-7r/-7)在TPfVa位點上存在I bp和574 bp兩處缺失。因此，若在BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因克隆的基礎(chǔ)上，能進一步設(shè)計得到與目標基因共分離的PCR分子標記來快捷、準確地鑒定粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的不同基因型將有利于優(yōu)良粳稻恢復(fù)系的選育，從而提升三系雜交粳稻育種的技術(shù)水平。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明針對粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系選育過程中恢復(fù)基因鑒定較為煩瑣的技術(shù)難題，根據(jù)恢復(fù)系和不育系(同核異質(zhì)保持系)在/ / 位點存在的574 bp的堿基差異，設(shè)計、合成與目的基因共分離的功能標記，并通過簡單的檢測方法，快速鑒定含 Rfla基因的粳稻恢復(fù)系種質(zhì)資源，同時還能進一步應(yīng)用于分子標記輔助育種。技術(shù)方案
I、一種鑒定粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因/PZVa的分子標記方法，其特征在于 用Rfla恢復(fù)基因特異性引物InDel-TP/Va 正向引物 InDel-TPfVa-F 序列為 5’-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’
反向引物 InDel-TPfVa-R 序列為 5’- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3’
利用上述引物快速區(qū)分粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因TP/Va不同基因型的PCR分子標記方法為
(I)水稻植株基因組DNA的提取(SDS法)，參照Del laporta S L, et al.，Plant Mol B iol Rep, 1983， I (I): 19221。(2)將所述的兩條分子標記引物InDel-TPfVa-F和InDel-TPfVa-R加入PCR反應(yīng)體系，并對水稻種質(zhì)資源或育種群體植株的DNA進行擴增；20 μ L PCR反應(yīng)體系包括
10ng/yL 的 DNA 2. O μ L,4 pmol/ μ L 的引物 2. O μ L，其中引物 InDel-/ /7a-F 和 InDel-TPfVa-R 各 I. O μ L，10XPCR 含有 25 mmol/L MgCl2 的 Buffer 2. O μ L,2. 5 mmol/ L 的 dNTP O. 4 μ L，5 U/ μ L 的 7 O. 5 μ L 和 ddH20 13. I μ L ；
PCR反應(yīng)程序包括95 °C預(yù)變性5 min ;然后95°C變性30 s、55°C復(fù)性30 s、72°C延伸
Imin，循環(huán)35次；然后72°C延伸7 min, 10°C冷卻10 min后，將擴增產(chǎn)物加上樣緩沖液終止反應(yīng)。(3)反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)量比濃度為I. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠染色并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，記載。如果有1145 bp的特征條帶即為含TPZVa恢復(fù)基因的純合體；如果有571 bp的特征條帶即為不含恢復(fù)基因的純合體；如果同時存在1，145 bp和571 bp的兩條特征條帶，則為/P/Va恢復(fù)基因的雜合體。有益效果本發(fā)明提供的一種鑒別粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因/PZVa的分子標記方法，具有以下優(yōu)點
(O本發(fā)明提供的分子標記與現(xiàn)有的粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因的分子標記相比，它是根據(jù)基因的插入/缺失位點設(shè)計的采用PCR擴增的功能性標記，其基因型能直接反映植株的表型，不僅不存在由于遺傳交換而造成的錯誤鑒定，而且在操作上高效、快捷。；
(2)本發(fā)明提供的分子標記方法能實現(xiàn)對粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因資源的快速鑒定，能從大量粳稻中準確篩選出含恢復(fù)基因/ / 的品種，這些具有育性恢復(fù)能力的粳稻品種在育種中可以作為優(yōu)異親本來選育新的恢復(fù)系，有效的拓寬現(xiàn)有恢復(fù)系遺傳基礎(chǔ)，增強雜交粳稻的組合優(yōu)勢。(3)本發(fā)明提供的分子標記方法能有效用于粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系的輔助育種。早期恢復(fù)系成型后，還必須對其恢復(fù)基因進行測交鑒定，這一方法不僅需要兩個生長季節(jié)，同時還要對大量單株進行雜交，其過程相當煩瑣。雖然后來為簡化育種程序，借助不育細胞質(zhì)來選育同質(zhì)恢，但由于細胞質(zhì)遺傳背景相同必定導(dǎo)致組合雜種優(yōu)勢的降低。 而利用與恢復(fù)基因共分離的分子標記則可以克服上述缺點，在苗期就可進行基因型篩選， 有效降低恢復(fù)系選育的時間和強度，大大提高育種工作的預(yù)見性。四

圖I檢測粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rfla的標記設(shè)計策略 (陰影部分表示不含恢復(fù)基因Rfla水稻存在的I bp和574 bp兩處堿基缺失；黑框部分表示引物所在位置)
圖2 InDel-TPZia對不同地區(qū)來源的常規(guī)秈稻品種、恢復(fù)系以及保持系的分子檢測 (M :DNA分子量標準，100-2，000 bp ;1_11 :常規(guī)秈稻品種南京11、南充一枝蠟、中早39、 黃華占、滇瑞408、貴州麻谷、Tetep、Basmati 370、IR24、密陽23、Dular ; 12-19 :秈稻恢復(fù)系鎮(zhèn)恢084、93-11、蜀恢527、輻恢838、廣恢998、航I號、華恢451、中恢8006 ；20~24 :川香 29B、II -32B、武香 2B、岡 46B、中蓮 1B)
圖3 InDel-TPZia對不同地區(qū)來源的常規(guī)粳稻品種的分子檢測 (M =DNA分子量標準，100-2，000 bp ；1~24 :南粳44、南粳46、寶農(nóng)34、嘉33、嘉48、圣稻 13號、圣稻14號、豫粳6號、鄭稻18號、津稻263、津川I號、鹽豐47、遼粳9號、吉粳88、長白9號、龍粳21號、松粳9號、伊粳12號、新稻32號、楚粳32號、合系41號、關(guān)東194、越光、愛知106)
圖4 InDel-TPZia對不同地區(qū)來源的粳稻恢復(fù)系、不育系以及雜交粳稻品種的分子檢
測
(M :DNA分子量標準，100-2, 000 bp ;1_14 :粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系寧恢8號、 C-25、C-53、R9511、湘晴、R161、申恢 254、R192、皖恢 9 號、HP121、LR27、C418、輪回 422、R187 ； 15-20 :粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育系95122A、徐稻3號A、武運粳7號A、863A、泰粳985A、連粳6號A ；21-24 :雜交粳稻組合9優(yōu)418、常優(yōu)I號、86優(yōu)8號、95優(yōu)161)
圖5 InDel- Rfla對863A/寧恢8號F2群體不同單株的分子檢測 (M =DNA 分子量標準，100-2，000 bp ；1 :寧恢 8 號；2 863A ；3 863A/ 寧恢 8 號 F1 雜種個體；4-24 :部分F2分離單株)
五具體實施方式
為充分公開本發(fā)明一種鑒別粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因/PZVa的分子標記方法，以下結(jié)合方法驗證和實施實例加以說明。其具體實施步驟如下
(一)試驗材料
常規(guī)秈稻品種南京11 (江蘇)、南充一枝臘(四川)、中早39 (浙江)、黃華占(廣東)、滇瑞408 (云南)、貴州麻谷(貴州)、Tetep (越南)、Basmati370 (泰國)、IR24 (菲律賓)、密陽 23 (韓國)、Dular (印度)。秈稻恢復(fù)系鎮(zhèn)恢084 (江蘇)、93-11 (江蘇)、蜀恢527 (四川)、輻恢838 (四川)、 廣恢998 (廣東)、航I號(福建)、華恢451 (湖南)、中恢8006 (浙江)。秈稻保持系川香29B (四川，野敗型細胞質(zhì)雄性不育保持系)、II -32B (浙江，印水型細胞質(zhì)雄性不育保持系)、武香2B (湖北，馬協(xié)型細胞質(zhì)雄性不育保持系)、R 46B (四川， 岡型細胞質(zhì)雄性不育保持系)、中蓮IB (江蘇，紅蓮型細胞質(zhì)雄性不育保持系)。常規(guī)粳稻品種南粳44 (江蘇)、南粳46 (江蘇)、寶農(nóng)34 (上海)、嘉33 (浙江)、嘉 48 (浙江)、圣稻13號(山東)、圣稻14號(山東)、豫粳6號(河南)、鄭稻18號(河南)、津稻 263 (天津)、津川I號(天津)、鹽豐47 (遼寧)、遼粳9號(遼寧)、吉粳88 (吉林)、長白9號 (吉林)、龍粳21號(黑龍江)、松粳9號(黑龍江)、伊粳12號(新疆)、新稻32號(新疆)、楚粳 32號(云南)、合系41號(云南)、關(guān)東194 (日本)、越光(日本)、愛知106 (日本)。粳稻恢復(fù)系寧恢8號(江蘇)、CR_25 (江蘇)、C_53 (江蘇)、R9511 (江蘇)、湘晴(浙江)、R161 (上海)、申恢254 (上海)、R192 (上海)、皖恢9號(安徽)、HP121 (安徽)、LR27 (天津)、C418 (遼寧)、輪回422 (湖南)、R187 (湖北)。BT型粳稻不育系95122A、徐稻3號A、武運粳7號A、863A、泰粳985A、連粳6號A， 以上不育系均由江蘇育成品種(品系)轉(zhuǎn)育而成。BT型雜交粳稻組合9優(yōu)418(9201A/C418，江蘇)、常優(yōu)I號(武運粳7號A/R254， 江蘇)、86優(yōu)8號(863A/寧恢8號，江蘇)、95優(yōu)161 (95122A/晚161，江蘇)
BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因F2分離群體86優(yōu)8號(863A/寧恢8號)經(jīng)自交獲得的200個F2單株。以上材料均為公知公用材料，江蘇省農(nóng)業(yè)種質(zhì)資源中期庫可免費提供。具體參考文獻為林世成等，中國水稻品種及其系譜，上海上海科學(xué)技術(shù)出版社，1991 :318 ;李欣等，水稻半矮桿基因的染色體定位研究，揚州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版)，2002， 23 (1):40-44 ;毛永根等，常規(guī)早秈中早39在江山市的表現(xiàn)及高產(chǎn)栽培技術(shù)，現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010，20 75-77 ;周少川等，優(yōu)質(zhì)稻核心種質(zhì)黃華占及其衍生系統(tǒng)理想模式研究，中國水稻科學(xué)，2009，29 (3) =153-159 ;萬建民等，中國水稻遺傳育種與品種系譜，北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2009，272 ;吳俊生等，廣親和品種零貴40的評價與利用價值，中國種業(yè)，2000，
528 ;甘代耀等，抗源矮Tetep的選育和抗瘟鑒定，福建農(nóng)業(yè)科技，1992，6 4 ；Bughio H., R. , Improvement of grain yield in rice variety Basmati-370 {Oryza sativa L.), through mutagenesis, Pak. J. Bot., 2007, 39(7): 2463-2466 ;Imbe T. et al. , A new gene for blast resistance in rice cultivar, IR24, A new gene for blast resistance in rice cultivar, IR24, Rice Genetics Newsletter, 1997, 60 ；Masao et al. , Use of a Korean rice cultivar Milyang23 for improving Japanese rice, Breeding Science, 1994，44，219-222 ;嚴長杰等，秋稻品種Dular廣親和基因的RFLP分析，遺傳學(xué)報，2000，27 (5) =409-417 ;盛生蘭等，秈稻恢復(fù)系鎮(zhèn)恢084的選育及利用，雜交水稻，2002，17 (2) :6-7 ;徐卯林等，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)抗病中秈新品種揚稻6號的選育及利用，中國稻米，2001，I :24-26 ;王玉平等，高配合力優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系蜀恢527的選育與利用，雜交水稻，2004，19 (4) 12-14 ;鄧達勝等，水稻恢復(fù)系輻恢838及其衍生系的選育和應(yīng)用，核農(nóng)學(xué)報，2009，23 (2) =175-179 ;李曙光等，廣譜性恢復(fù)系廣恢998的特征特性及制種技術(shù)，廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，2 20-21 ;謝華安等，超級雜交稻恢復(fù)系“航I號”的選育與應(yīng)用，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2004,37 (11) =1688-1692 ;楊遠柱等，理想株型優(yōu)質(zhì)水稻恢復(fù)系華恢451的選育及應(yīng)用，雜交水稻，2009，24 (5) 7-11 ;萬建民等，中國水稻遺傳育種與品種系譜，北京中國農(nóng)業(yè)出版社,2009，500-501 ;秦代錦等，香型秈稻不育系川香29A高產(chǎn)繁殖技術(shù)，雜交水稻， 2007，22 (I) 27-29 ;吳傳根等，新質(zhì)源不育系II 一 32A的開發(fā)利用研究，雜交水稻，1992，
324-25 ；張萬春等，雜交稻新組合武香988在漢中的種植表現(xiàn)及高產(chǎn)栽培技術(shù)，2010，56 (I) =251-252 ;李仕貴等，水稻優(yōu)良不育系R 46A的選育及應(yīng)用研究，四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報， 1995,4 =432-436 ;鐘亮等，紅蓮型雜交稻中蓮優(yōu)950特征特性及栽培技術(shù)，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2011，3 :120 ;王才林等，抗條紋葉枯病水稻新品種南粳44的特征特性與栽培技術(shù)，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，2 43-44 ;王才林等，抗條紋葉枯病優(yōu)良食味晚粳稻新品種南粳46的特征特性與栽培技術(shù)，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，2 :91-92 ;朱一峰等，優(yōu)質(zhì)粳稻“寶農(nóng)34”特征特性及栽培要點，上海農(nóng)業(yè)科技，2007，4 24 ;郁志華等，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻新品種嘉33，中國種業(yè)，2007，
665 ;萬建民等，中國水稻遺傳育種與品種系譜，北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2009，417 ;宮德英等，水稻新品種圣稻13的選育及配套栽培技術(shù)，山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，5 :113-114 ;陳峰等，水稻新品種圣稻14的選育及配套栽培技術(shù)，2007，6 =109-110 ;王書玉，超高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻新品種豫粳6號，作物品種資源，1999，3 52 ;尹海慶等，粳稻新品種鄭稻18號的選育和栽培要點，中國稻米，2007,，I :20-24 ； http://www. ricedata. cn/variety/varis/611531. htm;丁得亮等，優(yōu)良食味水稻津川I號的優(yōu)質(zhì)栽培技術(shù)，中國種業(yè)，2009，11 :69 ;任永泉等， 鹽豐47高產(chǎn)優(yōu)化栽培技術(shù)研究，北方水稻，2008，38 (3):70-71 ;劉憲平等，水稻新品種遼粳9號特征特性及栽培要點，墾殖與稻作，2004，I 12-13 ;張俊國等，超級稻吉粳88的優(yōu)異特性及推廣應(yīng)用，中國稻米，2008，3 :42-44;萬建民等，中國水稻遺傳育種與品種系譜，北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2009，329-330 ;褚國江等，超級稻龍粳21特征特性及高產(chǎn)栽培技術(shù)， 北方水稻，2009，39，4 :56-57 ；2.陶永慶等，松粳9號特征特性及高產(chǎn)栽培技術(shù)評論推薦， 中國稻米，2006，6 25-26 ;吐爾干江等，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)水稻新品種一伊粳12號，新疆農(nóng)墾科技， 2006,1 :40-41 ;吐爾干江等，優(yōu)質(zhì)香稻新品種新稻32號特征特性及栽培技術(shù)要點，北方水稻,2011,41 (3):59-60 ;劉吉新等,云南廣適性高產(chǎn)耐寒抗病粳稻新品種合系41號的選育， 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002,15 (4):5-9 ；http: / / ineweb. narcc. af frc. go. jp/ ;孫菊英等，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)雜交粳稻新組合常優(yōu)4號的選育與應(yīng)用，雜交水稻，2010，25 (5) 17-19 ;華建峰等，雜交粳稻常優(yōu)2號高純度高產(chǎn)制種技術(shù)，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，3 :45-46 ;王建平等，粳稻恢復(fù)系湘晴的特征特性及應(yīng)用效果，江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，3 :50-51 ;萬建民等，中國水稻遺傳育種與品種系譜，北京中國農(nóng)業(yè)出版社，2009，570-574 ;張慧廉等，利用輪回422雜交選育廣親和恢復(fù)系及其測配表現(xiàn)，雜交水稻，1991，(5) 29-33 ;王長義等，兩系雜交粳稻恢復(fù)系R187 的選育與利用，湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，1997，3 :6-9 ;劉超等，雜交中粳9優(yōu)418主要特性及栽培策略，雜交水稻，2002，17 (2) 35-37 ;何建華等，雜交粳稻常優(yōu)I號高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)制種技術(shù)，中國稻米，2003，(2):24-25 ;谷福林等，優(yōu)質(zhì)雜交粳稻新組合86優(yōu)8號，雜交水稻，2001，16 (2) 59-60 ;王才林等，優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)雜交粳稻新組合95優(yōu)161的選育及其利用，雜交水稻，SI 23
(二)分子標記開發(fā)
(O 粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rfla變異位點的核苷酸序列分析根據(jù)Wangce77，2006, 18(3) : 676-687)等的研究結(jié)果，利用粳稻恢復(fù)
基因位點Rfla的基因組信息，設(shè)計引物對該位點序列進行PCR擴增并直接測序，獲得/PZVa 位點的基因組序列。通過序列分析證實，已測序的粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系和不育系(同核異質(zhì)保持系)在/ / 位點都存在的574 bp的堿基差異。(2)引物設(shè)計
利用Rfla基因的核苷酸序列在水稻基因組網(wǎng)站(Gene Bank, www. ncbi. nlm. nih. gov/)下載其位于水稻第10染色體長臂所在PAC克隆(Pl-derived artificial chromosome, PAC)的核酸序列(0SJNBa0017E08, AC068923),并對相關(guān)序列進行分析；然后， 利用 Primer Premier 5. 0(http://www. premierbiosoft. com)在 574bp 喊基插入缺失區(qū)域的附近，設(shè)計相應(yīng)的插入/缺失標記，并將合成的標記引物命名為InDel-TP/Va。其正向引物序列為 5’ -CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’，反向引物序列為 5’ - TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3’， 退火溫度為55°C (圖I)。(三)分子標記驗證
(I)水稻植株基因組DNA的提取
水稻植株基因組DNA的提取參照SDS法(Dellaporta S L, et al. , Plant Mol B iol Rep, 1983，I (I): 19221.)。具體步驟為取水稻苗期葉片，在_20°C預(yù)冷的研缽中用液氮研磨并裝入I. 5 mL離心管；加入600 uL提取液(20%SDS，IM Tris-HCl, 0. 5M EDTA, 5M NaCl，65°C預(yù)熱)，搖勻，65°C溫浴30 min，中間振蕩Γ4次；加入1/4體積5M KAC,搖勻后置冰上30 min ;加入氯仿-異戊醇(24:1) 300 400 uL，在搖床上充分振蕩，120 rpm, 30 min ； 8，000^10, OOOrpm離心15分鐘，液面分層，下層顏色較深，上層微帶黃綠色，取上清(400 uL 左右)至另一離心管；加入等體積氯仿-異戍醇(24:1),搖床上充分振蕩，8(T90 rpm, 30 min ;8，000 rpm離心15分鐘，轉(zhuǎn)移上清(400 uL左右)至新的離心管；加入2倍體積-20°C 預(yù)冷的無水乙醇,輕輕搖勻直到有絮狀物產(chǎn)生,12，000 rpm離心6min ;棄無水乙醇,加入 4°C70%乙醇，放置10 min，棄上清，超凈工作臺上風(fēng)干Ih ;加入100 200 uL TE，_20°C保存。( 2 )分子標記的擴增和電泳檢測
利用粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因InDel-TP/Va標記，其引物序列為
正向引物(InDel-WfVa-F)序列為 5’ -CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’
反向引物(InDel-WfVa-R)序列為 5’- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3’
對不同水稻品種(品系或組合)微Rfla基因型分離群體進行PCR擴增和電泳檢測。(3)20 UL PCR反應(yīng)體系包括10 ng/μ L 的 DNA 2. O n LA pmol/ μ L 的引物
2.O μ L，其中引物 InDel-WfVa-F 和 InDel-WfVa-R 各 I. O μ L, 10XPCR Buffer (包括 25 mmol/L 的 MgCl2>2. O μ L，2. 5 mmol/L 的 dNTP 0. 4 μ L，5 U/ μ L 的 0. 5 μ L 和 ddH20 13. I μ L ；
PCR反應(yīng)程序包括PCR反應(yīng)程序包括95 °C預(yù)變性5 min ;然后95°C變性30s、55°C復(fù)性30s、72°C延伸lmin，循環(huán)35次；然后72°C延伸7min, 10°C冷卻IOmin后，將擴增產(chǎn)物加上樣緩沖液終止反應(yīng)。(4)反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)量比濃度為I. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠染色并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，記載。如果有1145 bp的特征條帶即為含TPZVa恢復(fù)基因的純合體；如果有571 bp的特征條帶即為不含恢復(fù)基因的純合體；如果同時存在1145 bp和571 bp的兩條特征條帶，則為/P/Va恢復(fù)基因的雜合體。(5)結(jié)果分析
I) InDel- Rfla標記對常規(guī)秈稻品種、秈稻恢復(fù)系以及保持系位點的基因型
檢測
利用分子標記InDel-TP/Va對來自不同地區(qū)的24份秈稻材料進行PCR擴增和電泳檢測。結(jié)果表明11個常規(guī)秈稻品種南京11號、南充一枝蠟、中早39、黃華占、滇瑞408、貴州麻谷、Tet印、Basmati 370、IR24、密陽23、Dular，8個秈稻恢復(fù)系鎮(zhèn)恢084、93_11、蜀恢527、 輻恢838、廣恢998、航I號、華恢451、中恢8006以及5個秈稻雄性不育保持系川香29B、
II-32B、武香2B、岡46B、中蓮IB均能穩(wěn)定擴增出I條長度約I, 145 bp的條帶(圖2)。這表明以上材料在Rfla位點不存在574 bp的缺失，其基因型為/Pf/a/P/Va，它們對粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育系都具有恢復(fù)作用。2) InDel- Rfla標記對常規(guī)粳稻品種Rfla位點的基因型檢測
利用分子標記InDel-TP/Va對來自不同地區(qū)的24份粳稻品種進行PCR擴增和電泳檢測。結(jié)果顯示22個常規(guī)粳稻品種南粳44、南粳46、寶農(nóng)34、嘉33、嘉48、圣稻13號、圣稻 14號、豫粳6號、鄭稻18號、津稻263、津川I號、鹽豐47、遼粳9號、吉粳88、長白9號、龍粳21號、松粳9號、新稻32號、楚粳32號、合系41號、關(guān)東194及越光均能穩(wěn)定擴增出I 條長度約571 bp的條帶，這些品種在位點存在574 bp的缺失，其基因型為r/Var/Va， 因此這些材料對BT型細胞質(zhì)雄性不育系具有保持不育的作用；而其它2個水稻品種愛知 106和伊粳12號，由于能擴增出TP/Va/P/Va基因型特有的1，145 bp的條帶，它們對BT型細胞質(zhì)雄性不育系具有恢復(fù)作用，這些具有育性恢復(fù)能力的粳稻品種在育種中可以作為優(yōu)異親本來進一步選育新的恢復(fù)系(圖3)。因此，通過InDel-TP/Va標記的PCR擴增能準確鑒定 BT型粳稻恢復(fù)系種質(zhì)資源。3)InDel- 標記對粳稻恢復(fù)系、不育系以及雜交粳稻品種位點的基因型檢測
利用分子標記InDel-TPfVa對來自不同地區(qū)的14份粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)系、 6份雄性不育系以及4份雜交粳稻品種進行PCR擴增和電泳檢測。結(jié)果表明，恢復(fù)系寧恢8 號、C-25、C-53、R9511、湘晴、R161、申恢 254、R192、皖恢 9 號、HP121、LR27、C418、輪回 422 和 R187能擴增I條長度約I, 145 bp的條帶；不育系95122A、徐稻3號A、武運粳7號A、863A、 泰粳985A和連粳6號A能擴增出I條長度約571 bp的條帶；而雜交粳稻品種9優(yōu)418、常優(yōu)I號、86優(yōu)8號及95優(yōu)161則能同時擴增出長度約1，145 bp和571 bp的兩條帶(圖4)。 因此，在Rfla位點，粳稻恢復(fù)系的基因型為/P/Va/P/Va，不育系的基因型為r/Var/Va，而雜交粳稻組合的基因型為RHarfla。4)InDel- 標記對863A/寧恢8號F2分離群體不同單株沿Va位點的基因型檢測
為進一步驗證InDel-TPfVa對不同基因型的檢測效果，在分蘗盛期對863A/寧恢8號F2分離群體的200個單株DNA進行PCR擴增，其電泳產(chǎn)物呈現(xiàn)3種類型的條帶，即恢復(fù)系寧恢 8 號 UmaRfla，1145 bp)、粳稻不育系 863A (了/7<^/7<3，57訃口)以及雜種 F1 (.Rflarfla, 1145 bp和571 bp)的帶型(圖5)。經(jīng)統(tǒng)計，在F2群體中共檢測到TP/Va/P/Va基因型單株 41個，Rflarfla基因型單株111個，rflarfla基因型單株48個，三種基因型符合1:2:1 (X 2=2. 91，O. 25 <P<0. 50)。因此，通過InDel-TPfVa標記的PCR擴增能準確區(qū)分沿Va位點的不同基因型，達到輔助育種的目的。
權(quán)利要求
1.一種鑒定粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因TPZVa的分子標記方法，其特征在于 用Rfla恢復(fù)基因特異性引物InDel-TP/Va正向引物 InDel-TPfVa-F 序列為 5’-CTGATGATCGAGGAGGAGGTA-3’反向引物 InDel-TPfVa-R 序列為 5’- TAACGCGTCTTCCATCCTACT-3’擴增水稻植株的基因組DNA，如果有1，145 bp的特征條帶即為含TPZVa恢復(fù)基因的純合體；如果有571 bp的特征條帶即為不含TPZVa恢復(fù)基因的純合體；如果同時存在1，145 bp 和571 bp的兩條特征條帶，則為恢復(fù)基因的雜合體。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于水稻植株基因組DNA的提取；將權(quán)利要求I所述的兩條分子標記引物InDel-TPfVa-F和InDel-TPfVa-R加入PCR反應(yīng)體系，并對水稻種質(zhì)資源或育種群體植株的DNA進行擴增；20 μ L PCR反應(yīng)體系包括 10 ng/yL 的 DNA 2. O μ L,4 pmol/ μ L 的引物 2. O μ L，其中引物 InDel-/ /7a-F 和 InDel-TPfVa-R 各 I. O μ L, 10XPCR 含有 25 mmol/L MgCl2 的 Buffer 2. O μ L,2. 5 mmol/ L 的 dNTP O. 4 μ L，5 U/ μ L 的 7 O. 5 μ L 和 ddH20 13. I μ L ；PCR反應(yīng)程序包括95 °C預(yù)變性5 min ;然后95°C變性30 s、55°C復(fù)性30 s、72°C延伸 I min，循環(huán)35次；然后72°C延伸7 min, 10°C冷卻10 min后，將擴增產(chǎn)物加上樣緩沖液終止反應(yīng)；反應(yīng)產(chǎn)物在質(zhì)量比濃度為I. 0%的瓊脂糖凝膠上電泳，經(jīng)溴化乙錠染色并于凝膠成像系統(tǒng)下觀察，記載。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf1a的分子標記方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。設(shè)計合成一對正、反引物，對不同水稻植株DNA進行擴增，如果有1,145bp的特征條帶即為含Rf1a恢復(fù)基因的純合體；如果有571bp的特征條帶即為不含Rf1a恢復(fù)基因的純合體；如果同時存在1,145bp和571bp的兩條特征條帶，則為Rf1a恢復(fù)基因的雜合體。本發(fā)明不僅能快速、準確地鑒定水稻種質(zhì)資源或其育種群體中是否含有粳稻BT型細胞質(zhì)雄性不育恢復(fù)基因Rf1a，同時能進一步區(qū)分Rf1a基因的純合體和雜合體，預(yù)測后代基因型，大大提高對BT型粳稻恢復(fù)系的選擇效率，加速育種進程。
文檔編號C12Q1/68GK102605074SQ20121007854
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月23日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月23日
發(fā)明者于新, 周麗慧, 姚姝, 張亞東, 朱鎮(zhèn), 王才林, 趙凌, 趙慶勇, 陳濤, 駱名瑞 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院