專利名稱：胰島的分離方法及用于保護胰島組織的保護液的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及從胰臟分離能夠移植的胰島的方法及在該分離方法中用于保護胰島組織的保護液。
背景技術：
I型糖尿病的根治方法例如有從腦死亡者移植胰臟本身的胰臟移植。所述胰臟移植僅通過I次移植就能脫離胰島素等，效果好。但是，外科手術復雜、而且伴隨血液循環(huán)再建，也可能引起并發(fā)癥，因此存在對患者身體造成很大負擔的問題。因此，近年來，胰島移植作為新的糖尿病根治方法受到關注。所謂胰島移植，是將作為調(diào)節(jié)血糖的激素的胰島素或胰高血糖素的分泌組織即胰島從胰臟分離，將分離的胰島從門靜脈向肝臟移植的方法。被 移植的胰島成活在肝臟內(nèi)的門靜脈末端，由此分泌胰島素?，F(xiàn)有的胰臟移植為伴有高侵襲性的外科處置，與此相對，該胰島移植是在門靜脈留置導管，按照靜脈滴注的要領移植胰島進行處置即可，因此與胰臟移植相比，患者身體的負擔較輕并且安全。另外，胰島移植與其他臟器移植不同，其為細胞移植的一種，因此能夠?qū)⒁葝u半永久地冷凍保存。進而，胰島移植時還存在下述優(yōu)點即使發(fā)生排斥反應，由于移植的胰島本身被吸收，所以也無需更換摘除細胞。另一方面，胰島移植存在下述缺點，S卩，由于從胰臟僅分離胰島細胞在技術上的困難性，所以不能獲得適合移植的充分產(chǎn)量的胰島。結(jié)果，需要多次的移植才能實現(xiàn)胰島素脫離，需要接受來自平均2. 6人的供體的胰臟提供。因此，如何能夠從胰臟更多地獲得質(zhì)量優(yōu)異的胰島成為課題。為了解決該課題，一直以來研究了各種胰島分離方法。例如，專利文獻I中公開了特征在于將含有蛋白酶抑制劑的保護液預先注入胰管內(nèi)的胰島的分離方法。該胰島的分離方法中的蛋白酶抑制劑用于提高胰島的產(chǎn)量。在現(xiàn)有的胰島分離方法中，不能得到質(zhì)量及產(chǎn)量充分的胰島的原因如非專利文獻I所公開的那樣，是因為存在于胰臟內(nèi)的來自胰外分泌腺的內(nèi)源酶由于胰臟的摘出而被活化，損傷胰臟組織，之前的胰島分離方法通過采取抑制內(nèi)源酶活性的手段，以求改善胰島的質(zhì)量及產(chǎn)量。來自胰外分泌腺的酶有胰蛋白酶、來自胰的彈性蛋白酶、糜蛋白酶等，上述專利文獻I中使用特異性抑制胰蛋白酶的烏司他丁。專利文獻I中指出，作為通過蛋白酶抑制劑適當?shù)乇Ｗo胰島的組織的結(jié)果，胰島的產(chǎn)量增大。但是，現(xiàn)有的方法在分離的過程中胰島細胞被撕裂等、通常受到物理損傷，不能以必要的產(chǎn)量穩(wěn)定地獲得在移植后分泌充分的胰島素的大小和形狀的胰島。另外，專利文獻I中，用作蛋白酶抑制劑的烏司他丁是以人尿作為原料的生物來源制劑，也存在對于生物體的風險高、缺乏安全性的問題。專利文獻I :國際公開第2006/068226號非專利文獻I Transplantation Proceedings, 2003, Vol. 35, no. 7,2455-
發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種胰島的分離方法及用于保護胰島組織的保護液，所述胰島的分離方法能夠以高產(chǎn)量獲得適合移植的形狀及大小的胰島。本發(fā)明人等在進行本發(fā)明時，新發(fā)現(xiàn)了若供體的嗜中性粒細胞事先浸潤在摘出后的胰臟內(nèi)，經(jīng)過消化的工序,則其數(shù)量增加,并且從該嗜中性粒細胞釋放的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶對胰島造成損傷。因此，發(fā)明人等著眼于通過抑制所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的作用能有效地遏制胰島的損傷，從而完成了本發(fā)明。本發(fā)明涉及以下內(nèi)容。[I] 一種胰島的分離方法，包括下述工序?qū)⒄龅囊扰K破壞得到胰組織的消化工序；和
將上述胰組織浸潰在純化溶液中得到胰島的純化工序，其特征在于，上述消化工序包括下述步驟將含有消化酶的酶溶液注入上述胰臟的內(nèi)部的酶注入步驟；使上述消化酶活化的消化開始步驟；使上述消化酶失活的消化停止步驟；和將已被破壞的胰組織回收的回收步驟，通過在上述消化開始步驟之前添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，從而在開始上述消化開始步驟的時刻，使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在于上述胰臟的內(nèi)部。[2]如[I]所述的胰島的分離方法，其特征在于，在上述消化工序之前，還包括向摘出的胰臟的胰管內(nèi)注入保存液的注入工序及/或?qū)⑸鲜鲆扰K浸潰在浸潰液中進行保存的保存工序。[3]如[I]或[2]所述的胰島的分離方法，其特征在于，上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的添加通過向上述酶溶液中添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑來進行。[4]如[I]或[2]所述的胰島的分離方法，其特征在于，上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的添加通過向上述酶溶液及上述純化溶液中添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑來進行。[5]如[2]所述的胰島的分離方法，其特征在于，上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的添加通過向上述保存液、上述浸潰液、上述酶溶液及上述純化溶液的各個溶液中均添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑來進行。[6]如[3] [5]中任一項所述的胰島的分離方法，其特征在于，上述保存液、上述浸潰液、上述酶溶液及上述純化溶液中的上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的濃度為
2 200 μ Μ。[7] 一種保護液，用于保護上述胰組織免受由浸潤在胰組織中的嗜中性粒細胞所釋放出的彈性蛋白酶的作用，其特征在于，含有嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑。[8]如[7]所述的保護液，其特征在于，上述保護液中的上述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的濃度為2 200 μ M0此處，所謂保護液是指本發(fā)明的胰島分離方法中使用的保存液、浸潰液、酶溶液或純化溶液等中添加了嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑而得到的液體。根據(jù)本發(fā)明，在胰島的分離方法中，能夠以高產(chǎn)量得到適合移植的形狀及大小的胰島。


[圖I](a) (d)為表示嗜中性粒細胞向胰臟的浸潤程度的圖。[圖2]為表示胰島分離的各工序中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性的圖。[圖3]為表示嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的最佳濃度的圖。[圖4]為表示實施例及比較例中所示的胰島分離方法的各工序中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性的圖。[圖5]為表示所得的胰島的IEQ(IsletEquivalent)的圖。 [圖6]為表示所得的胰島的分離指數(shù)(IsolationIndex)的圖。[圖7]為表示所得的胰島的純度的圖。[圖8]為表示所得的胰島的長徑分布的圖。[圖9](a) ⑷為所得胰島的電子顯微鏡照片。[圖10]為表示所得胰島的刺激指數(shù)(StimulationIndex)的圖。
具體實施例方式以下，說明本發(fā)明的胰島分離方法。本發(fā)明的胰島分離方法包括⑴向胰管內(nèi)注入保存液的“注入工序”；⑵使胰臟浸潰在浸潰液中進行保存的“保存工序”；(3)破壞胰臟的“消化工序”；(4)從破壞而得到的胰組織純化胰島的“純化工序”。并且，消化工序包括以下操作步驟將酶溶液注入胰臟的胰管內(nèi)使其膨脹的“酶注入步驟”；開始消化使胰臟破壞的“消化開始步驟”;停止胰組織的進一步消化的步驟“消化停止步驟”;和將已被破壞的胰組織回收，任意地清洗及濃縮的“回收步驟”。上述步驟中，本發(fā)明的特征在于，至少在消化開始步驟的操作開始的時刻，使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在于膜臟內(nèi)部。接下來，說明本發(fā)明的胰島分離方法中的各工序。(I)注入工序作為胰島分離方法的最初工序，將保存液注入胰管內(nèi)。保存液的注入例如可以通過在胰管中插入導管來進行。此時，可以利用泵調(diào)節(jié)注入壓。插入的導管的數(shù)量優(yōu)選為I根。通過為I根，能夠減少注入胰管內(nèi)的溶液的漏液，也能將臟器的損傷控制在最小限。保存液的滲透壓為270 450m0sm/l，優(yōu)選為300 400m0sm/l。滲透壓在上述范圍內(nèi)時，在將保存液注入胰管內(nèi)后，能夠防止保存中胰組織膨脹或收縮。另外，為了防止細胞或組織的酸性分解等，保存液的PH優(yōu)選為7 8左右。注入胰管的保存液中含有臟器保存液。作為臟器保存液，可以從用于組織的保護或保存的公知的溶液中適當選擇。例如，可以使用UW液、ET-Kyoto液、M-Kyoto液(M-Kyoto液是指在ET-Kyoto液中加入MiraclicK持田制藥株式會社制，注冊商標，通用名稱烏司他丁)而得到的液體)、HTK液、Euro-Col I ins液、Celsior液等,但并不限定于這些。特別優(yōu)選使用ET-Kyoto液。另外，本工序中的向胰管的注入可以使用在上述保存液中添加了嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的溶液(稱作保護液)。作為嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，例如可以使用Elaspol (小野藥品工業(yè)株式會社制，注冊商標，通用名稱西維來司他)，但只要為具有抑制嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的作用的藥劑即可，沒有特別限定。添加在保存液中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的量在發(fā)揮本發(fā)明效果的范圍內(nèi)，根據(jù)抑制劑的種類適當確定。例如，使用Elaspol時，每IL保存液的Elaspol含量為2 200 μ Μ,優(yōu)選為5 100 μ Μ,更優(yōu)選為20 μ Μ。另外，保存液中優(yōu)選含有海藻糖。通過含有海藻糖，胰組織的保護作用進一步提高，因此能夠得到更適合移植的胰島。作為海藻糖，可以使用α，α -海藻糖、α，β -海藻糖及β，海藻糖、或它們的混合物。優(yōu)選使用α，α-海藻糖。保存液中含有的海藻糖的濃度在IOOOml保存液中為O 400mmol,優(yōu)選為50 240mmol,特別優(yōu)選為80 160mmol。另外,保存液中含有的鉀的濃度優(yōu)選較低。具體而言,每IOOOml保存液的鉀濃度為4 50mM，優(yōu)選為10 50mM。鉀濃度低時，不會使胰臟的血管痙攣，能夠使保存液快速地到達組織的各個角落。保存液遍布組織的各個角落，從而能夠提高胰組織的保護作用。因、此，保存液中含有的鉀濃度較低能夠得到更適合移植的胰島。只要不損害本發(fā)明的效果，則保存液中還可以進一步含有其他成分。作為其他成分，可以舉出電解質(zhì)、糖質(zhì)、氨基酸、維生素、藥劑等，但并不限定于這些。(2)保存工序作為胰島分離方法中的第二個工序，將胰管內(nèi)注入了保存液的胰臟浸潰在浸潰液中進行保存。保存方法可以利用使用臟器保存液單體的單純浸潰法、或雙層法。利用雙層法進行保存的方法是在容器內(nèi)放入全氟化碳液(PFC)及臟器保存液形成雙層后，放入臟器，向容器內(nèi)供給氧的同時保存臟器的方法。因此，本發(fā)明中的浸潰液在例如使用單純浸潰法的情況下是指臟器保存液，在使用雙層法的情況下是指PFC及臟器保存液，但并不限定于這些。如果是能夠保存胰臟的溶液，就可以用作本發(fā)明的浸潰液。使用雙層法時，全氟化碳液(PFC)和臟器保存液的比例以體積比計優(yōu)選為I : I左右。氧的供給優(yōu)選進行至少30分鐘以上。通過利用雙層法保存胰臟，能夠維持胰組織的生存能力在較高水平。在從供體摘出胰臟的操作與從摘出的胰臟分離胰島的操作之間存在時間間隔的情況下，需要該保存工序，但在沒有時間間隔可立即轉(zhuǎn)移到胰島的分離操作的情況下也可以省略該工序。作為使用的臟器保存液，例如可以舉出UW液、ET-Kyoto液、M-Kyoto液、HTK液、Euro-Collins液、Celsior液等，但并不限定于這些。另外，本工序中的保存中優(yōu)選使用在上述浸潰液中添加了嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的溶液(稱作保護液)。不僅在注入工序中注入胰管內(nèi)，在保存工序中也使用嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，從而能夠使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑遍布胰組織。作為其結(jié)果，能夠在廣泛的范圍內(nèi)抑制嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的作用，能更有效地遏制胰島的損傷。作為此處使用的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑,例如可以舉出EIaspoI，但只要為具有阻礙中性粒細胞彈性蛋白酶的作用的藥劑即可，沒有特別限定。在使用Elaspol時，用于浸潰保存的液體中所含的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的量相對于每IL浸潰液為2 200 μ Μ,優(yōu)選為5 100 μ Μ,更優(yōu)選為20 μ Μ。另外，臟器保存液中優(yōu)選含有海藻糖。通過含有海藻糖，進一步提高對胰組織的保護作用，因此能夠得到更適合移植的胰島。作為海藻糖，可以使用α，α-海藻糖、α，β_海藻糖及β，海藻糖、或它們的混合物。優(yōu)選使用α，α-海藻糖。臟器保存液中含有的海藻糖的濃度在IOOOml臟器保存液中為O 400mmol，優(yōu)選為50 240mmol，特別優(yōu)選為80 160mmol 0另外，臟器保存液中含有的鉀的濃度優(yōu)選較低。具體而言，每IOOOml臟器保存液的鉀濃度為4 50mM，優(yōu)選為10 50mM。鉀濃度低時，能夠在不使胰臟血管痙攣的情況下，適當保存臟器。因此，臟器保存液中含有的鉀濃度較低能夠得到更適合移植的胰島。只要不損害本發(fā)明的效果，則臟器保存液中還可以含有其他成分。作為其他成分，可以舉出電解質(zhì)、糖質(zhì)、氨基酸、藥劑、維生素等，但并不限定于這些。臟器保存液的滲透壓為270 450m0sm/l，優(yōu)選為300 400m0sm/l。滲透壓在上 述范圍內(nèi)時，能夠在臟器的保存中防止胰組織膨脹或收縮。另外，為了防止細胞或組織的酸性分解等，臟器保存液的pH優(yōu)選為7 8左右。(3)消化工序作為胰島分離方法的第三個工序，將消化酶注入胰臟內(nèi)，破壞(消化)胰臟。具體而言，將具有破壞胰臟作用的酶溶液注入胰管內(nèi)使胰臟膨脹后(以下稱作“酶注入步驟”)，通過活化上述酶而破壞胰臟(以下稱作“消化開始步驟”)。之后，通過使酶失活來停止消化(以下稱作“消化停止步驟”)、將被破壞的胰組織回收(以下稱作“回收步驟”)。作為酶溶液，例如可以使用膠原酶溶液，但并不限定于此。膠原酶是具有將連接胰臟的組織之間的膠原分解的作用的酶。另外，本工序中的向胰管的注入優(yōu)選使用在酶溶液中添加了嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的溶液(稱作保護液)。通過在消化工序中使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在，從而能夠使胰組織和嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑充分地接觸。因此，能夠在廣泛的范圍內(nèi)阻礙嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的作用，能夠更有效地抑制胰島的損傷。例如使用Elaspol作為嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑時，每IL保護液的Elaspol的含量為2 200 μ Μ,優(yōu)選為5 100 μ Μ,更優(yōu)選為20 μ Mo另外，省略⑴注入工序及/或⑵保存工序時，優(yōu)選在該酶溶液中含有在之前(I)注入工序中說明的保存液。酶注入步驟中的酶溶液向胰管內(nèi)的注入可以利用與上述的保存液的注入相同的方法進行。消化開始步驟中的酶的活化例如可以通過使體系的溫度上升來進行。具體而言，將注入膠原酶而膨脹的胰臟放入腔室，用溶液充滿用于消化的回路，形成封閉系統(tǒng)。之后，用泵使溶液循環(huán)，使溶液的溫度上升至膠原酶活化的溫度。由于溫度的上升，浸潤在胰組織中的膠原酶被活化，將形成結(jié)合細胞和細胞的組織的膠原溶解，破壞胰組織。膠原酶在37°C左右最活化。因此，使膠原酶作用破壞胰臟時，需要使體系的溫度上升至37°C左右。消化停止步驟在保持構成胰島的細胞凝集的形態(tài)、且胰外分泌腺組織從胰島的周圍離解的時刻進行。消化的停止可以通過降低體系的溫度來進行?；蛘?，也可以通過加入血清蛋白使酶失活來進行。由血清蛋白的添加引起的失活例如可以使回路為開放系統(tǒng)，將含有人白蛋白的室溫的溶液通過回路內(nèi)而進行。通過將室溫的溶液通過，由此體系的溫度下降及由于酶的稀釋使酶失活。另外，通過加入血清蛋白，使酶失活。
停止消化后，作為回收步驟，回收分解的胰組織?；厥盏囊冉M織優(yōu)選在純化之前用離心分離器離心洗滌，濃縮。(4)純化工序作為胰島分離方法的第四個工序，將在前述工序中回收的胰組織純化。所謂純化是將胰組織分離為胰島和胰外分泌腺組織的工序。本工序操作使用含有密度梯度劑的純化溶液進行。胰島與胰外分泌腺組織相比比重較輕。利用這一點，在利用密度梯度劑形成了密度梯度的純化溶液中放入被分解的胰組織，使用比重離心沉淀法將胰島和胰外分泌腺組織分離。·密度梯度劑可以從用于在溶液內(nèi)形成密度梯度的已知的密度梯度劑中適當選擇。例如可以使用OptiPrep (Axis-Shield公司制，通用名稱iodixanol溶液)、Nycodenz (Axis-Shield公司制,通用名稱iodixanol粉末)等。此處使用的密度梯度劑優(yōu)選能夠制成粘度低的純化溶液的物質(zhì)。這是因為純化溶液的粘度越低，越能快速地進行純化。優(yōu)選的粘度范圍在測定溫度22°C下、用布氏法測定時為5cp以下，優(yōu)選為3cp以下，更優(yōu)選為2cp以下。另外，使用的密度梯度劑優(yōu)選內(nèi)毒素水平低的物質(zhì)。純化溶液通過將密度梯度劑添加在臟器保存液中而得到。此處使用的臟器保存液的定義如浸潰保存上述胰臟的工序中所述。上述列舉的臟器保存液中，可以使用含有海藻糖的保存液，優(yōu)選使用ET-Kyoto液。使用不含海藻糖的臟器保存液時，可以在純化溶液中添加海藻糖。此時，可以使用0，0-海藻糖、0，0-海藻糖及0，0-海藻糖、或它們的混合物。優(yōu)選使用α，α-海藻糖。純化溶液中含有的海藻糖的濃度在IOOOml純化溶液中為O 400mmol,優(yōu)選為50 240mmol,特別優(yōu)選為80 160mmol。另外，本工序操作中，優(yōu)選使用在純化溶液中添加了嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的溶液(稱作保護液)。在破壞胰臟之后，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性也持續(xù)，可能產(chǎn)生細胞傷害。因此，優(yōu)選在純化工序中也使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在，保護胰島不受細胞傷害作用的影響。通過在純化溶液中也添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制齊U，能夠得到損傷進一步減少的胰島。使用Elaspol時，純化溶液中含有的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的量在每IL純化溶液中為2 200 μ M，優(yōu)選為5 100 μ Μ，更優(yōu)選為20 μ Μ。另外，只要不損害本發(fā)明的效果，則純化溶液中可以進一步含有其他成分。作為其他成分，可以舉出腺苷、葡聚糖、肝素等，但并不限定于這些。對于密度梯度劑相對于臟器保存液的添加比例，在純化前測定胰組織的密度，考慮密度梯度劑和臟器保存液的比重進行設定。密度梯度可以利用公知的方法形成。另外，也可以使用如連續(xù)比重制作裝置那樣的裝置形成密度梯度。密度梯度可以為連續(xù)密度梯度或非連續(xù)密度梯度的任一種，但從能夠回收更多的胰島的方面考慮，優(yōu)選連續(xù)密度梯度。上述純化工序也可以使用如C0BE2991那樣的血細胞洗滌裝置進行一系列的操作。使用C0BE2991時，首先利用密度梯度劑在裝置內(nèi)形成密度梯度，在其中放入洗滌濃縮了的分解胰組織，利用連續(xù)比重離心沉淀法分離成胰島和外分泌腺組織。之后，分區(qū)地收集裝置內(nèi)的溶液。用顯微鏡檢查各個分區(qū)，判定在哪個分區(qū)存在胰島，回收胰島。以上為各工序的操作的詳細說明，但其中(I)注入工序及(2)保存工序是為了防止摘出的臟器經(jīng)時劣化而進行的工序。因此，摘出胰臟后，立即進行胰島的分離時，可以適當省略上述⑴及/或⑵工序。另一方面，需要將臟器向遠方搬運的情況等、臟器摘出操作和胰島的分離操作之間存在時間間隔的情況下，需要必須經(jīng)過(2)保存工序而不能省略。較優(yōu)選經(jīng)過(I)及(2)
兩工序。嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑可以在所有的工序中使用，為了至少在進入(3)消化工序中的消化開始步驟的操作的時刻使胰臟內(nèi)存在嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，可以在各工序中添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑。例如，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑可以限定為僅添加在(3)消化工序中的酶注入步驟中所注入的酶溶液中。另外，可以僅添加在消化工序的前工序即(2)保存工序中的浸潰液中，還可以僅添加在其前工序即
(I)注入工序中的保存液中。
根據(jù)上述本發(fā)明的胰島分離方法，與現(xiàn)有的方法相比，能夠得到較大的胰島。所得的胰島沒有缺損，與胰臟中本來的大小約為相同的程度，在患者中的存活率高，胰島素分泌能力也高。從這些理由可以說越大的胰島越適合移植。進而，利用本發(fā)明的方法得到的胰島在形狀的方面也優(yōu)異。如后述的實施例所示，若根據(jù)本發(fā)明的方法，則能夠得到球狀、密度高、胰組織未被破壞的胰島?？梢哉f這樣的胰島的胰島素分泌能力高，適合移植。另外，根據(jù)本發(fā)明的方法得到的胰島的純度高。另外，根據(jù)本發(fā)明的方法，通過將嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑等藥劑的使用頻率抑制在較少的水平，能夠簡化胰島的分離操作，能效率良好地進行。根據(jù)本發(fā)明，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑在抑制胰臟的破壞時所釋放出的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的作用，由此能夠得到損傷少的適合移植的胰島。即，根據(jù)本發(fā)明，能夠以高產(chǎn)量得到適合移植的形狀及大小的胰島。[實施例]本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)將供體的嗜中性粒細胞浸潤在摘出后的胰臟內(nèi)，經(jīng)過消化的工序時其數(shù)量增加，本發(fā)明基于上述新發(fā)現(xiàn)而完成。因此，最先說明發(fā)明人等的發(fā)現(xiàn)。圖I為表示嗜中性粒細胞向胰組織的浸潤程度的圖，使用從小鼠體內(nèi)摘出的胰臟進行以下實驗。首先，摘出小鼠胰臟，將在UW液或ET-Kyoto液中添加了 IV型膠原酶而得到的溶液注入胰管內(nèi)，使胰臟膨脹后，將胰組織的一部分回收。接著，通過在37°C下將膨脹后的胰臟培養(yǎng)15分鐘，進行消化，消化后再次回收胰組織的一部分。將回收的胰組織使用蘇木精-伊紅(HE)進行染色，浸潤在胰組織中的嗜中性粒細胞使用氯乙酸-ASD-萘酚酯酶進行染色。針對使用消化前的胰組織和進行過消化的胰組織得到的染色圖像，比較兩者。圖I中，左側(cè)的(a)及(C)表示消化前的胰組織染色圖像，右側(cè)的(b)及⑷表示消化后的胰組織染色圖像，用箭頭表示的染色圖像表示被活化的嗜中性粒細胞。另外，上層的(a)及(b)表示使用UW液的情況，下層的(C)及(d)表示使用ET-Kyoto液的情況。由圖I的(a)及(C)可知沒有進行消化的胰組織、即消化工序前的正常的胰組織中沒有浸潤嗜中性粒細胞。另一方面，由圖I的右側(cè)的(b)及(d)可知在利用膠原酶破壞胰臟的消化工序后嗜中性粒細胞浸潤，以及與消化前相比嗜中性粒細胞的數(shù)量增大。需要說明的是，圖I的(a)和(b)、(c)和⑷中，分別使用相同的胰組織。因此，可以認為嗜中性粒細胞在摘出后的胰臟中已經(jīng)存在，而且經(jīng)過消化工序胰臟被破壞，由此更多的嗜中性粒細胞浸潤在胰組織內(nèi)。
嗜中性粒細胞被活化時釋放嗜中性粒細胞彈性蛋白酶。嗜中性粒細胞彈性蛋白酶在內(nèi)源性抑制物質(zhì)作用的環(huán)境下作為消化·分解侵入生物體內(nèi)的細菌等的酶，具有重要的作用，但已知由于某種原因該抑制物質(zhì)的作用減弱時引起組織的損傷。因此，認為在胰島的分離工序中嗜中性粒細胞被活化時，胰島受到損傷。因此，胰島分離工序中的何種情形下嗜中性粒細胞被活化，各工序中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性的調(diào)查結(jié)果示于圖2。實驗使用小鼠進行。臟器保存液使用ET-Kyoto液。嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性如下進行測定將含有由胰島分離的各工序中得到的胰組織的懸浮液的上清液作為測定樣品，在含有嗜中性粒細胞彈性蛋白酶特異性底物的反應液中于37°C下培養(yǎng)24小時，通過波長405nm處的吸光度測定反應液中游離的對硝基酰苯胺量。此處，所謂“消化前”是指將具有破壞胰臟作用的膠原酶注入胰管內(nèi)使胰臟膨脹的 狀態(tài)，即本發(fā)明中的酶注入步驟之后、且消化開始步驟之前。所謂“消化后”是指通過在膨脹后使膠原酶活化從而破壞胰臟后，使膠原酶失活，由此使消化停止的狀態(tài)，即本發(fā)明中的消化停止步驟之后、且回收步驟之前。所謂“純化前”是指使消化停止后回收、清洗胰組織的狀態(tài)，即本發(fā)明中的回收步驟之后、且純化工序之前。而且，所謂“純化后”表示使用密度梯度劑將胰島從胰外分泌腺組織分離的狀態(tài)，即本發(fā)明中的純化工序之后。由該圖可知，胰臟中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性在“消化后”的時刻變得最高。另外，可知“純化前”的時刻、即經(jīng)歷胰組織的洗滌操作后的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性下降，并且在經(jīng)過純化工序的“純化后”的時刻，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性進一步下降。也就是說，可以預測胰島在“消化后”的時刻受到損傷最多，因此，認為通過防止該時刻的損傷，能夠有效地得到質(zhì)量優(yōu)異的胰島。本發(fā)明基于上述發(fā)現(xiàn)完成，其特征在于，至少在進入消化工序中的消化開始步驟的操作的時刻，使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在于胰臟內(nèi)部。對于本發(fā)明的分離方法中使用的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的濃度，將細胞傷害性指標即LDH(lactate dehydrogenase ;乳酸脫氫酶)的細胞外漏出作為指標，如下進行研究。首先，在O. 31 10 μ g/mL的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶存在下培養(yǎng)小鼠胰島，經(jīng)過一定時間后回收培養(yǎng)上清液。接著，將培養(yǎng)上清液回收后的小鼠胰島勻漿，回收胰島懸浮液?；厥盏呐囵B(yǎng)上清液及胰島懸浮液中含有的LDH的測定通過使用LDH測定試劑盒測定562nm處的吸光度來進行。嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的最佳濃度的研究如下進行在各種濃度的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶存在下培養(yǎng)小鼠胰島時，添加2 200 μ M的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑西維來司他，同樣地測定LDH量。細胞傷害性是用百分率)表示的、培養(yǎng)上清液中含有的LDH量相對于培養(yǎng)上清液中含有的LDH量和胰島懸浮液中含有的LDH量的總和的比。結(jié)果示于圖3。圖中的縱軸是指細胞傷害的程度，數(shù)字越大，意味著受到的細胞傷害越大。橫軸為嗜中性粒細胞彈性蛋白酶濃度。由圖3可知隨著嗜中性粒細胞彈性蛋白酶濃度變高，胰島細胞受到傷害。此時，若添加2 μ Μ、20 μ Μ、200 μ M的西維來司他，則在20 μ M西維來司他存在下最能抑制胰島細胞的傷害。因此，可知嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的最佳濃度為20 μ M0
接下來，利用實施例具體說明本發(fā)明。這些實施例作為一個例子給出，本發(fā)明并不限定于這些實施例。實施例I及比較例I 3所示的胰島的分離方法中，均使用出生后9周齡以后(體重20 22g)的C57BL/6N小鼠。作為分離的順序，采用省略(I)注入工序及(2)保存工序、在(3)消化工序之后進行(4)純化工序的胰島的分離方法。各例中，使在消化工序中使用的保存液的成分變化來進行。另外，測定各工序中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性。分別測定通過這些方法得到的各胰島的個數(shù)、形狀、大小、胰島素分泌能力。以下給出其詳細內(nèi)容。< 實施例 I :S_Kyoto>首先,在ET-Kyoto液中添加Elaspol (小野藥品工業(yè)株式會社制,注冊商標,通用名稱西維來司他)，使終濃度為20 μ Μ，事先制備保護液(以下稱作S-Kyoto液)。在麻醉下，將上述小鼠于下腹部進行約Icm的皮膚橫切，以V字切口剖開肌層。接著，將小腸及大腸轉(zhuǎn)移到體外后，切開腹側(cè)的橫隔膜，用剪子切開心臟，使其在胸腔內(nèi)失血死亡。剝離胰管后，用注射器(帶30G針)將胰管穿刺，注入約3 5ml在作為消化酶的IV型膠原酶中添加了上述制備的保護液而得到的溶液，由此使胰臟膨脹。從十二指腸、小腸、大腸、脾臟切離膨脹的胰臟，移入50ml錐形管，冰冷卻，將裝入有胰臟的管放入37°C溫浴槽中，由此開始消化。將管在上述溫浴漕中培養(yǎng)約15分鐘，由此促進消化。之后，在裝入有胰臟的管中加入低溫的上述保護液混懸，由此停止消化。進而，通過離心操作洗滌含有胰組織的懸浮液，進行濃縮。最后，作為純化工序，在作為純化溶液的OptiPrep (Axis-ShieId公司制，通用名稱iodixanol溶液)中添加上述保護液，由此制成25%、22. 5%,20%U1. 1%的溶液，使各濃度的溶液重層，形成非連續(xù)密度梯度。接著，在加入含有回收的胰組織的懸浮液之后進行離心分離，回收含有胰島的分區(qū)，由此進行純化。< 比較例 I :ET_Kyoto>比較例I采用ET-Kyoto液(不添加Elaspol)代替實施例I的保護液。作為純化溶液，采用ET-Kyoto液中添加了 OptiPrep的溶液。除此之外的操作與實施例I同樣地進行。< 比較例 2 M-Kyoto>比較例2使用ET-Kyoto液中添加了 Miraclid(持田制藥株式會社，注冊商標，通用名稱烏司他丁)而得到的溶液(以下稱作Μ-Kyoto)代替實施例I的保護液。作為純化溶液，采用ET-Kyoto液中添加了 OptiPrep和Miraclid而得到的溶液。相對于ET-Kyoto液1L，添加100，000單位的Miraclid。除此之外的操作與實施例I同樣地進行?！幢容^例3 :UW>比較例3采用ViaSpan (Bristol-Myers Squibb制,注冊商標,通用名稱UW液)代替實施例I的保護液。純化溶液采用ViaSpan。除此之外的操作與實施例I同樣地進行。(I)關于嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性時期及使用液測定實施例及比較例中進行的分離方法的各工序中的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性。測定的時期為“消化前”、“消化后”、“純化前”、和“純化后”這4點。此處，所謂“消化前”是指將具有破壞胰臟作用的膠原酶注入胰管內(nèi)使胰臟膨脹的狀態(tài)，即本發(fā)明中的酶注入步驟之后、且消化開始步驟之前。所謂“消化后”是指通過在膨脹后使膠原酶活化從而破壞胰臟后，使膠原酶失活，由此停止消化的狀態(tài)，即本發(fā)明中的消化停止步驟之后、且回收步驟之前。所謂“純化前”是指在停止消化后洗滌胰組織的狀態(tài)，即本發(fā)明中的回收步驟之后、且純化工序之前。而且，所謂“純化后”表示使用密度梯度劑將胰島從胰外分泌腺組織分離的狀態(tài)，即本發(fā)明中的純化工序之后 。嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性的具體的測定按以下順序進行。將含有胰組織的懸浮液的上清液作為測定樣品，在含有嗜中性粒細胞彈性蛋白酶特異性底物的反應液中、于3 7 °C下培養(yǎng)2 4小時，通過波長4 O 5 nm處的吸光度測定反應液中游離的對硝基酰苯胺量。此時，作為嗜中性粒細胞彈性蛋白酶特異性底物，使用N-甲氧基琥珀酰-Ala-Ala-PiO-Val-對硝基酰苯胺，由利用已知濃度的對硝基酰苯胺制作的標準曲線算出對硝基酰苯胺量，作為嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性。結(jié)果示于圖4。實施例I及比較例I 3的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性在消化前均為100 μ M左右。在消化后，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性也均從300 μ M同程度地上升至400 μ Μ，但純化后的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性下降，均比消化前低。另外，對于消化后的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性，實施例I最低，接下來比較例2低，比較例I和比較例3同程度為最高。圖4中，從消化前到消化后嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性上升，表示由于胰組織的消化，嗜中性粒細胞被活化。另外，對于純化前的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性，實施例I為最低，接下來依次為比較例2、比較例I、比較例3。認為實施例I的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性最低是嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的作用。進而，觀察嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性值的變動，可以說消化后和純化前的變動表現(xiàn)得最大，嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的作用在消化后最能被發(fā)揮。由以上結(jié)果可知，使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶的活性不持續(xù)而立即遏制的效果最強的是實施例I的保護液。(3)關于IEQ、分離指數(shù)(Isolation Index)、純度、胰島尺寸的分布通過測量使用實施例I及比較例I至3中所示的方法得到的胰島的個數(shù)、長徑及面積，計算這些指標。所謂IEQ是Islet Equivalents (胰島當量)的簡稱,表示將直徑為150 μ m的胰島規(guī)定為I的、胰島的體積的國際單位。分離胰島的個數(shù)如下測定從含有胰島細胞的液體ImL中提取50 μ L，測量用雙硫腙進行染色的胰島的個數(shù)，將該值的20倍作為分離胰島的個數(shù)。胰島的長徑及面積通過使用熒光顯微鏡VH Analyzer (KEYENCE公司)的圖像分析進行測定。使用IEQ及胰島的個數(shù)，且使用“分離指數(shù)=IEQ/胰島的個數(shù)”表示的計算式算出分離指數(shù)。使用由圖像分析得到的面積，且使用“純度=用雙硫腙進行染色的面積/全面積”表示的計算式算出純度。對于胰島尺寸的分布，以用圖像分析得到的胰島的長徑為基準，分成 50 μ m 100 μ m、100 μ m 150 μ m、150 μ m 200 μ m、200 μ m 250 μ m、250μπι 300μπι、300μπι 350μπι、350μπι以上，算出各分布在整個胰島個數(shù)中所占的比例。圖5表示所得胰島的IEQ。根據(jù)圖5可知，實施例I與比較例I及比較例3相比IEQ顯著提高。圖6表示所得胰島的分離指數(shù)。根據(jù)圖6可知，實施例I與比較例I及比較例3相比分離指數(shù)顯著提高。圖7表示所得胰島的純度。根據(jù)圖7可知，實施例I與比較例3相比純度顯著提聞。圖8表示所得胰島的直徑分布。根據(jù)圖8可知，實施例I的情況與比較例相比，150 μ m以下的小胰島很少。進而，實施例I的情況與比較例相比，250 μ m 350 μ m的胰島多，并且能夠得到350 μ m以上的胰島。除實施例以外，能夠得到350 μ m以上的胰島的只有比較例2，從這一點也可知與比較例相比，實施例中能夠以高產(chǎn)量得到較大的胰島。(4)關于形狀圖9表示所得胰島的照片。圖9的(a) (d)為電子顯微鏡下的照片。圖9中，(a)表示比較例3，(b)表示比較例1，(c)表示比較例2，(d)表示實施例I。根據(jù)圖9可知，實施例I中得到的胰島與比較例的胰島相比具有良好的圓形、密集的結(jié)構，被破壞的組織少。實施例I及比較例I 比較例3中得到的胰島的形狀與消化后的嗜中性粒細胞彈性蛋白酶活性的結(jié)果一致。因此，可以認為實施例I中，由于嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的作用，胰組織的損傷被抑制。 (5)關于刺激指數(shù)(Stimulation Index)圖10表示所得胰島的刺激指數(shù)。此處，所謂刺激指數(shù)是表示胰島的分泌能力的指標。胰島分離與實施例I進行相同的操作。在37°C條件下，將實施例I及比較例I 比較例3中得到的各30個胰島培養(yǎng)24小時后，在低葡萄糖或高葡萄糖濃度條件下進行一定時間的培養(yǎng)，測定培養(yǎng)上清液中的胰島素濃度。刺激指數(shù)由低葡萄糖濃度和高葡萄糖濃度下的胰島素分泌能力的比率算出。根據(jù)圖10可知，實施例I與比較例I及比較例3相比刺激指數(shù)顯著提高。由此可知實施例I中得到的胰島與比較例I及比較例3中得到的胰島相比，對葡萄糖刺激應答的胰島素分泌良好。產(chǎn)業(yè)上的可利用性根據(jù)本發(fā)明的胰島的分離方法，能夠以高產(chǎn)量得到適合移植的形狀及大小的胰島，可以期待應用于糖尿病的治療。詳細地且參照特定的實施方式說明了本發(fā)明，但本領域技術人員可知，在不脫離本發(fā)明的主旨和范圍的情況下可以加入各種變更和修正。本申請要求基于2010年7月13日提出申請的日本專利申請(日本特愿2010-159053)的優(yōu)先權，將其內(nèi)容作為參照引入本說明書中。所有被弓I用的參照作為內(nèi)容引入。
權利要求
1.一種胰島的分離方法，包括下述工序 將摘出的胰臟破壞得到胰組織的消化工序；和 將所述胰組織浸潰在純化溶液中得到胰島的純化工序， 其特征在于，所述消化工序包括下述步驟 將含有消化酶的酶溶液注入所述胰臟的內(nèi)部的酶注入步驟； 使所述消化酶活化的消化開始步驟； 使所述消化酶失活的消化停止步驟；和 將已被破壞的胰組織回收的回收步驟， 通過在所述消化開始步驟之前添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，從而在開始所述消化開始步驟的時刻，使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在于所述胰臟的內(nèi)部。
2.如權利要求I所述的胰島的分離方法，其特征在于，在所述消化工序之前還包括向摘出的胰臟的胰管內(nèi)注入保存液的注入工序及/或?qū)⑺鲆扰K浸潰在浸潰液中進行保存的保存工序。
3.如權利要求I或2所述的胰島的分離方法，其特征在于，所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的添加通過向所述酶溶液中添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑來進行。
4.如權利要求I或2所述的胰島的分離方法，其特征在于，所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的添加通過向所述酶溶液及所述純化溶液中添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑來進行。
5.如權利要求2所述的胰島的分離方法，其特征在于，所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的添加通過向所述保存液、所述浸潰液、所述酶溶液及所述純化溶液的各個溶液中均添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑來進行。
6.如權利要求3 5中任一項所述的胰島的分離方法，其特征在于，所述保存液、所述浸潰液、所述酶溶液及所述純化溶液中的所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的濃度為2 200 μ Μ。
7.一種保護液，用于保護所述胰組織免受由浸潤在胰組織中的嗜中性粒細胞所釋放出的彈性蛋白酶的作用，其特征在于，含有嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑。
8.如權利要求7所述的保護液，其特征在于，所述保護液中的所述嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑的濃度為2 200 μ Μ。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種胰島的分離方法及能夠用于該方法的保護液，所述胰島的分離方法包括下述工序在摘出的胰臟的胰管內(nèi)注入保存液的注入工序；將上述胰臟浸漬在浸漬液中進行保存的保存工序；破壞上述胰臟得到胰組織的消化工序；和將上述胰組織浸漬在純化溶液中得到胰島的純化工序，其特征在于，上述消化工序包括將含有消化酶的酶溶液注入上述胰臟的內(nèi)部的酶注入步驟；使上述消化酶活化的消化開始步驟；使上述消化酶失活的消化停止步驟；和將已被破壞的胰組織回收的回收步驟，通過在上述消化開始步驟之前向體系中添加嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑，從而在開始上述消化開始步驟的時刻，使嗜中性粒細胞彈性蛋白酶抑制劑存在于上述胰臟的內(nèi)部，通過使用上述胰島的分離方法及能夠用于該方法的保護液，能夠以高產(chǎn)量得到適合移植的形狀及大小的胰島。
文檔編號C12N5/071GK102985532SQ20118003413
公開日2013年3月20日 申請日期2011年7月13日 優(yōu)先權日2010年7月13日
發(fā)明者種村匡弘, 澤芳樹, 名井陽, 伊藤壽記, 森正樹, 土岐祐一郎 申請人:株式會社大塚制藥工場