專(zhuān)利名稱(chēng)：一種雙重TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)黃病毒和甲病毒的非診斷性方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雙重TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)蚊蟲(chóng)標(biāo)本中黃病毒和甲病毒的非診斷性方法。
背景技術(shù)：
蟲(chóng)媒病毒(arbovirus)是指通過(guò)吸血的節(jié)肢動(dòng)物盯咬敏感的脊椎動(dòng)物而引起的自然疫源性疾病及人獸共患病的一組病毒。主要集中在黃病毒科黃病毒屬、披膜病毒科甲病毒屬、呼腸孤病毒科和布尼亞病毒科，以黃病毒屬病毒對(duì)人類(lèi)的危害最大。人、畜被攜帶病毒的節(jié)肢動(dòng)物叮咬而感染，不但造成人類(lèi)疾病和死亡，更會(huì)造成大批牲畜發(fā)病甚至死亡， 造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，成為各國(guó)的公共衛(wèi)生問(wèn)題。目前，蟲(chóng)媒病毒鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)是病毒分離，但因其操作繁瑣、技術(shù)難度大、耗時(shí)長(zhǎng)、 實(shí)驗(yàn)條件要求高、并存在嚴(yán)重的生物安全問(wèn)題，在實(shí)際工作中難以推廣應(yīng)用。近年來(lái)應(yīng)用廣泛的常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增(retro-transcript-PCR，RT-PCR)及實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time PCR)在蟲(chóng)媒病毒的檢測(cè)方面發(fā)揮了重要作用。但是，目前使用的 RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光PCR大多是針對(duì)某一種蟲(chóng)媒病毒的檢測(cè)。本發(fā)明利用TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù),建立一種快速、敏感的檢測(cè)和篩選黃病毒屬和甲病毒屬病毒的方法，應(yīng)用于蟲(chóng)媒病毒的監(jiān)測(cè)檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于提供一種高通量快速檢測(cè)和篩選黃病毒、甲病毒的雙重TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)的非診斷性方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明一種雙重TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)黃病毒及甲病毒的非診斷性方法，該非診斷性方法包括設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物和探針對(duì)待檢樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，兩對(duì)引物和探針序列分別為針對(duì)黃病毒序列中NS5基因設(shè)計(jì)的互補(bǔ)序列
Fla-F:5，- CAACATGATGGGRAARAG -3，F(xiàn)la-R:5，- CHAGRGCTTCRAACTCHAG-3’Fla-P:5，- FAM-CTCCVAGCCACATGTACCATAT-BHQI -3 ’針對(duì)甲病毒序列中NSl基因設(shè)計(jì)的互補(bǔ)序列
權(quán)利要求
1.一種雙重TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)黃病毒和甲病毒的非診斷性方法，其特征在于，該非診斷性方法包括設(shè)計(jì)了兩對(duì)引物和探針對(duì)待檢樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，兩對(duì)引物和探針序列分別為 針對(duì)黃病毒序列中NS5基因設(shè)計(jì)的互補(bǔ)序列
2.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述NS5基因的互補(bǔ)序列中探針連接的熒光基團(tuán)為=FAM-BHQl，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端連接淬滅基團(tuán)。
3.如權(quán)利要求2所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該淬滅基團(tuán)為BHQl非熒光淬滅基團(tuán)。
4.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述NSl基因的互補(bǔ)序列中探針連接的熒光基團(tuán)為T(mén)XR-BHQ2，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是TXR，3’端連接淬滅基團(tuán)。
5.如權(quán)利要求4所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該淬滅基團(tuán)為BHQ2非熒光淬滅基團(tuán)。
6.如權(quán)利要求I所述的非診斷性方法，其特征在于，所述該非診斷性方法包括步驟1)樣本用裂解液和RNA抽提液處理，提取病毒RNA；2)實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)，配制一定組分濃度的25u LPCR反應(yīng)體系，混勻后短暫離心分裝到PCR管中；3)將待測(cè)樣品加入到反應(yīng)體系中，進(jìn)行擴(kuò)增；4)收集熒光信號(hào)，檢測(cè)Ct值。
7.如權(quán)利要求6所述的非診斷性方法，其特征在于，所述實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)的體系組分及其體積如下
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種雙重TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)黃病毒和甲病毒的非診斷性方法，該非診斷性方法包括針對(duì)黃病毒序列中NS5基因和甲病毒序列中NS1基因所設(shè)計(jì)的互補(bǔ)序列，對(duì)待檢樣本進(jìn)行實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，采用常規(guī)反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增及實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，簡(jiǎn)化了蟲(chóng)媒病毒檢測(cè)過(guò)程，替代了操作復(fù)雜、技術(shù)難度大、試驗(yàn)時(shí)間長(zhǎng)的病毒分離技術(shù)，提高了檢測(cè)時(shí)的生物安全性，建立一種高通量快速、敏感的檢測(cè)與篩選黃病毒屬和甲病毒屬病毒的方法，并在蟲(chóng)媒病毒的檢測(cè)方面發(fā)揮了重要作用。
文檔編號(hào)C12Q1/70GK102586480SQ20121004592
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2012年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年2月24日
發(fā)明者劉麗娟, 姚李四, 孫肖紅, 楊宇, 燕清麗, 王旺, 郭金金 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院