專利名稱：一種新型連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種擴(kuò)增方法，尤其涉及一種連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法。
背景技術(shù)：
核酸檢測(cè)技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于分子遺傳學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)及微生物學(xué)等方面的臨床診斷。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，一些新的核酸檢測(cè)方法也不斷涌現(xiàn)，其中，連接酶依賴的檢測(cè)技術(shù)就是其中的一類。連接酶是一種封閉DNA或RNA鏈上缺口(Nick)的酶，借助NAD+或ATP水解提供的能量催化2條核酸單鏈的3、端羥基和5、端磷酸基團(tuán)反應(yīng)形成磷酸二酯鍵。連接酶依賴的檢測(cè)技術(shù)主要是通過(guò)核酸雜交原理及其在缺口連接處的保真性實(shí)現(xiàn)的。1988年，Landegren首先發(fā)明了連接酶體外突變檢測(cè)技術(shù)0LA，并利用該技術(shù)鑒定了編碼導(dǎo)致地中海鐮刀型細(xì)胞貧血癥的β球蛋白的突變等位基因0 s和野生型等位基因βΑ 之間的單堿基差異。1991年，Barany提取出耐熱連接酶并發(fā)展了連接酶檢測(cè)反應(yīng)(Ligase detection reaction, LDR)禾口連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Ligase chain reaction, LCR)技術(shù)。這兩項(xiàng)技術(shù)的提出對(duì)連接酶依賴的體外檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展及應(yīng)用具有深遠(yuǎn)的意義，但是都存在非特異信號(hào)干擾、易用性差等問(wèn)題。其后，連接酶反應(yīng)技術(shù)結(jié)合PCR技術(shù)，衍生出了一系列新的檢測(cè)技術(shù)。如 LDR/PCR、MLPA、PLP (Padlock probe)、MIP (Molecular inversion probe) 等，這些技術(shù)主要通過(guò)連接酶反應(yīng)實(shí)現(xiàn)目的基因的“特異轉(zhuǎn)化”，再由PCR系統(tǒng)擴(kuò)增轉(zhuǎn)化后的特異產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)檢測(cè)。該類技術(shù)都表現(xiàn)出較高的檢測(cè)通量，甚至能夠?qū)崿F(xiàn)>10000重的基因分型(MIP技術(shù))，但是都存在非特異信號(hào)的干擾較嚴(yán)重，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性的問(wèn)題。這類技術(shù)的非特異信號(hào)主要來(lái)源于1.非特異連接酶反應(yīng)；2.非特異的PCR擴(kuò)增。LDR/PCR、MLPA技術(shù)由于受到這兩種非特異的影響，故檢測(cè)的靈敏度有限，且非特異信號(hào)能被檢測(cè)出，存在假陽(yáng)性的風(fēng)險(xiǎn)。PLP及MIP技術(shù)采用了外切酶消化未連接雜交探針的方法，在一定程度上消除了雜交探針在PCR反應(yīng)中的非特異擴(kuò)增，但是當(dāng)檢測(cè)重?cái)?shù)較高時(shí)，仍然會(huì)受到非特異連接的影響，假陽(yáng)性的出現(xiàn)仍不可避免。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種克服連接酶反應(yīng)及PCR的非特異信號(hào)干擾的擴(kuò)增方法。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了降低反應(yīng)背景、增強(qiáng)性噪比、避免假陽(yáng)性等目的。為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種新型連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法，通過(guò)三條連接探針的連接酶反應(yīng)實(shí)現(xiàn)下游的通用擴(kuò)增及檢測(cè)，其特征在于每條連接探針由特異雜交序列及填入的標(biāo)簽序列組成，具體為目標(biāo)序列7從3，端到5’端分別分為A段，B段，C段和D段，連接探針a為A段的反向互補(bǔ)序列2加上一段上游引物標(biāo)簽序列1組成，即2 — 1 ； 連接探針b為C段的反向互補(bǔ)序列3’，加上B段和C段之間的檢測(cè)標(biāo)簽序列4和B段的反向互補(bǔ)序列3組成，即3’-4-3 ；連接探針c為一段下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列6加上D段的反向互補(bǔ)序列5組成，即6 — 5 ；所述的序列1、4、6為不與目標(biāo)序列雜交的序列。所述的上游引物標(biāo)簽序列1、下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列6和檢測(cè)標(biāo)簽序列4的設(shè)計(jì)原則分別為GC含量適中，Tm值為55-70°C，長(zhǎng)度為18_3^p，與目標(biāo)基因組無(wú)較高同源性。 此處的無(wú)較高同源性是指同源性低于50%。所述的序列2、3、3’、5為GC含量適中，Tm值為50_70°C，與目標(biāo)序列特異雜交。所述的連接探針a、b和c的序列中除去序列1、4、6外均為特異雜交序列。。本發(fā)明還提供一個(gè)試劑盒，包含上述的連接探針a、b和c，及試劑盒的用途。本發(fā)明還提供一種芯片，包含上述的連接探針a、b和C，及芯片的用途。所述目標(biāo)序列的A、B、C和D段相互之間無(wú)間隔。目標(biāo)序列的GC含量適中，無(wú)重復(fù)序列或同源性較高的序列出現(xiàn)，連接探針特異雜交的位置最好不要有SNP或突變位點(diǎn)的出現(xiàn)，除非是SNP或突變檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，SNP或突變位點(diǎn)最好位于連接探針的3’端。本發(fā)明還涉及一種連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法用途。所述試劑盒、芯片和連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法在進(jìn)行基因序列分型、定量等檢測(cè)中的用途。本發(fā)明檢測(cè)的是已知目標(biāo)序列，可檢測(cè)突變位點(diǎn)、SNP位點(diǎn)、各物種目標(biāo)基因(如細(xì)菌及病毒的目標(biāo)DNA)的定性及定量反應(yīng)等。本發(fā)明提供一種新型連接酶依賴的擴(kuò)增方法——?dú)W米伽探針技術(shù)(Omega probe technology)，該方法是在連接酶反應(yīng)中，通過(guò)將檢測(cè)標(biāo)簽序列、上游引物標(biāo)簽序列和下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列分別填入三條不同的連接探針中達(dá)到消除非特異信號(hào)干擾的效果。中間連接探針形似“ Ω ”，我們形象地稱之為歐米伽探針，所以稱該方法為歐米伽探針技術(shù)。歐米伽探針技術(shù)的關(guān)鍵組成是三條連接探針，每條連接探針由特異雜交序列及填入的標(biāo)簽序列組成，三條連接探針的標(biāo)簽序列分別為連接探針a的上游引物標(biāo)簽序列、連接探針b的檢測(cè)標(biāo)簽序列、連接探針c的下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列(如圖1)。本發(fā)明技術(shù)方案是通過(guò)三條連接探針雜交于目標(biāo)序列相鄰的位置上，其中，連接探針b雜交于目標(biāo)基因序列時(shí)形成囊狀結(jié)構(gòu)(即為填入的檢測(cè)標(biāo)簽序列4)，囊狀結(jié)構(gòu)兩側(cè)的特異雜交序列形成“雜交共同體”。三條連接探針在連接酶的作用下最終形成一條包含三個(gè)“標(biāo)簽”序列的完整探針鏈，該完整探針鏈即連接產(chǎn)物最終由通用PCR系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。本發(fā)明的方法和步驟為基因組DNA模板經(jīng)高溫(98°C，5-10分鐘)充分變性后，三條連接探針與待檢基因位點(diǎn)DNA序列進(jìn)行特異雜交(雜交于DNA序列上相鄰的位置)，雜交后經(jīng)耐熱連接酶(如Ampligase (Epicentre)、Taq DNA ligase (NEB)等)連接反應(yīng)，形成一條完整的連接探針。該步反應(yīng)旨在將目標(biāo)DNA轉(zhuǎn)化為連接后的完整探針。第二步是用一對(duì)通用引物同時(shí)擴(kuò)增這些已連接的完整探針，未連接的探針不能被正常擴(kuò)增，會(huì)出現(xiàn)線性擴(kuò)增(右側(cè)連接探針出現(xiàn)線性擴(kuò)增)或非特異擴(kuò)增(左側(cè)或右側(cè)探針與引物非特異結(jié)合擴(kuò)增出非特異產(chǎn)物)，而引導(dǎo)檢測(cè)反應(yīng)的歐米伽探針兩端無(wú)引物標(biāo)簽序列和引物結(jié)合標(biāo)簽序列， 不會(huì)出現(xiàn)非特異擴(kuò)增，體系中檢測(cè)不到非特異信號(hào)，故無(wú)非特異信號(hào)的干擾。上游引物標(biāo)簽序列和下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列來(lái)源于通用引物序列。本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中的上游通用引物F是序列TGGAGCGACGATACGAAGATA (SEQ ID NO 11)；下游通用弓| 物 R 是序列GCTCCAAGATCCTATCTAGA (SEQ ID NO: 12)。本發(fā)明是一種新型的連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法，不同于傳統(tǒng)的依賴連接反應(yīng)的擴(kuò)增方法(如LDR/PCR、MLPA、PLP及MIP等)，該技術(shù)具有如下優(yōu)點(diǎn)1.針對(duì)一個(gè)待檢測(cè)的基因序列設(shè)計(jì)三條連接探針，保證檢測(cè)反應(yīng)極高的特異性。尤其適用于同源性較高序列的分辨檢測(cè)；
2.消除非特異連接信號(hào)的干擾本技術(shù)中的非特異連接產(chǎn)物在PCR中要么是線性擴(kuò)增、要么存在少量的指數(shù)擴(kuò)增，而這些產(chǎn)物均不會(huì)被檢測(cè)出；
3.避免非特異擴(kuò)增信號(hào)的干擾連接探針b不會(huì)出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，而連接探針a和 c與PCR引物間的少量非特異擴(kuò)增則不會(huì)被檢測(cè)出；
4.三條連接探針中均加入標(biāo)簽序列，可在相同的擴(kuò)增體系和檢測(cè)體系下實(shí)現(xiàn)不同目標(biāo)序列的高效擴(kuò)增和檢測(cè)；
5.實(shí)驗(yàn)流程及操作時(shí)間短，檢測(cè)系統(tǒng)開(kāi)放，可通過(guò)實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)、芯片系統(tǒng)等實(shí)現(xiàn)檢
測(cè)；
6.連接探針的長(zhǎng)度較短(約35-60nt)，易于設(shè)計(jì)和化學(xué)合成。


附圖1為本新型連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法的檢測(cè)原理。其中7為目標(biāo)序列，目標(biāo)序列從3’段到5’段，依次分為A、B、C、D。1為上游引物標(biāo)簽序列，2為A段的反向互補(bǔ)序列，3為B段的反向互補(bǔ)序列，3’為C段的反向互補(bǔ)序列，4為B段和C段之間的檢測(cè)標(biāo)簽序列，5為D段的反向互補(bǔ)序列，6為下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列。附圖2A、2B和2C均為普通及囊狀結(jié)構(gòu)雜交序列熔解曲線圖，其中8為連接探針 2熔解曲線，9為連接探針1熔解曲線，10為連接探針3熔解曲線，11為連接探針4熔解曲線，12為連接探針2熔解曲線，13為連接探針4熔解曲線，14為連接探針5熔解曲線。附圖3A為梯度稀釋DNA的擴(kuò)增曲線，3B為梯度稀釋DNA的標(biāo)準(zhǔn)曲線；其中15為梯度稀釋模板(加樣量分別為 1. OXlO7,1. OXlO6,1. OXlO5,1. OXlO4、1. OXlO3,1. OXlO2 拷貝，從左至右依次排列)擴(kuò)增曲線，16為陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線。附圖4A、4B、4C分別為三份人基因組DNA樣本SNP基因分型檢測(cè)結(jié)果，其中17為 FAM通道信號(hào)，對(duì)應(yīng)基因型A ； 18為HEX通道信號(hào)，對(duì)應(yīng)基因型G。
具體實(shí)施例方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件(例如參考J.薩姆布魯克等著， 黃培堂等譯的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》，第三版，科學(xué)出版社)或者按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市購(gòu)獲得的常規(guī)產(chǎn)品。實(shí)施例中使用儀器實(shí)時(shí)熒光PCR儀(Rotor-gene 6000，德國(guó)QIAGEN公司)，紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(ND-1000，美國(guó)NanoDrop公司)，臺(tái)式微量離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)，本技術(shù)方案實(shí)施例中所有序列合成均來(lái)自生工生物工程(上海)有限公司。連接酶為 AmpligaseDNA Ligase Kit (5U/ μ L, 1000U, Epicentre)，所使用的基因組 DNA 樣本來(lái)源于正常人的外周血提取，均采用Qiagen公司的DNeasy Blood Kit并遵照其說(shuō)明書(shū)的提取方式提取獲得。外周血樣品由廈門(mén)市婦幼保健院提供。標(biāo)本的使用均獲得當(dāng)事人或其監(jiān)護(hù)人的許可。
實(shí)施例1 多條連接探針的熔解曲線比較
目標(biāo)序列CTGCAGGGAAATGTCTAGATTGGATCTTGC(SEQ ID N0:1)
連接探針1 (與目標(biāo)序列完全互補(bǔ)雜交)
GCAAGATCCAATCTAGACATTTCCCTGCAG(SEQ ID NO:2)
連接探針2 (與目標(biāo)序列雜交形成囊狀結(jié)構(gòu)的雜交共同體，囊狀結(jié)構(gòu)位于其正中間，虛線位置的堿基組成囊狀結(jié)構(gòu))
GCAAGATCCAATCTAGGAATCTGGATTCAAAATCTTGACATTTCCCTGCAG (SEQ ID N0:3)
連接探針3(與目標(biāo)序列雜交形成囊狀結(jié)構(gòu)的雜交共同體，虛線位置的堿基組成囊狀結(jié)
構(gòu))
GCAAGATCCAATCTAGACATTTGGAATCTGGATTCAAAATCTTCCCTGCAG (SEQ ID N0:4)
連接探針4(與目標(biāo)序列雜交形成囊狀結(jié)構(gòu)的雜交共同體，虛線位置的堿基組成囊狀結(jié)
構(gòu))
GCAAGATCCAATCTAGACAGGAATCTGGATTCAAAATCTTTTTCCCTGCAG (SEQ ID N0:5)
連接探針 5: GCAAGATCCAATCTAGACA(SEQ ID NO:6)
通過(guò)Sybrgreen染料考察以上連接探針與目標(biāo)序列的熔解過(guò)程。25 μ L 熔解體系為75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0,20 mmol/L (NH4)2SO4，0. 01 % Tween 20，50 mmol/L KCl, 4 mmol/L Mg2+, 0. 4 ymol/L 連接探針。0.2 μ mol/L 目標(biāo)序列，0. 2 μ L Sybrgreen熒光染料。熔解分析程序?yàn)?5°C 1分鐘；40°C 1分鐘；40°C升溫至 90°C，整個(gè)升溫過(guò)程采集相應(yīng)的熒光信號(hào)。結(jié)果顯示1、見(jiàn)普通及囊狀結(jié)構(gòu)雜交序列熔解曲線圖2A，其中8為連接探針2熔解曲線，9為連接探針1熔解曲線，連接探針1、2與目標(biāo)序列雜交后的熔解曲線圖顯示囊狀結(jié)構(gòu)探針的熔解與普通探針的熔解一樣，是一個(gè)獨(dú)立的熔解過(guò)程，而不是囊狀結(jié)構(gòu)兩側(cè)分別熔解的過(guò)程，其熔解峰為獨(dú)立的單峰。囊狀結(jié)構(gòu)探針的Tm值比相同探針的正常探針的 Tm值低8°C左右。2、見(jiàn)普通及囊狀結(jié)構(gòu)探針熔解曲線圖2B，其中10為連接探針3熔解曲線，11為連接探針4熔解曲線，12為連接探針2熔解曲線，連接探針2、3、4與目標(biāo)序列雜交后的熔解曲線圖顯示囊狀結(jié)構(gòu)在探針中的位置影響雜交Tm值，其位于探針的中間位置時(shí)對(duì)應(yīng)的“雜交共同體”的Tm值最小。3、見(jiàn)普通及囊狀結(jié)構(gòu)探針熔解曲線圖2C，其中13為連接探針4熔解曲線，14為連接探針5熔解曲線，連接探針4、5與目標(biāo)序列雜交后的熔解曲線圖顯示囊狀結(jié)構(gòu)的雜交Tm值大于單獨(dú)一側(cè)的Tm值，進(jìn)一步說(shuō)明囊狀結(jié)構(gòu)探針的整體熔解現(xiàn)象。實(shí)施例2 定量檢測(cè)目標(biāo)序列
選擇一段人工合成的DNA序列為考察對(duì)象，針對(duì)該序列設(shè)計(jì)三條連接探針?lè)謩e雜交于目標(biāo)序列相鄰的位置上，具體序列如下 目標(biāo)序列
CTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGATGCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATA TGA(SEQ ID N0:7)連接探針a
TGGAGCGACGATACGAAGATATCATATTCCTCAACATGTCTGC (SEQ ID NO:8) 連接探針b
P04-TATACTGCTTAAATTTAACTTCGGTCCTTCATCGCTGGTAGCATCATATTGC (SEQ ID N0:9) 連接探針c
P04-CCAGGTACAGGAGACTGTGTAGTCTAGATAGGATCTTGGAGC (SEQ ID NO:10)
其中，連接探針a的上游引物標(biāo)簽序列為通用引物F序列，連接探針c的下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列為通用引物R的反向互補(bǔ)序列
通用引物 F: TGGAGCGACGATACGAAGATA(SEQ ID NO: 11)
通用引物 R: GCTCCAAGATCCTATCTAGA(SEQ ID NO: 12)
中間連接探針的檢測(cè)標(biāo)簽序列為FAM標(biāo)記的Taqman探針序列 (FAM-AACTTCGGTCCTTCATCGCT-BHQ,序列部分為SEQ ID NO: 13),三條連接探針雜交于目標(biāo)序列相鄰位置上，連接酶反應(yīng)后經(jīng)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)的目的。目標(biāo)序列十倍梯度稀釋獲取濃度分別為1.0'107U. 0'106U. 0'105U. 0'10\ 1. 0' IO3U. 0' IO2拷貝的DNA，選擇此梯度DNA為定量檢測(cè)模板。實(shí)驗(yàn)體系1.連接反應(yīng)10 μ L反應(yīng)體系中含IyL雜交連接緩沖液、25fmol的每條連接探針、IU的連接酶，5 μ L的DNA模板；連接反應(yīng)程序?yàn)?5°C 1分鐘，60°C 10分鐘， 550C 10分鐘，50°C 10分鐘；2. PCR反應(yīng)25 μ L反應(yīng)體系內(nèi)含2 μ L第一步連接產(chǎn)物，75 mmol/L Tris-HCl pH 9.0,20 mmol/L (NH4)2SO4 ，0·01 % Tween 20，50 mmol/L KCl，1 U 7 《酶，3 mmol/L Mg2+，0.2 μ mol/L Taqman 探針，0. 4 μ mol/L通用引物 F 和 0. 4 μ mol/L通用引物R;PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 3分鐘；95°C 15秒，58°C 30秒50個(gè)循環(huán)；58°C退火延伸階段采集FAM熒光信號(hào)。梯度稀釋模板的擴(kuò)增曲線為FAM通道均出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)且擴(kuò)增曲線呈現(xiàn)梯度，隨模板拷貝數(shù)的降低，擴(kuò)增曲線Ct值(PCR反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)達(dá)到設(shè)定的閾值時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù))逐漸增加。陰性對(duì)照(NTC)無(wú)擴(kuò)增信號(hào)出現(xiàn)(圖3A)。梯度稀釋模板標(biāo)準(zhǔn)曲線為其 Ct值與起始DNA拷貝數(shù)線的對(duì)數(shù)呈良好的線性關(guān)系(R2=O. 99)，體現(xiàn)該方法較佳的定量能力(圖郎)。實(shí)施例3 三份人基因組DNA樣本SNP基因分型檢測(cè)選擇SNP位點(diǎn)(rs740598)為研究對(duì)象，設(shè)計(jì)四條連接探針如下 連接探針a
TGGAGCGACGATACGAAGATACCAAATATTTTTCGTAAGTATTTCAAAT (SEQ ID N0:14) 連接探針b — 1
P04-AGCAATGGCTCGTCCATCTCTAAGGCAAGGCTCTATGGTTAGTCTCA (SEQ ID N0:15) 連接探針b — 2
P04-AGCAATGGCTCGTCACCTTCCGTCTGTACTCGTTATGGTTAGTCTCG(SEQ ID NO:16) 連接探針c
P04-CAGCCACATTCTCAGAACTGCTCTAGATAGGATCTTGGAGC (SEQ ID NO:17) 其中，連接探針a、c的標(biāo)簽序列同實(shí)施例二，連接探針b — 1的檢測(cè)標(biāo)簽序列為FAM標(biāo)記 iTaqman 探針序列(FAM-CATCTCTAAGGCAAGGCTC-BHQ,序列部分為 SEQ ID NO: 18)，對(duì)應(yīng)雜交于基因型為A的模板，連接探針b - 2的檢測(cè)標(biāo)簽序列為T(mén)ET標(biāo)記的Taqman探針序列 (TET-ACCTTCCGTCTGTACTCGT-BHQ，序列部分為SEQ ID NO: 19)，對(duì)應(yīng)雜交于基因型為G的模板。連接探針a、c分別雜交于連接探針b的相鄰兩側(cè)位置，連接酶反應(yīng)后經(jīng)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)分型檢測(cè)的目的。選擇三份已知基因型的人基因組樣本(濃度均為IOng/μ L)為驗(yàn)證對(duì)象，樣本A的基因型為ΑΑ，樣本B的基因型為GG，樣本C的基因型為AG。實(shí)驗(yàn)體系1.基因組DNA變性取基因組DNA各5 μ L (總量50ng)于98°C溫浴5 分鐘，隨即降至25°C保存；2.連接反應(yīng)=IOyL反應(yīng)體系中含IyL雜交連接緩沖液、25fmol 的每條連接探針、IU的連接酶，5 μ L第一步已變性的基因組模板；連接反應(yīng)程序?yàn)?5°C 1 分鐘，60°C 10分鐘，55°C 10分鐘，50°C 10分鐘；3. PCR反應(yīng)25 μ L反應(yīng)體系內(nèi)含2 μ L第二步連接產(chǎn)物，75 mmol/L Tris-HCl pH 9. 0,20 mmol/L (NH4)2SO4，0· 01 % Tween 20,50 mmol/L KCl, 1 U T^ 酶，3 mmol/L Mg2+，0.15 μ mol/L 各 Taqman 探針，0. 4 μ mol/L 通用弓丨物F和0. 4ymol/L通用引物R。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5°C 3分鐘；95°C 15秒，58°C 30秒50 個(gè)循環(huán)；58 °C退火延伸階段采集FAM和TET雙色熒光信號(hào)。見(jiàn)A樣本SNP基因分型檢測(cè)結(jié)果圖4A 樣本A的擴(kuò)增曲線情況為FAM(Green)通道(即17)出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，TET (Yellow)通道(即18)未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，故驗(yàn)證其對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)為AA型；見(jiàn)B樣本SNP基因分型檢測(cè)結(jié)果圖4B 樣本B的擴(kuò)增曲線情況為=FAM(Green) 通道未出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，TET (Yellow)通道出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，故驗(yàn)證其對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)為GG型； 見(jiàn)C樣本SNP基因分型檢測(cè)結(jié)果圖4C 樣本C的擴(kuò)增曲線情況為FAM (Green)通道出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，TET (Yellow)通道也出現(xiàn)擴(kuò)增信號(hào)，故驗(yàn)證其對(duì)應(yīng)SNP位點(diǎn)為AG型。
權(quán)利要求
1.一種連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法，采用連接探針a、b、C介導(dǎo)擴(kuò)增，其特征在于每條連接探針由特異雜交序列及填入的標(biāo)簽序列組成，具體為目標(biāo)序列7從3’端到5’端分別分為A段，B段，C段和D段，連接探針a為A段的反向互補(bǔ)序列2加上一段上游引物標(biāo)簽序列1組成，即2 — 1 ；連接探針b為C段的反向互補(bǔ)序列3’，加上B段和C段之間的檢測(cè)標(biāo)簽序列4和B段的反向互補(bǔ)序列3組成，即3’-4-3 ；連接探針c為一段下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列6加上D段的反向互補(bǔ)序列5組成，即6 — 5 ；所述的序列1、4、6為不與目標(biāo)序列雜交的序列。
2.權(quán)利要求1的連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法，其特征在于所述的上游引物標(biāo)簽序列 1、下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列6和檢測(cè)標(biāo)簽序列4的設(shè)計(jì)原則分別為GC含量適中，Tm值為 55-70°C，長(zhǎng)度為18-35nt，與目標(biāo)基因組無(wú)較高同源性。
3.權(quán)利要求1的連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法，其特征在于所述的序列2、3、3’、5為GC 含量適中，Tm值為50-70°C，與目標(biāo)序列特異雜交。
4.權(quán)利要求1的連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法，其特征在于所述的連接探針a、b和c 的序列中除去序列1、4、6外均為特異雜交序列。
5.一個(gè)試劑盒，包含權(quán)利要求1 一 4中任一項(xiàng)所述的連接探針a、b和C。
6.一種芯片，包含權(quán)利要求1 一 4中任一項(xiàng)所述的連接探針a、b和C。
7.權(quán)利要求1的連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法及權(quán)利要求5的試劑盒和權(quán)利要求6的芯片的用途。
8.權(quán)利要求7的用途是指在進(jìn)行基因序列分型、定量等檢測(cè)中的用途。
9.一種連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法所用連接探針a、b和c的制備方法，其步驟為，選定模板的目標(biāo)序列7，將其從3’端到5’端分別分為相互不間隔的A、B、C、D段，A的反向互補(bǔ)序列為序列2，B的反向互補(bǔ)序列為序列3，C的反向互補(bǔ)序列為序列3’，D的反向互補(bǔ)序列為序列5，其中連接探針a即為序列2加上序列1，連接探針b為序列3加上序列4加上序列 3’，連接探針c為序列6加上序列5，其中序列1、4、6為GC含量適中，Tm值為55_70°C，長(zhǎng)度為18-3^p，與目標(biāo)基因組無(wú)較高同源性的序列；其中的序列2、3、3’、5的GC含量適中， Tm值為50-70°C，按照連接探針a、b、c的序列，化學(xué)合成即可。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型連接酶反應(yīng)介導(dǎo)的擴(kuò)增方法及用途，通過(guò)三條連接探針的連接酶反應(yīng)實(shí)現(xiàn)下游的通用擴(kuò)增及檢測(cè)。通過(guò)將檢測(cè)標(biāo)簽序列、上游引物標(biāo)簽序列和下游引物結(jié)合標(biāo)簽序列分別填入三條不同的連接探針中達(dá)到消除非特異信號(hào)干擾的效果。其中含檢測(cè)標(biāo)簽序列的探針雜交于目標(biāo)序列時(shí)形成囊狀結(jié)構(gòu)且囊狀結(jié)構(gòu)兩側(cè)的特異雜交序列形成“雜交共同體”。三條連接探針雜交于目標(biāo)序列相鄰的位置上，在連接酶的作用下最終形成一條包含三個(gè)“標(biāo)簽”序列的完整探針鏈，連接產(chǎn)物最終由通用PCR系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增。本發(fā)明還包含三條連接探針的試劑盒和芯片，及其用途，特別是基因序列分型檢測(cè)中的用途。該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了降低反應(yīng)背景、增強(qiáng)性噪比、避免假陽(yáng)性的目的。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102559661SQ20121001543
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者王小波 申請(qǐng)人:廈門(mén)基科生物科技有限公司