專利名稱：直接檢測(cè)和鑒別稀釋于富集肉湯中的生物樣品中的微生物的方法
直接檢測(cè)和鑒別稀釋于富集肉湯中的生物樣品中的微生物的方法本發(fā)明大體上涉及分析領(lǐng)域，例如生物分析領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及在密閉容器內(nèi)直接且實(shí)時(shí)地檢測(cè)稀釋或者懸浮于富集肉湯的樣品中的微生物的方法。微生物分析需要獲得結(jié)果所花費(fèi)的時(shí)間必須盡可能短的精確技術(shù)。在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，預(yù)見(jiàn)和診斷感染風(fēng)險(xiǎn)是必要的:診斷越快越精確，則對(duì)患者的處理會(huì)越有效率，并且傳播的風(fēng)險(xiǎn)會(huì)更小。對(duì)于動(dòng)物健康，方法也是類似的。在農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域，問(wèn)題是相同的。但是，其重點(diǎn)在于以下幾方面:.存在于原材料、中間產(chǎn)物和上市成品中的病原微生物及其毒素，.在從原料到成品的生產(chǎn)過(guò)程中沿整條生產(chǎn)鏈用作質(zhì)量指標(biāo)的非病原微生物，以及 有技術(shù)意義的細(xì)菌,例如酶。 對(duì)可疑污染物的快速精確的檢測(cè)使得能夠?qū)ζ溥M(jìn)行監(jiān)控，從而能夠采取正確的措施。從技術(shù)層面講，微生物分析可能進(jìn)行一個(gè)或者多個(gè)預(yù)富集和/或富集階段、一個(gè)或者多個(gè)檢測(cè)階段以及一個(gè)或者多個(gè)微生物計(jì)數(shù)階段。對(duì)于具體應(yīng)用例如農(nóng)產(chǎn)品微生物監(jiān)控而言，可能還需要確認(rèn)階段，以滿足該領(lǐng)域執(zhí)行的標(biāo)準(zhǔn)。目前，還沒(méi)有不使用富集步驟而在大量初始樣品中檢測(cè)目標(biāo)微生物的方法。預(yù)富集和/或富集階段使用選擇性或者非選擇性培養(yǎng)基，目的是促進(jìn)生物樣品或者環(huán)境樣品中的目標(biāo)微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)限制非目標(biāo)菌群的生長(zhǎng)。培養(yǎng)基通常用于無(wú)菌塑料袋型容器中，它們?cè)谄渲信c食品樣品或者環(huán)境樣品接觸，以重懸浮和重富集尋找到的微生物。這一階段是必需的，目的是滿足下述要求:揭示非常多變且可能非常大量的樣品(例如稀釋于225-3375毫升(mL)培養(yǎng)基中的25克(g)至375g樣品)中的至少一種目標(biāo)微生物的可能的初始存在。該富集步驟結(jié)束時(shí)，取一份(5微升(μ I)至5mL)樣品進(jìn)行檢測(cè)目標(biāo)微生物的步驟。在這份樣品中必須具有足量的目標(biāo)微生物，以實(shí)現(xiàn)對(duì)其的系統(tǒng)檢測(cè)。過(guò)去，檢測(cè)階段的基礎(chǔ)是在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)微生物，以證明所研究微生物的代謝特征。通常使用特定的酶底物。這些酶底物一般包含兩個(gè)部分:對(duì)待揭示的酶活性具有特異性的第一部分(也稱為目標(biāo)部分)和作為標(biāo)記物的第二部分(也稱為標(biāo)記物部分)，所述第二部分通常由生色團(tuán)或者熒光團(tuán)構(gòu)成。通過(guò)根據(jù)是否有反應(yīng)選擇這些底物，可表征微生物的性質(zhì)或者區(qū)分開(kāi)不同組的微生物。因此，顏色或者熒光的出現(xiàn)或者消失會(huì)指示微生物的屬或者類型。在這一點(diǎn)上，生色培養(yǎng)基的使用使得能夠同時(shí)檢測(cè)和鑒別所研究的病菌。它簡(jiǎn)化了方法，并且大幅地減少了獲得結(jié)果所花費(fèi)的時(shí)間。例如，我們舉例申請(qǐng)人的ChromlD 培養(yǎng)基。這些生色培養(yǎng)基的基礎(chǔ)是檢測(cè)所研究細(xì)菌的特定代謝特征，例如對(duì)大腸桿菌(Escherichia coli)的β _葡糖醒酸糖苷酶的酶活性。免疫測(cè)定構(gòu)成用于檢測(cè)試驗(yàn)的另一種技術(shù)。它們利用所研究微生物的免疫原性特征。非窮舉地，可以舉例競(jìng)爭(zhēng)性或夾心型ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)。最后，還采用基于所研究微生物的基因組特征的分子生物學(xué)技術(shù)來(lái)檢測(cè)和鑒別目標(biāo)微生物。例如，可以舉例常規(guī)的擴(kuò)增技術(shù)，例如PCR(聚合酶鏈反應(yīng))和NASBA(基于核酸序列的擴(kuò)增)，其可以與本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用。但是，所有這些技術(shù)的使用均需要在預(yù)富集/富集階段結(jié)束時(shí)打開(kāi)袋子，以回收一份勻漿并進(jìn)行檢測(cè)步驟。在農(nóng)產(chǎn)品領(lǐng)域，確認(rèn)階段自身與微生物分析更加特別相關(guān)。事實(shí)上，在上述方法的結(jié)果是陽(yáng)性時(shí)，必須確認(rèn)所研究病原體的存在。這使得互補(bǔ)試驗(yàn)和使用不同于在首次分析過(guò)程中使用的檢測(cè)原理成為必需。隨意使用上述技術(shù)以進(jìn)行確認(rèn)。因此，完全地和精確地鑒別樣品中的微生物必需一系列的幾個(gè)步驟:富集、檢測(cè)和確認(rèn)。常規(guī)使用的測(cè)試的標(biāo)準(zhǔn)化已使檢測(cè)方法的自動(dòng)化稱為可能，但是其實(shí)施仍需很長(zhǎng)時(shí)間。事實(shí)上，現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)是，這些步驟是連續(xù)進(jìn)行的，且需要大量耗時(shí)的操作，因此影響到得到結(jié)果所需的時(shí)間。再者，上述技術(shù)需要將富集袋打開(kāi)一次或者多次以采集多份樣品。在篩選(尤其是在農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)中)期間的陰性樣品數(shù)越多，則越不利。因此，考慮對(duì)操作者有益的是無(wú)需再次打開(kāi)容器來(lái)查明研究樣品的陽(yáng)性/陰性結(jié)果。

針對(duì)以上考慮到的與現(xiàn)有技術(shù)狀況相關(guān)的技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的一個(gè)基本目的是提供一種簡(jiǎn)單的檢測(cè)、鑒別和確認(rèn)存在于樣品特別是農(nóng)產(chǎn)品樣品中的微生物的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)、鑒別和確認(rèn)微生物的方法，該方法限制了對(duì)容器中所含的樣品的處理，由此限制了對(duì)處理樣品的工作人員和樣品自身兩方面的污染風(fēng)險(xiǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種檢測(cè)和鑒別微生物的方法，該方法減少了分析樣品所必需的時(shí)間。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種在整個(gè)富集過(guò)程中檢測(cè)、鑒別和確認(rèn)全部體積樣品中的微生物的方法，該方法明顯地提高了測(cè)量靈敏度甚至其特異性。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種可以大大地提高樣品分析速率的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使得能夠多次檢測(cè)(mult1-detection)的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目的是通過(guò)大幅地減少樣品處理步驟來(lái)改善分析的可追溯性。本發(fā)明特別實(shí)現(xiàn)了這些目的，本發(fā)明首先涉及一種檢測(cè)放置于密閉容器內(nèi)的樣品中存在的至少一種微生物的方法，所述方法基本包括以下步驟:a)在所述容器內(nèi)，使所述樣品與至少一種培養(yǎng)基和能夠捕獲待檢測(cè)的所述微生物的支持物接觸，b)封閉所述容器，c)將所述容器放置于能夠允許所述微生物生長(zhǎng)的條件下，d)在所述密閉容器內(nèi)，使用檢測(cè)工具檢測(cè)固定于捕獲支持物上的所述微生物的存在。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，在步驟a)的過(guò)程中，使能夠檢測(cè)所述微生物的存在的揭不系統(tǒng)在所述各器內(nèi)接觸。揭示系統(tǒng)被理解為任何能夠與所述微生物或者所述微生物的結(jié)合配偶體偶聯(lián)的分子，由于所述微生物或其結(jié)合配偶體的轉(zhuǎn)導(dǎo)性質(zhì)(具體為熒光、顏色變化(colouring)、放射性)，使得能夠揭示所述微生物的存在。
根據(jù)另一具體實(shí)施方案，本發(fā)明的方法包括中間步驟c’)，所述中間步驟c’)為:將全部或者部分由所述樣品、所述培養(yǎng)基、所述能夠捕獲待檢測(cè)的所述微生物的支持物以及可能的所述揭示系統(tǒng)構(gòu)成的混合物從所述容器(在這種情況下被稱為主容器)轉(zhuǎn)移到至少一個(gè)第二容器(被稱為輔容器)中，其中可通過(guò)將營(yíng)養(yǎng)元素和特別的選擇劑提前加入所述輔容器中來(lái)進(jìn)行二次富集。這樣的二次富集增加了所述目標(biāo)微生物相對(duì)于非目標(biāo)微生物的數(shù)量，改善了特異性。有利地，將所述微生物的至少一種特異性或者非特異性結(jié)合配偶體固定于所述捕獲支持物上。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述特異性結(jié)合配偶體選自:抗體、Fab片段、Fab’片段、重組或非重組的噬菌體蛋白和噬菌體，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意其它配體。有利地，所述檢測(cè)工具選自:電檢測(cè)工具特別是電化學(xué)檢測(cè)工具、光學(xué)檢測(cè)工具、聲學(xué)檢測(cè)工具、熱檢測(cè)工具、機(jī)械檢測(cè)工具和磁檢測(cè)工具。所述捕獲支持物可以 是常規(guī)的支持物。具體而言，我們列舉顆粒式支持物(可能有磁性)或者整體式支持物。它也可以僅僅是惰性支持物，例如塑料板或玻璃纖維板。然后將這樣的捕獲支持物與所述檢測(cè)工具連接。有利地，所述捕獲支持物可以被(可能是特異性的)結(jié)合配偶體敏化?；蛘?所述捕獲支持物可以與所述檢測(cè)工具是一體的。例如，當(dāng)所述捕獲支持物由電化學(xué)生物傳感器或光纖構(gòu)成時(shí)，情況就是如此。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，完全能夠想到結(jié)合檢測(cè)工具以進(jìn)行檢測(cè)并同時(shí)或者隨后進(jìn)行確認(rèn)。例如，可利用電化學(xué)生物傳感器進(jìn)行對(duì)目標(biāo)微生物的檢測(cè)。如果通過(guò)特異性結(jié)合配偶體固定所述目標(biāo)微生物，則在這種情況下，所述檢測(cè)步驟構(gòu)成鑒別步驟。由光學(xué)檢測(cè)裝置對(duì)特異性地固定于生物傳感器上的分析區(qū)域的微生物進(jìn)行光學(xué)分析，可實(shí)現(xiàn)對(duì)待確認(rèn)微生物的鑒別。若光學(xué)檢測(cè)裝置是拉曼分光儀(一種通過(guò)與對(duì)應(yīng)于不同目標(biāo)微生物的參考譜的數(shù)據(jù)庫(kù)比較來(lái)對(duì)拉曼光譜進(jìn)行的分析)，則可確認(rèn)對(duì)所述微生物的鑒別。根據(jù)另一具體實(shí)施 方案，可用相同技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)和確認(rèn)。因此，如果檢測(cè)工具是光學(xué)工具例如內(nèi)熒光測(cè)量工具，則特別有利的是經(jīng)由內(nèi)熒光的出現(xiàn)進(jìn)行對(duì)目標(biāo)微生物的檢測(cè)。在這種情況下，反應(yīng)為是(存在熒光)或者否(不存在熒光)。如果有熒光，則對(duì)與對(duì)應(yīng)于不同目標(biāo)微生物的參考譜的數(shù)據(jù)庫(kù)相比較的熒光信號(hào)進(jìn)行的光譜分析使得所述微生物能夠被鑒別，由此可以實(shí)現(xiàn)對(duì)待確認(rèn)的所述微生物的存在的檢測(cè)。優(yōu)選地，實(shí)時(shí)進(jìn)行對(duì)所述微生物的檢測(cè)?；蛘?，可以在所述微生物的生長(zhǎng)步驟結(jié)束時(shí)或者之后完成對(duì)所述微生物的檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)具體實(shí)施方案，所述容器為均化袋(homogenisationbag)。同樣也可使用硬質(zhì)容器例如燒瓶、瓶子或者藥丸盒。根據(jù)本發(fā)明方法的另一具體實(shí)施方案，所述檢測(cè)工具與數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)連接。有利地，所述檢測(cè)工具與所述數(shù)據(jù)分析裝置之間的連接為有線連接或者無(wú)線連接。本發(fā)明還涉及用于檢測(cè)放置于密閉容器內(nèi)的樣品中存在的至少一種微生物的電化學(xué)生物傳感器。所述生物傳感器包含支持物，所述支持物包含以下元件:.至少一個(gè)檢測(cè)電極，其涂覆有至少一種電活性聚合物，在其一端上固定有至少一種單鏈或者雙鏈寡核苷酸，所述寡核苷酸的另一端與待檢測(cè)的微生物的至少一種特異性或者非特異性結(jié)合配偶體連接；.至少一個(gè)對(duì)電極。有利地，所述電活性聚合物選自:聚吡咯、聚乙炔、聚吖嗪(polyazine)、聚對(duì)亞苯(poly (p-phenylene))、聚(對(duì)苯亞苯基_1，2_亞乙烯基)(poly (p-phenylene vinylene))、聚芘、聚噻吩、聚呋 喃、聚硒酚、聚噠嗪、聚咔唑和聚苯胺。根據(jù)一具體實(shí)施方案，所述電活性聚合物包括至少一種電化學(xué)介質(zhì)。這樣的電化學(xué)介質(zhì)選自:二茂鐵、醌和它們的衍生物，或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意其他介質(zhì)。根據(jù)一備選實(shí)施方案，所述電化學(xué)介質(zhì)在培養(yǎng)基中為游離形式。這樣的介質(zhì)可以是例如鐵氰化物/亞鐵氰化物對(duì)[Fe(CN)6]3-/4_、銥氯化物對(duì)[IrCl6]3-/4_或者六胺合釕(ruthenium hexamine) [Ru (NH3) 6]3+/2+。寡核苷酸和微生物的結(jié)合配偶體之間的鍵優(yōu)選由至少一個(gè)生物素-鏈霉親和素或生物素-親和素結(jié)合對(duì)形成。如果寡核苷酸為單鏈，則將生物素固定于所述核苷酸的3’端上，5’端使所述核苷酸能夠與電活性聚合物(特別是通過(guò)共價(jià)鍵)結(jié)合。通過(guò)使用也被生物素化的結(jié)合配偶體，則容易通過(guò)鏈霉親和素或親和素分子將該結(jié)合配偶體連接至寡核苷酸的3’端。如果寡核苷酸為雙鏈，則經(jīng)由第一條鏈的5’端將該鏈(尤其是通過(guò)共價(jià)鍵)固定至電活性聚合物上。第二條鏈自身在其5’端被生物素化，這使得也被生物素化的結(jié)合配偶體經(jīng)由鏈霉親和素或親和素分子而被固定。有利地，所述結(jié)合配偶體選自:抗體、Fab片段、Fab’片段、重組或者非重組的噬菌體蛋白和噬菌體。通過(guò)下文的詳細(xì)描述和相關(guān)附圖會(huì)更好地理解本發(fā)明的目的和優(yōu)點(diǎn)，在所述附圖中:-

圖1示出與電化學(xué)生物傳感器結(jié)合的預(yù)富集和/或富集袋。-圖2示出電化學(xué)生物傳感器的主視圖。-圖3A示出不存在微生物的電化學(xué)傳感器的表面。-圖3B示出存在微生物的電化學(xué)傳感器的表面。-圖4為用于分析具有電化學(xué)生物傳感器的預(yù)富集/富集袋的系統(tǒng)的示意圖。-圖5為在檢測(cè)食品樣品中的大腸桿菌0157:H7的過(guò)程中獲得的阻抗譜測(cè)量結(jié)果的圖。-圖6為在檢測(cè)食物樣品中的無(wú)害李斯特菌(Listeriainnocua)的過(guò)程中獲得的阻抗譜測(cè)量結(jié)果的圖。-圖7為根據(jù)第一實(shí)施方案，通過(guò)在具有敏化的捕獲支持物的預(yù)富集/富集袋中進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)的分析系統(tǒng)的示意圖。-圖8為如圖7所示的分析系統(tǒng)的示意圖，其中袋的位置使得敏化的捕獲支持物能夠被讀解。-圖9為敏化的捕獲支持物的示意圖。-圖10為圖8所示的敏化的捕獲支持物的示意圖，其在分析之后給出陽(yáng)性結(jié)果。-圖11為根據(jù)第二實(shí)施方案，通過(guò)在具有敏化的捕獲支持物的預(yù)富集/富集袋中進(jìn)行光學(xué)檢測(cè)的分析系統(tǒng)的示意圖。根據(jù)本發(fā)明的第一實(shí)施方案，微生物檢測(cè)或鑒別的方法在于采用通常被稱為Stomacher 袋的無(wú)菌塑料均化袋。這樣的袋在圖1中被標(biāo)注為附圖標(biāo)記10。該袋10由兩個(gè)大致為矩形的塑料片12和14構(gòu)成，這兩個(gè)塑料片12和14通過(guò)其3條邊彼此連接，從而界定出接收培養(yǎng)基和待分析樣品的內(nèi)部空間。其附件包括通過(guò)一條邊與片12和14連接的大致為矩形的過(guò)濾器16，將內(nèi)部空間分為兩部分。該袋最后含有生物傳感器18。該生物傳感器為電化學(xué)生物傳感器，其細(xì)節(jié)示于圖2。該生物傳感器18被夾在片12和14之間，從而與檢測(cè)區(qū)域相對(duì)應(yīng)的一個(gè)部分181存在于袋10的內(nèi)部空間中，而與連接區(qū)域相對(duì)應(yīng)的部分在該袋之外，以使芯片連接到數(shù)據(jù)分析裝置。這在下文進(jìn)行闡釋。圖2詳細(xì)地示出了電化學(xué)生物傳感器18。如上文所闡釋，該生物傳感器18由分析區(qū)域181和連接區(qū)域182構(gòu)成。分析區(qū)域包括八個(gè)工作電極20，它們圍繞被稱為對(duì)電極22的中央電極排列。另外，分析區(qū)域包含參比電極24，其為圍繞對(duì)電極22放置的開(kāi)口圓環(huán)的形式。所有這些電極均通過(guò)導(dǎo)軌(conductor track) 28獨(dú)立地連接于十個(gè)連接終端26。該連接終端由與工作電極相同的材料制成。該材料優(yōu)選為金。但是，本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意其它導(dǎo)電材料均可使用，例如碳、鉬或金剛石。構(gòu)成電極支持物的材料為聚合物材料，例如聚酰亞胺。但是，可以想到使用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的具有等同性質(zhì)的任意其他材料。應(yīng)注意，圖2中給出的電極結(jié)構(gòu)僅僅是眾多結(jié)構(gòu)中的一種，并且絕非要限制本專利申請(qǐng)的保護(hù)范圍。圖3A和3B分別示出在不存在或存在微生物的情況下的顯微水平的工作電極的橫截面。在工作電極處，可以看到三個(gè)重疊的層。這些層中的第一層30是構(gòu)成生物傳感器支持物的聚合物層。中間層32是導(dǎo)電材料(通常為金)層。最后，層34是電活性共軛聚合物(conjugated polymer)層。這樣的聚合物例如是聚卩比咯。這樣的聚合物的導(dǎo)電性和電活性是公知的。還已知，當(dāng)某些吡咯環(huán)的3位或4位被官能團(tuán)取代時(shí)，聚吡咯保留其導(dǎo)電性及其電活性。攜帶這類官能團(tuán)的聚合物描述于W0-Al-95/29199、Garnier等人(SyntheticMetals, 100:89-94，1 999)、Ho-Hoang 等人(Synthetic Metals, 62:277-280，1994)、Ho-Hoang 等人(J.Mater.Chem.，6 (7)，1107-1112，1996)和 Korr1-Youssoufi 等人(Materials Science and Engineering, Cl 5, 265-268, 2001)中。因此，不同的分子可被接枝到聚吡咯單體所攜帶的官能團(tuán)上。W0-A1-95/29199因此描述了通過(guò)以大于或等于0.8V/ECS的電勢(shì)電氧化合成聚吡咯。通過(guò)電化學(xué)氧化合成聚吡咯使得在電極表面——更精確地
說(shuō)在導(dǎo)電基板上-形成自支撐膜(self-supported film)形式的電活性膜。這是一種將
寡核苷酸間接地固定于聚吡咯中的方法。將吡咯核的3位被官能團(tuán)取代的吡咯單體稀釋于非取代單體的溶液中，這會(huì)在它們的電引發(fā)共聚(electrocopolymerisation)過(guò)程中通過(guò)將官能單元納入鏈中來(lái)固定官能團(tuán)。在第二步中，將抗-配體例如寡核苷酸、多核苷酸或肽化學(xué)偶聯(lián)至前體聚合物的官能團(tuán)上。由此獲得的聚合物保留其導(dǎo)電性和電活性。因此，這些聚合物可用于通過(guò)測(cè)量電勢(shì)差異或電流變化來(lái)檢測(cè)與接枝于聚合物上的抗-配體特異性相互作用的分析物。W0-A1-00/77523還描述了抗-配體例如寡核苷酸在攜帶官能團(tuán)的前體聚合物上的化學(xué)偶聯(lián)。這還可以是一種通過(guò)電引發(fā)共聚將寡核苷酸直接固定于聚吡咯中的方法。將吡咯核的3位被寡核苷酸取代的吡咯單體稀釋于非取代單體的溶液中，這會(huì)在它們的電引發(fā)共聚過(guò)程中通過(guò)將官能單元納入鏈中來(lái)直接固定寡核苷酸。在該電活性聚合物層上，經(jīng)由雙鏈核酸36的一條鏈的5’端將該雙鏈核酸36與在其5’端攜帶有生物素分子38的互補(bǔ)鏈接枝，從而能夠經(jīng)由鏈霉親和素分子44與還結(jié)合有生物素42的特異性結(jié)合配偶體40成鍵。圖3A和3B中示出的特異性結(jié)合配偶體40為抗體。它可以是一種或者多種單克隆抗體或多克隆抗體。它還可以是抗體片段例如Fab片段或者Fab’ 2片段，以及通過(guò)基因修飾或重組獲得的對(duì)特定微生物具有特異性的任意抗體?；蛘撸鎏禺愋越Y(jié)合配偶體可以是噬菌體或者重組噬菌體蛋白，其與目標(biāo)微生物特異性結(jié)合。這樣的蛋白及其捕獲細(xì)菌的用途描述于專利EP-B-1356080等中。應(yīng)注意到，圖3A和3B中所示結(jié)構(gòu)僅僅是眾多結(jié)構(gòu)中的一個(gè)實(shí)例，絕不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。事實(shí)上，作為變化方案，可以想到在不使用雙鏈核酸的情況下將抗-配體分子直接地固定在電極上。為了進(jìn)行分析，使與均化袋連接的電化學(xué)生物傳感器與分散的樣品、培養(yǎng)基和電化學(xué)介質(zhì)例如鐵氰化物-亞鐵氰化物對(duì)接觸。在不存在微生物時(shí)，在電活性共軛聚合物和存在于反應(yīng)介質(zhì)中的所述氧化還原系統(tǒng)之間發(fā)生電子交換。這示于圖3A。電子交換被轉(zhuǎn)化成電流，并使用恒電位儀通過(guò)電化學(xué)阻抗譜法(electrochemical spectroscopy)測(cè)量,如下文所闡釋。當(dāng)樣品含有微生物44時(shí)，它們被抗-配體分子40捕獲。電極附近微生物的存在引起位阻，所述位阻破壞并削弱經(jīng)電活性共軛聚合物修飾的電極和存在于反應(yīng)介質(zhì)中的所述氧化還原系統(tǒng)之間的電子流。隨后通過(guò)阻抗測(cè)量來(lái)測(cè)量該修飾，并通過(guò)荷載轉(zhuǎn)移電阻(loadtransfer resistance,在細(xì)菌被捕獲(陽(yáng)性結(jié)果)時(shí)，電阻值增加的電阻)對(duì)其進(jìn)行表征。第一實(shí)施方案的分析結(jié)果測(cè)量系統(tǒng)圖示于圖`4中。如該圖所示，袋10通過(guò)其生物傳感器18與恒電位儀50連接。該連接經(jīng)由連接器52實(shí)現(xiàn)，連接器52與生物傳感器18的連接區(qū)域182連接。由與恒電位儀50連接的電纜54延伸連接器52。恒電位儀自身與能夠記錄和分析阻抗測(cè)量數(shù)據(jù)的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)56連接。為了檢測(cè)微生物，優(yōu)選地，均化袋10的孵育時(shí)長(zhǎng)為使微生物生長(zhǎng)所需要的盡可能長(zhǎng)的時(shí)長(zhǎng)?？梢栽?5-45°C溫度下的培養(yǎng)箱中以常規(guī)方式進(jìn)行該孵育。取決于存在于樣品中的微生物的初始量以及待檢測(cè)微生物的類型，孵育時(shí)間可以為3-72小時(shí)。根據(jù)第一實(shí)施方案，可以在結(jié)束時(shí)進(jìn)行阻抗測(cè)量。事實(shí)上，將均化袋孵育被認(rèn)為是微生物生長(zhǎng)所必需和足夠的一段時(shí)間，然后將其從培養(yǎng)箱中取出并與上文描述的阻抗測(cè)量系統(tǒng)連接。然后進(jìn)行阻抗測(cè)量，并將結(jié)果與參照阻抗值比較。這樣的阻抗測(cè)量是可行的，前提是一個(gè)或者多個(gè)工作電極20涂覆有電活性共軛聚合物和/或待檢測(cè)微生物的非特異性抗-配體分子。在這一個(gè)或者多個(gè)電極的阻抗測(cè)量結(jié)果形成參照阻抗值。只要檢測(cè)電極(其上直接或者間接地固定有目標(biāo)微生物的抗-配體分子的電極)上的阻抗值和參照值之間的差異大于閾值，則對(duì)微生物的檢測(cè)是有效的。第二實(shí)施方案為點(diǎn)式方案，即在孵育期間通過(guò)進(jìn)行點(diǎn)式阻抗測(cè)量(spotimpedancemeasurement)。在這種情況下,將均化袋從培養(yǎng)箱中取出，并與阻抗測(cè)量系統(tǒng)連接,連接時(shí)間為測(cè)量所需時(shí)間，然后再孵育。兩次測(cè)量之間的間隔可以是30秒至2分鐘。該第二實(shí)施方案相對(duì)于第一實(shí)施方案的主要優(yōu)點(diǎn)在于，其能夠在較短的孵育時(shí)間之后檢測(cè)微生物的存在。最后，在作為優(yōu)選實(shí)施方案的第三實(shí)施方案中，在培養(yǎng)箱內(nèi)具有用于連接生物傳感器與阻抗測(cè)量系統(tǒng)的工具。所述工具可以是有線或無(wú)線連接系統(tǒng)。這樣的實(shí)施方案特別有利，原因在于它使得能夠以常規(guī)間隔在均化袋內(nèi)進(jìn)行測(cè)量，而無(wú)需對(duì)均化袋進(jìn)行處理。并且，以常規(guī)間隔進(jìn)行阻抗測(cè)量使得能夠?qū)崟r(shí)進(jìn)行微生物檢測(cè)。當(dāng)與在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)通知技術(shù)人員的計(jì)算機(jī)系統(tǒng)連接時(shí)，技術(shù)人員不再被隨時(shí)間連續(xù)進(jìn)行測(cè)量的工作流程所約束。僅當(dāng)在袋中檢測(cè)到微生物時(shí)才要求工作人員的介入。有線連接工具包括任何能夠?qū)蓚€(gè)電子裝置相互連接從而能夠進(jìn)行數(shù)據(jù)輸送的工具。具體而言，有線連接工具可以是串聯(lián)系統(tǒng)(RS 485,RS 232規(guī)格)、USB連接系統(tǒng)(通用串行總線)、網(wǎng)絡(luò)連接系統(tǒng)(Ethernet)、并聯(lián)系統(tǒng)(GPIB)或任意其他等同工具。無(wú)線連接工具為無(wú)線電波發(fā)射器-接收器。例如，它可以是W1-Fi (802.1 Ib規(guī)格)、藍(lán)牙(洲2.15規(guī)格)或ZigBee (802.15.4規(guī)格)系統(tǒng)。根據(jù)一個(gè)備選方案，數(shù)據(jù)采集工具可以是RFID(射頻識(shí)別)讀數(shù)器、Labjack卡或者本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的任意其他工具。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)備選方案，可經(jīng)由光學(xué)檢測(cè)工具進(jìn)行檢測(cè)。該檢測(cè)工具可以獨(dú)立于捕獲支持物。例如，對(duì)于光學(xué)傳感器例如照相機(jī)，情況就是如此。或者，光學(xué)檢測(cè)工具和捕獲支持物可以是一體的。例如，對(duì)于光纖(其末端用作捕獲支持物)，情況就是如此。這樣的備選方案示于圖7。如前所述，將密閉均化袋10與食品樣品60共同孵育，此處的食品樣品60由肉餡樣品構(gòu)成。將該食品樣品60倒入補(bǔ)充有揭示系統(tǒng)的培養(yǎng)基62中。將以任意合適的方式在袋中固定就位的敏化的捕獲支持物64同樣放入均化袋10內(nèi)，并浸潰在培養(yǎng)基62中。將敏化的捕獲支持物64用至少一種對(duì)待檢測(cè)的目標(biāo)微生物具有特異性的結(jié)合配偶體官能化。捕獲支持 物可以由任意能夠固定特異性結(jié)合配偶體的支持物構(gòu)成，并為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。作為非限制性實(shí)例，合適的捕獲支持物可由經(jīng)輻照的聚苯乙烯制成，例如Nunc/Thermo Scientific公司的市售產(chǎn)品(貨號(hào)472230)。這樣的捕獲支持物圖示于圖9，附圖標(biāo)記為64。有利地，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，下部可被分為兩部分。具有附圖標(biāo)記641的區(qū)域可用結(jié)合配偶體(多克隆抗體、單克隆抗體、Fab’片段或Fab’ 2片段、噬菌體蛋白)的溶液敏化，而上部642沒(méi)有任何結(jié)合配偶體，因此用作陰性對(duì)照。將捕獲支持物用至少一種特異性結(jié)合配偶體例如抗體、適體、噬菌體、重組噬菌體蛋白或者能夠特異性捕獲目標(biāo)細(xì)菌的任意等價(jià)工具官能化。在培養(yǎng)基內(nèi)所含的揭示系統(tǒng)的作用下，這些目標(biāo)細(xì)菌可隨其生長(zhǎng)同時(shí)發(fā)生顏色改變。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施例，所述揭示系統(tǒng)基于微生物對(duì)TTC的還原。在生長(zhǎng)的同時(shí)，TTC(非還原形式下為無(wú)色)由所述微生物內(nèi)化，隨后被該微生物還原成為三苯基-甲月朁
(紅色)，由此使所述微生物變成紅色，并在支持物上揭示所述微生物。通過(guò)對(duì)敏化的捕獲支持物的光學(xué)讀解，在孵育期間自動(dòng)地或者非自動(dòng)地進(jìn)行對(duì)食品樣品中的微生物的直接的實(shí)時(shí)檢測(cè)方法。孵育可以在25-44°C的溫度下進(jìn)行6-48小時(shí)。此外，一旦一定量的被染色微生物(在陽(yáng)性樣品的情況下)被有效捕獲，則通過(guò)支持物上出現(xiàn)顏色變紅而發(fā)生支持物光學(xué)性質(zhì)的改變(即生物信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo))。隨后可經(jīng)肉眼檢測(cè)或者通過(guò)使用讀解機(jī)器例如照相機(jī)測(cè)量捕獲支持物的這一顏色改變。給出陽(yáng)性結(jié)果的分析之后的捕獲支持物圖示于圖10。如所見(jiàn)，區(qū)域641因?yàn)槟繕?biāo)微生物固定在特異性結(jié)合配偶體上而顯現(xiàn)出顏色變化。作為陰性對(duì)照的區(qū)域642保持捕獲支持物的最初顏色。為方便讀解，優(yōu)選敏化的捕獲支持物不再與培養(yǎng)基接觸。為此，可以想到例如傾斜均化袋10,如圖8所清楚示出。如上文所闡釋,可在結(jié)束時(shí)間斷地(on a spot basis)進(jìn)行讀解或者實(shí)時(shí)地進(jìn)行讀解。根據(jù)本發(fā)明方法的另一備選方案，捕獲支持物由敏化顆粒(即攜帶有待測(cè)微生物的特異性或非特異性結(jié)合配偶體)構(gòu)成。隨后，優(yōu)選地，通過(guò)在孵育期間經(jīng)由與敏化顆粒結(jié)合的目標(biāo)微生物而出現(xiàn)敏化顆粒的實(shí)時(shí)凝集而證實(shí)所述檢測(cè)。這樣的實(shí)施方案描述于文獻(xiàn)W0-A-2009/122069 中。根據(jù)一個(gè)具體實(shí)施方案，敏化顆?？梢允谴判灶w粒。該實(shí)施方案在于，經(jīng)由敏化磁性顆粒的凝集，在富集階段直接檢測(cè)食品樣品中目標(biāo)微生物(即大腸桿菌0157:H7)的存在。在孵育期間通過(guò)將用特異性結(jié)合配偶體(即抗大腸桿菌0157:H7重組噬菌體蛋白)敏化的磁性顆粒浸潰于含有稀釋于培養(yǎng)基中的食品樣品的密閉容器內(nèi)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。在這一備選方案中，可能有利的是，在主容器(均化袋)內(nèi)使用管式容器，從而改善對(duì)敏化顆粒的凝集的驗(yàn)證。如圖11所示，除了培養(yǎng)基62和樣品60外，均化袋10還含有試管66。該試管66經(jīng)由導(dǎo)線管68與均化袋10內(nèi)所含的培養(yǎng)基62液體連通。隨后，可將一部分包含食品樣品的培養(yǎng)基62轉(zhuǎn)移到試管66內(nèi)，在其中進(jìn)行檢測(cè)?；谕耆珰怏w定律(PV=nRT)，可顯著地通過(guò)溫度改變實(shí)現(xiàn)這樣的轉(zhuǎn)移。這樣的方法描述于文獻(xiàn)W0-A-2004/092401 中。在使用磁性顆粒的情況下，使用磁性讀數(shù)器，在孵育期結(jié)束時(shí)在含有反應(yīng)介質(zhì)的輔容器內(nèi)進(jìn)行讀解。可通過(guò)先使用將凝集聚集在讀解區(qū)域中心的磁場(chǎng)(經(jīng)由磁鐵)來(lái)放大磁信號(hào)。當(dāng)在已捕獲微生物的磁性顆粒集合在一起后，這一現(xiàn)象引發(fā)凝集物的形成時(shí)，磁場(chǎng)的應(yīng)用還可以提高檢測(cè)限。事實(shí)上，如果微生物的濃度不足以引發(fā)被動(dòng)凝集，則磁性顆粒一其中有一些在先前已捕獲了微生物——的集合在一起會(huì)強(qiáng)制凝集。另外，重復(fù)這一順序(即磁化和重懸浮)還可以增強(qiáng)捕獲和凝集形成現(xiàn)象，由此增強(qiáng)分析敏感性。下文給出的實(shí)施例旨在提供本發(fā)明方法的不同實(shí)施方案以及所獲得的結(jié)果。它們絕非以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例實(shí)施例1:電化學(xué)生物傳感器的分析電極的制備試劑:高氯酸鋰(LiClO4)、氯化鈉(NaCl)、氫氧化鈉(NaOH)、六氰合鐵酸鉀(III)(K3Fe (CN)6)、六氰合鐵酸鉀(II)三水合物(K4Fe (CN) 6;3H20)、Tween 20、磷酸鹽緩沖液(BPS)、牛血清白蛋白(BSA)、三(羥甲基)氨基甲烷(TRIS)、馬來(lái)酸、鮭魚(yú)DNA和50XDenhardt,購(gòu)自 Sigma-Aldrich。洗滌緩沖液pH 7.2，為 PBS 0.01M、NaCl 0.5M 和 0.05%Tween。雜交緩沖液為PBS 0.01M、NaCl 0.5M、2X Denhardt 和 10 μ g/mL 的鮭魚(yú) DNA。
結(jié)合配偶體的接枝緩沖液為T(mén)RIS-MALEATE BSA緩沖液，pH 6.2，包含24.23g/LTRIS、23.2g/L 馬來(lái)酸、6g/L 氫氧化鈉和 5g/L BSA。3-(2-羥乙基)吡咯或PyOH和3_(酞酰亞胺乙酸酯)吡咯(3-(phthalimideethanoate)pyrrole)或者 PyNHP 由 EZUS Lyon 提供。含有20個(gè)核苷酸并在其5’端攜帶氨基的合成寡核苷酸通過(guò)取代NHP基團(tuán)被共價(jià)固定。官能單體為:Pyr-5'TTTTTTTTTTGAATCCTCAGTTTTTCAACG3’?；パa(bǔ)核苷酸在5’端攜帶有生物素基團(tuán)。其序列為:5’ CGTTGAAAAACTGAGGATTC3’。生物傳感器和電化學(xué)檢測(cè)設(shè)備:使 用Sciences Instruments的計(jì)算機(jī)控制的BioLogic恒電位儀進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)測(cè)量。所用傳感器來(lái)源于印刷電路板(PCB)技術(shù)。電極上的金沉積是通過(guò)從金基浴(gold-based bath)中電解的電沉積。電極包含環(huán)氧樹(shù)脂、銅、鎳和金多層。電極的制備:為了洗滌電極，在超聲浴中將傳感器的分析區(qū)域浸潰于1:1蒸餾水/乙醇溶液中，
持續(xù)一分鐘。洗滌之后，將傳感器清潔并進(jìn)行電化學(xué)活化。為此，將一滴(30μ 蒸餾水中的
0.2Μ NaOH沉積在傳感器的分析區(qū)域上，從而將全部電極潤(rùn)濕。將傳感器連接至恒電位儀，并通過(guò)計(jì)時(shí)電流法產(chǎn)生氧化和還原中的幾輪電勢(shì)跳變。這一步驟的目的是在電極界面形成氧氣泡，從而消除任何有機(jī)和/或者無(wú)機(jī)污染物。然后用蒸餾水清洗傳感器。通過(guò)共聚物電沉積修飾工作電極的表面。所有電極由此被一滴電引發(fā)聚合溶液覆蓋，所述溶液為IOOmM的PyOH和25 μ M的PyODN(1/4000濃度比)和0.5Μ LiCLO40然后，通過(guò)施加通過(guò)計(jì)時(shí)電流法產(chǎn)生的0.8V/金假參照的固定電勢(shì)對(duì)反應(yīng)進(jìn)行電導(dǎo)。一旦強(qiáng)加電荷達(dá)到llmC/cm2，就中斷聚合。在所有工作電極上同時(shí)形成共聚物。然后用蒸餾水沖洗電極。以下步驟為雜交。在IOOnM生物素化的目標(biāo)ODN的存在下，將傳感器用一滴(30 μ L)緩沖溶液覆蓋。在37°C進(jìn)行雜交30分鐘。用PBS緩沖液洗滌，然后在攪拌下將傳感器浸潰于PBS緩沖液中的100 μ g/mL鏈霉親和素溶液中，持續(xù)15分鐘。隨后，通過(guò)使傳感器與I μ g/mL抗-配體分子在TRIS-馬來(lái)酸鹽BSA緩沖液中的溶液相接觸，從而固定抗-配體分子。在以下實(shí)施例中，抗-配體分子是用于檢測(cè)大腸桿菌0157的重組噬菌體蛋白，或是用于檢測(cè)李斯特菌(Listeria spp)的Fab’片段。實(shí)施例2:食品樣品中的大腸桿菌0157:H7的檢測(cè)如上所述，將用對(duì)大腸桿菌0157具有特異性的重組噬菌體蛋白官能化并與均化袋連接的生物傳感器與食品樣品一起孵育。將兩個(gè)含有生物傳感器的袋與陽(yáng)性富集制品(pr印aration) —起孵育。將兩個(gè)含有生物傳感器的袋與陰性富集制品一起孵育，并將兩個(gè)含有生物傳感器的袋與未污染富集制品一起孵育，以測(cè)量食品基質(zhì)的背景噪音。陽(yáng)件富集制品
將25g含有最少(5%)脂肪物質(zhì)的生肉以無(wú)菌方式放入具有過(guò)濾器的Stomacher 袋中，并使其與大腸桿菌0157:H7 ATCC 43888接觸。將該袋在2-8°C放置24小時(shí)，以使菌株受應(yīng)激。隨后將225mL在41.5°C下預(yù)熱24小時(shí)的經(jīng)緩沖的胨水(bioM6rieux ref.42043)和5mM的氧化還原探針[Fe(CN)6]3_/4_加入該樣品中。大腸桿菌0157: H7在5mM氧化還原探針[Fe (CN) 6] 3_/4_存在下的生長(zhǎng)在此前就被證實(shí)。已確認(rèn)，存在該氧化還原探針并不減緩細(xì)菌培養(yǎng)基內(nèi)的生長(zhǎng)。將懸浮液勻化,然后將官能化的捕獲支持物放入Stomacher 袋中。重復(fù)這一方案，以通過(guò)兩個(gè)含有官能化的支持物的袋來(lái)測(cè)試兩個(gè)陽(yáng)性懸浮液。對(duì)兩個(gè)陽(yáng)性懸浮液的培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)，使得能夠評(píng)估在沒(méi)0013￡1忙1- 袋內(nèi)孵育前的大腸桿菌0157:H7 ATCC 43888的平均濃度，其為0.92CFU/g生肉。然后將制品于41.5°C下孵育3小時(shí)。陰性富集 物的制備陰性對(duì)照:將25g來(lái)自同一批次的生肉以無(wú)菌方式放入具有過(guò)濾器的Stomacher 袋中，并使其與蠟樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)ATCC 27522接觸。將該袋在2-8°C放置24小時(shí)，以使菌株受應(yīng)激。隨后將225mL在41.5°C下預(yù)熱24小時(shí)的經(jīng)緩沖的胨水(bioM6rieux ref.42043)和5mM的氧化還原探針[Fe(CN)6]3_/4_加入該樣品中。將懸浮液勻化，然后將官能化的捕獲支持物放入該袋中。重復(fù)這一方案，以通過(guò)兩個(gè)含有官能化的支持物的袋來(lái)測(cè)試兩個(gè)陰性懸浮液。在這兩個(gè)懸浮液中，在stomacher 袋中孵育前的蠟樣芽胞桿菌ATCC27522的污染率被評(píng)估為1.32CFU/g生肉(理論測(cè)量值)。然后將制品于41.5°C下孵育3小時(shí)。對(duì)由基質(zhì)產(chǎn)生的背景噪聲的測(cè)量:在沒(méi)有細(xì)菌的情況下重復(fù)相同的方案。然后將制品于41.5°C下孵育6小時(shí)。這一測(cè)試的目的是驗(yàn)證是否能夠在3小時(shí)的孵育/富集之后檢測(cè)大腸桿菌0157:H7。所得結(jié)果:對(duì)于每個(gè)袋，在不進(jìn)行洗滌生物傳感器的步驟的情況下直接進(jìn)行阻抗測(cè)量。于200mV、lHz 至 IOOkHz 頻標(biāo)下獲得的 Nyquist 圖(_Im (Z)對(duì) Re(Z))不于圖 5。在無(wú)污染的情況下將生肉制品于Siotnacher 袋中孵育6小時(shí)后獲得的電化學(xué)阻抗譜和在陰性污染的情況下將生肉制品孵育3小時(shí)后獲得的電化學(xué)阻抗譜顯示出相同的電子轉(zhuǎn)移電阻Ret (半圓直徑)，其值分別等于116k Ω和115k Ω。因此，電子轉(zhuǎn)移電阻被歸因?yàn)榛|(zhì)的背景噪聲，其與在非目標(biāo)細(xì)菌生長(zhǎng)期間的電子轉(zhuǎn)移電阻相同。在將有陽(yáng)性污染(大腸桿菌0157:H7(0.92CFU/g生肉)所致)的生肉制品富集3小時(shí)之后，電子轉(zhuǎn)移電阻值為719kQ，即大約是有陰性污染時(shí)獲得的值的六倍，因此使得能夠明確地檢測(cè)大腸桿菌0157:H7。所有均化袋獲得的平均Rrt值、標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)值列于下表I。所給數(shù)值是與阻抗信號(hào)的半圓直徑對(duì)應(yīng)的電荷電阻的總值。表I
權(quán)利要求
1.檢測(cè)放置于密閉容器內(nèi)的樣品中存在的至少一種微生物的方法，所述方法基本包括以下步驟: a)在所述容器內(nèi)，使所述樣品與至少一種培養(yǎng)基和能夠捕獲待檢測(cè)的所述微生物的支持物接觸， b)封閉所述容器， c)將所述容器放置于能夠允許所述微生物生長(zhǎng)的條件下， d)在所述密閉容器內(nèi)，使用檢測(cè)工具檢測(cè)固定于捕獲支持物上的所述微生物的存在。
2.權(quán)利要求1的方法，其中在步驟a)的過(guò)程中，使能夠進(jìn)行所述檢測(cè)的揭示系統(tǒng)在所述容器內(nèi)接觸。
3.前述權(quán)利要求之一的方法，其包括中間步驟c’)，所述中間步驟c’)為:將全部或者部分由所述樣品、所述培養(yǎng)基、所述能夠捕獲待檢測(cè)的所述微生物的支持物以及可能的所述揭示系統(tǒng)構(gòu)成的混合物從在這種情況下被稱為主容器的所述容器中轉(zhuǎn)移到至少一個(gè)被稱為輔容器的第二容器中。
4.前述權(quán)利要求之一的方法，其包括補(bǔ)充步驟e)，所述補(bǔ)充步驟e)為確認(rèn)對(duì)所檢測(cè)微生物的檢測(cè)。
5.權(quán)利要求4的方法，其中使用與用于檢測(cè)步驟的檢測(cè)工具相同或者不同的檢測(cè)工具完成確認(rèn)步驟e)。
6.前述權(quán)利要求之一的檢測(cè)方法，其中所述檢測(cè)工具選自:電檢測(cè)工具特別是電化學(xué)檢測(cè)工具、光學(xué)檢測(cè)工具、聲學(xué)檢測(cè)工具、熱檢測(cè)工具、機(jī)械檢測(cè)工具和磁檢測(cè)工具。
7.前述權(quán)利要求之一的方法，其中用于捕獲所述微生物的所述支持物也構(gòu)成所述檢測(cè)工具。
8.前述權(quán)利要求之一的檢測(cè)方法，其中將所述微生物的至少一種特異性或非特異性結(jié)合配偶體固定于所述捕獲支持物上。
9.權(quán)利要求8的檢測(cè)方法，其中所述特異性結(jié)合配偶體選自:抗體、Fab片段、Fab’片段、重組或非重組的噬菌體蛋白和噬菌體。
10.前述權(quán)利要求之一的方法，其中實(shí)時(shí)進(jìn)行對(duì)所述微生物的檢測(cè)。
11.前述權(quán)利要求之一的檢測(cè)方法，其中在所述微生物的生長(zhǎng)步驟之后進(jìn)行對(duì)所述微生物的檢測(cè)。
12.前述權(quán)利要求之一的檢測(cè)方法，其中所述容器為均化袋、燒瓶、瓶子或者藥丸盒。
13.前述權(quán)利要求之一的方法，其中所述捕獲支持物是整體式支持物或者顆粒式支持物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中所述顆粒式支持物由敏化顆粒構(gòu)成。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述敏化顆粒為磁性的。
16.前述權(quán)利要求之一的檢測(cè)方法，其中所述檢測(cè)工具與數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)連接。
17.權(quán)利要求16的檢測(cè)方法，其中所述捕獲支持物或所述檢測(cè)工具與所述數(shù)據(jù)分析裝置之間的連接為有線連接或者無(wú)線連接。
全文摘要
本發(fā)明大體上涉及分析領(lǐng)域，例如生物分析領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明涉及檢測(cè)放置于密閉容器內(nèi)的樣品中存在的至少一種微生物的方法，所述方法基本包括以下步驟a)在所述容器內(nèi)，使所述樣品與至少一種培養(yǎng)基和能夠捕獲待檢測(cè)的所述微生物的支持物接觸；b)封閉所述容器；c)將所述容器放置于能夠允許所述微生物生長(zhǎng)的條件下；和d)在所述密閉容器內(nèi)，使用檢測(cè)工具檢測(cè)固定于所述捕獲支持物上的微生物的存在。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK103154262SQ201180033610
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2011年7月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月8日
發(fā)明者V·阿特拉什, B·科蘭, A·拉費(fèi), B·馬克魯夫, P·蒙特, D·莫斯蒂科內(nèi), J·C·雷蒙, T·索菲亞, A·維蒙 申請(qǐng)人:生物梅里埃公司