專利名稱：用于生產(chǎn)l-2-氨基丁酸的載體、工程菌株及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地，涉及用于生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的載體、工程菌株及方法。
背景技術(shù)：
L-2-氨基丁酸(L(+)-2_Aminobutyric acid),是一種非天然的手性α -氨基酸，分子式為C4H9NO2，主要用于合成治療局限性及繼發(fā)性全身性癲癇的疾病，同時也是合成抑菌抗結(jié)核藥乙胺丁醇的關(guān)鍵手性前體。轉(zhuǎn)氨酶法是目前廣泛應(yīng)用的生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的方法。早期采用酮酸和谷氨酸為底物，在氨基酸轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成L-2-氨基丁酸，該法收率較低；后采用L-蘇氨酸為原料，采用三酶體系制備L-2-氨基丁酸，該法產(chǎn)率低且有副產(chǎn)物影響產(chǎn)品的純化；氨基酸氧化酶法是使用D-氨基酸氧化酶在金屬催化劑的作用下制備L-2-氨基丁酸，該法成本高，不適合大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用。此外還有脫氫酶法、氨基酰化酶法等，但是存在生產(chǎn)成本過高以及酶活受到底物抑制的問題，因此工業(yè)應(yīng)用效果不佳。因此本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)高效經(jīng)濟的L-2-氨基丁酸的生產(chǎn)方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于構(gòu)建發(fā)酵生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的重組載體。本發(fā)明的另一目的在于提供一種用于發(fā)酵生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的基因工程菌株。本發(fā)明的另一目的在于提供一種生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的方法。本發(fā)明另一目的在于提供前述載體、工程菌株和生產(chǎn)方法的用途。在本發(fā)明的第一方面，提供了一種重組載體，所述重組載體具有編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸序列和編碼L-氨基酸脫氫酶的多核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸序列選自下組:大腸桿菌來源的ilvA基因、大腸桿菌來源的TdcB基因、芽孢桿菌來源的ilvAbs基因、鼠傷寒沙門氏菌來源的蘇氨酸脫氨酶基因、或擬南芥來源的蘇氨酸脫氨酶基因。在另一優(yōu)選例中，編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸序列為:大腸桿菌來源的ilvA基因或大腸桿菌來源的TdcB基因。在另一優(yōu)選例中，所述的L-氨基酸脫氫酶選自下組:L_亮氨酸脫氫酶、L-丙氨酸脫氫酶、L-纈氨酸脫氫酶、L-苯丙氨酸脫氫酶。在另一優(yōu)選例中，編碼L-氨基酸脫氫酶的多核苷酸序列選自下組:芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶編碼基因、芽孢桿菌來源的L-丙氨酸脫氫酶編碼基因、古球菌來源的L-丙氨 酸脫氫酶編碼基因、鏈霉菌來源的L-纈氨酸脫氫酶編碼基因、嗜熱放線菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶編碼基因，或芽孢桿菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶編碼基因。
在另一優(yōu)選例中，編碼L-氨基酸脫氫酶的多核苷酸序列為:芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶編碼基因，嗜熱芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶編碼基因，或鏈霉菌來源的纈氨酸脫氫酶基因。在另一優(yōu)選例中，所述的重組載體從5’端到3’端依次具有:第一啟動子、蘇氨酸脫氨酶編碼序列和第一終止子、L-氨基酸脫氫酶編碼序列和第二終止子。在另一優(yōu)選例中，所述的重組載體從5’端到3’端依次具有:第一啟動子、蘇氨酸脫氨酶ilvA編碼序列和第一終止子、L-亮氨酸脫氫酶基因IeuDH編碼序列和第二終止子。在另一優(yōu)選例中，蘇氨酸脫氨酶ilvA編碼序列來源于大腸桿菌W3110。在另一優(yōu)選例中，L-亮氨酸脫氫酶基因IeuDH編碼序列來源于芽孢桿菌BacillusCereus0在另一優(yōu)選例中，所述的重組載體為pSUGAP-1lvA-leuDH，pSUGAP-1euDH-1IvA,pSUGAP-1lvA-BSleuDH, pSUGAP-Vdh-1IvA, pSUGAP-TdcB-leuDH， pSUGAP-TdcB-BSleuDH，或pSUGAP-Vdh-tdcBo在本發(fā)明的第二方面，提供了一種宿主細胞，它含有本發(fā)明第一方面所述的載體或基因組中整合有本發(fā)明第一方面任一所述的多核苷酸序列。在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細胞為原核細胞，較佳地為大腸桿菌細胞。在另一優(yōu)選例中，所述的大腸桿菌是高表達蘇氨酸的大腸桿菌。在另一優(yōu)選例中，所述宿主細胞的染色體具有選自下組的至少一個特征:(I)天冬氨酸激酶I基因thrA的1034位堿基發(fā)生C — T突變；(2)天冬氨酸激酶III基因IysC的1055位堿基發(fā)生C — T突變；(3)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc啟動子為trc啟動子；(4)乙酰-CoA合成酶基因acs啟動子為trc啟動子；(5)選自下組的至少一個基因失活或敲除:二氨基庚二酸鹽脫羧酶基因lysA、高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因metA、蘇氨酸脫氫酶基因tdh、蘇氨酸轉(zhuǎn)運酶基因tdcC和調(diào)控基因 iclR。在另一優(yōu)選例中，所述宿主細胞為大腸桿菌THR。在本發(fā)明的第三方面，提供了本發(fā)明第二方面所述的宿主細胞在制備L-2-氨基丁酸中的用途。在本發(fā)明的第四方面，提供了一種生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的方法，包括步驟:(i)在合適的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第二方面所述的宿主細胞；和(ii)從(i)的培養(yǎng)物中分離出所述的L-2-氨基丁酸。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。圖1為酶切回收PSU27 18的電泳結(jié)果。
圖2為PCR得到的GAP片段的電泳結(jié)果。圖3為pSUGAP、pET28b_ilvA和pET28b_leuDH雙酶切電泳檢測結(jié)果，其中泳道I為 pET28b-1lvA、泳道 2 為 pET28b_leuDH、泳道 3 為 pSUGAP。圖4為pSUGAP-1lvA和pSUGAP_leuDH的雙酶切電泳檢測結(jié)果，其中，泳道I和2為 pSUGAP-1lvA 1-2、泳道 3-7 為 pSUGAP-leuDH 1-5。圖5為pSUGAP-1lvA和pSUGAP-leuDH分別用Bgl II和BamH I雙酶切電泳檢測結(jié)果，泳道I為pSUGAP-1lvA用Bgl II單酶切，泳道2為pSUGAP-1lvA用BamH I酶切，泳道 3 為 pSUGAP-leuDH 用 Bgl II 單酶切，泳道 4 為 pSUGAP-leuDH 用 BamH I 酶切。圖6為pSUGAP-1IvA-1euDH的Sal I酶切電泳檢測結(jié)果，其中SM為Specialmarker，包括 2354bp, 1703bp 和 1151bp ;泳道 1-6 為 pSUGAP-1IvA-1euDH 1-6。圖7為pSUGAP-leuDH-1lvA的Xho I/BamH I雙酶切電泳檢測結(jié)果，泳道1-4為pSUGAP-leuDH-1lvA 1-4。圖8為pSUGAP-leuDH-1lvA的HindIII酶切電泳檢測結(jié)果，其中，泳道1-3為pSUGAP-leuDH-1lvA 1-3 ；SM 為 Special marker，包括 2354bp、1703bp 和 1151bp。圖9為攜帶IeuDH和ilvA的克隆子THR/pSUGAP的鑒定結(jié)果，其中，圖9a為THR/pSUGAP-leuDH-1lvA克隆子鑒定結(jié)果；泳道I為pSUGAP-leuDH-1lvA、泳道8為THR、泳道9-13 為 THR/pSUGAP-leuDH-1lvA 1-5 ;圖 9b 為 THR/pSUGAP-1IvA-1euDH 克隆子鑒定結(jié)果，泳道 4-6 為 THR/pSUGAP-1lvA-leuDHl-3 ;泳道 7 為 pSUGAP-1euDH-1IvA ;泳道 9 為 THR。圖10為THR/pSUGAP-TdcB-leuDH克隆子鑒定結(jié)果；其中，泳道I為pSUGAP-TdcB-leuDH,泳道 2-3 為 THR/pSUGAP-TdcB-leuDH 1-2,泳道 4 為 THR。圖11為pSUGAP的質(zhì)粒圖譜。圖12為pSUGAP-leuDH的質(zhì)粒圖譜。圖13 為 pSUGAP-1lvA 質(zhì)粒圖譜。圖14 為 pSUGAP-1IvA-1euDH 質(zhì)粒圖譜。圖15 為 pSUGAP-leuDH-1lvA 質(zhì)粒圖譜。圖16 為 pSUGAP-BSleuDH 質(zhì)粒圖譜。圖17 為 pSUGAP-1IvA-BSleuDH 質(zhì)粒圖譜。圖18 為 pSUGAP-Vdh 質(zhì)粒圖譜。圖19 為 pSUGAP-Vdh-1lvA 質(zhì)粒圖譜。圖20為pET24a_TdcB的質(zhì)粒圖譜。圖21 為 pSUGAP-TdcB-leuDH 的質(zhì)粒圖譜。圖22 為 pSUGAP-TdcB-BSleuDH 質(zhì)粒圖譜。圖23 為 pSUGAP-TdcB 質(zhì)粒圖譜。圖24 為 pSUGAP-Vdh-TdcB 質(zhì)粒圖譜。
具體實施例方式本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次構(gòu)建了包含蘇氨酸脫氨酶編碼基因和L-氨基酸脫氫酶編碼基因的重組 載體，將該重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌，獲得生產(chǎn)工程菌株，以葡萄糖為原料，通過發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌株而得到L-2-氨基丁酸。本發(fā)明方法成本低，產(chǎn)物濃度高，沒有副產(chǎn)物影響，產(chǎn)物易于純化，非常適于工業(yè)應(yīng)用。術(shù)語載體的構(gòu)建本技術(shù)領(lǐng)域人員可方便地用各種已知方法構(gòu)建載體，包括具有編碼蘇氨酸脫氨酶的序列和L-氨基酸脫氫酶編碼基因的載體，以及與之操作性相連的調(diào)控序列。所述的“操作性相連”或“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠調(diào)節(jié)或控制同一線性DNA序列其它部分的活性。例如，如果啟動子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它就是可操作地連于編碼序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)宿主細胞來選擇合適的表達載體，根據(jù)已知空載體的酶切圖譜，本領(lǐng)域技術(shù)人員可按照常規(guī)方法通過限制性酶剪切與拼接，將編碼序列插入合適的限制性位點，制得本發(fā)明的重組載體。在本方面的一個優(yōu)選例中，構(gòu)建的載體見表I。表I
權(quán)利要求
1.一種重組載體，其特征在于，所述重組載體具有編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸序列和編碼L-氨基酸脫氫酶的多核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于，編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸序列選自下組: 大腸桿菌來源的iIvA基因、大腸桿菌來源的TdcB基因、芽孢桿菌來源的iIvAbs基因、鼠傷寒沙門氏菌來源的蘇氨酸脫氨酶基因、或擬南芥來源的蘇氨酸脫氨酶基因。
3.如權(quán)利要求2所述的重組載體，其特征在于，編碼蘇氨酸脫氨酶的多核苷酸序列為:大腸桿菌來源的ilvA基因或大腸桿菌來源的TdcB基因。
4.如權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于，編碼L-氨基酸脫氫酶的多核苷酸序列選自下組: 芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶編碼基因、芽孢桿菌來源的L-丙氨酸脫氫酶編碼基因、古球菌來源的L-丙氨酸脫氫酶編碼基因、鏈霉菌來源的L-纈氨酸脫氫酶編碼基因、嗜熱放線菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶編碼基因、嗜熱芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶編碼基因、或芽孢桿菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶編碼基因。
5.如權(quán)利要求4所述的重組載體，其特征在于，編碼L-氨基酸脫氫酶的多核酸序列選自下組: 芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶編碼基因，嗜熱芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶編碼基因，或鏈霉菌來源的纈氨酸脫氫酶基因。
6.如權(quán)利要求1所述的重組載體，其特征在于，所述的重組載體從5’端到3’端依次具有:第一啟動子、蘇氨酸脫氨酶編碼序列和第一終止子、L-氨基酸脫氫酶編碼序列和第二終止子。
7.一種宿主細胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求1-6任一所述的載體或基因組中整合有權(quán)利要求1-6任一所述的多核苷酸序列。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞的染色體具有選自下組的至少一個特征: (1)天冬氨酸激酶I基因thrA的1034位堿基發(fā)生C— T突變； (2)天冬氨酸激酶III基因IysC的1055位堿基發(fā)生C— T突變； (3)磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc啟動子為trc啟動子； (4)乙酰-CoA合成酶基因acs啟動子為trc啟動子； (5)選自下組的至少一個基因失活或敲除:二氨基庚二酸鹽脫羧酶基因lysA、高絲氨酸琥珀酰轉(zhuǎn)移酶基因metA、蘇氨酸脫氫酶基因tdh、蘇氨酸轉(zhuǎn)運酶基因tdcC和調(diào)控基因iclRo
9.權(quán)利要求7-8任一所述的宿主細胞在制備L-2-氨基丁酸中的用途。
10.一種生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的方法，其特征在于，包括步驟: (i)在合適的培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細胞；和 ( )從Q)的培養(yǎng)物中分離出所述的L-2-氨基丁酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的載體、工程菌株及方法。具體地，本發(fā)明涉及的重組載體包含蘇氨酸脫氨酶編碼基因和L-氨基酸脫氫酶編碼基因以及合適的載體片段；本發(fā)明的基因工程菌株，是使用本發(fā)明提供的重組載體轉(zhuǎn)化宿主菌得到；生產(chǎn)L-2-氨基丁酸的方法是通過發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明提供的基因工程菌而獲得的。本發(fā)明以葡萄糖為原料，通過發(fā)酵培養(yǎng)本發(fā)明構(gòu)建的基因工程菌株而得到L-2-氨基丁酸。本發(fā)明方法成本低，產(chǎn)物濃度高，沒有副產(chǎn)物影響，產(chǎn)物易于純化，非常適于工業(yè)應(yīng)用。
文檔編號C12N5/10GK103215291SQ201210015308
公開日2013年7月24日 申請日期2012年1月18日 優(yōu)先權(quán)日2012年1月18日
發(fā)明者楊晟, 陶榮盛, 朱傅赟, 趙麗麗, 蔣宇, 楊俊杰, 孫周通, 沈正權(quán), 黃鶴, 孫梁棟, 董楓, 劉映淼 申請人:中國科學院上海生命科學研究院, 中國科學院上海生命科學研究院湖州工業(yè)生物技術(shù)中心, 上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心