專利名稱：確定胰腺用于胰島分離的合適性的評分方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及改進胰島生產(chǎn)的產(chǎn)量和質(zhì)量的方法。胰島存在于動物的胰腺，本發(fā)明涉及確定胰腺是否將以優(yōu)良產(chǎn)率提供胰島的方法。
背景技術(shù)：
現(xiàn)在已確定胰島置換療法是一種治療患有各種疾病的患者的可行方法。其中包括接受上腹器官摘除術(shù)的癌癥患者(Tzakis，et al.，Lancet，336402-405(1990))；胰腺炎(Clayton，et al.，Transplantation，7692-98(2003)；Farney，et al.，Surgery，110427-437(1991)；Fontes，et al.，Transplant Proc，242809(1992)；Obenholzer，et al.，Transplantation，691115-1123(2000)；Robertson，et al.，Diabetes，5047-50(2001))和胰島素依賴性患者，在此胰島移植是一種治療選擇(Goss，et al.，Transplantation，741761-1766(2002)；Ricordi，et al.，Transplantation，751524-1527(2003)；Ryan，et al.，Diabetes，50710-719(2001)；Shapiro，et al.，N.Engl.J.Med，343230-238(2000))。
由于胰島在治療中的有用性，如上文所示，顯然人們有興趣開發(fā)分離它們的方法。盡管有許多有關(guān)應用自動化方法分離胰島的報道(Brandhorst，et al.，Exp.Clin.Endocrinol Diabetes，103 Suppl.23-14(1995)；Cui，et al.，Cell Transplant，648-54(2001)；Marchetti，etal.，Transplantation，52209-213(1991)；Miyamoto，et al.，CellTransplant，7397-402(1998)；Nielsen，et al.，Comp.Med.，52127-135(2002)；Swanson，et al.，Hum.Immunnol，62739-749(2001)；Toomey，et al.，Brit.J.Surg.，80240-243(1993)；Toso，et al.，Cell Transplant，9297-305(2000)；Wennberg，et al.，Transplant.Proc.，332537(2001))，胰島的分離仍然具有眾所周知的困難。例如，Bosta，et al.，J.Investig.Med，43555-566(1995)；Krickhahn，et al.，Cell Transplant，11827-838(2002)；Krickhahn，et al.，Ann Transplant，648-54(2001)，O’Neil，et al.，Cell Transplant，10235-246(2001)，和White，et al.，Horm.Metab.Res，31579-524(1999)，均探討了有關(guān)于此的問題。
在以下內(nèi)容中所公開的本發(fā)明是有關(guān)使成功獲得胰島產(chǎn)物的可能性最大化的方法?，F(xiàn)已確定，通過使用本文中提出的得分系統(tǒng)，能夠使得在任意給定的從胰腺分離胰島的過程中，確保以優(yōu)良產(chǎn)率獲得胰島的機會最大化。
以下公開內(nèi)容將說明此過程是如何實現(xiàn)的。


圖1A是胰腺的顯微照片，其按照本發(fā)明所示方法的得分為+3分，被判定為有用胰腺，圖1B是一張得分為-1的胰腺的顯微照片，該胰腺被判定為不合格。
具體實施例方式
實施例1以下實施例中所使用的動物為兩歲以上且已生育多個后代的母豬。用電擊昏動物并放血。隨后取出內(nèi)臟以供胰腺的分離。從電擊昏到將胰腺放置于冷的Hank’s平衡鹽溶液(“HBSS”)之間的時間通常是10～15分鐘。冷缺血時間為15～20分鐘。
為詳細描述此過程，取出整個胰腺，接著在左右胰葉間的連接處橫向地切下圍繞門靜脈的環(huán)形圈(annular ring)，以提供約2～5mm厚的活組織檢查切片。
根據(jù)Ricordi，et al.，ed.Pancreatic Islet Cell Transplantation(AustinR.G.Landes Company，1992)，132-142，將活組織檢查的組織切片切成兩半，并置于HBSS溶液或雙硫腙溶液(“DTZ”)中。
接下來將胰腺置于加入了2％熱失活的豬血清(“PS”)的HBSS溶液中，隨后送至進行胰島分離的實驗室。
然后對胰腺活組織檢查樣品進行評估，以確定它們是否適合進行胰島分離。評估五個變量。其中，每一變量的得分被賦值為+1或-1，下文將具體解釋。
首先，確定熱缺血時間，其定義為從放血開始到胰腺被放入冷的保存溶液之間的時間。如果此過程在小于或等于15分鐘內(nèi)完成，則得分為+1，如果大于15分鐘，得分為-1。盡管有時熱缺血時間高達20分鐘的情況下也能夠得到優(yōu)良的胰島產(chǎn)物，但其獲得成功的機會仍低于熱缺血時間為15分鐘的情況。
第二個指標為觀測胰腺的顏色，胰腺間的顏色變化可能是多種因素的結(jié)果。例如，如果胰腺中靜脈血管堵塞，例如因動物被電死或者應激反應所致，那將會導致該胰腺達不到作為所期望胰島供體的質(zhì)量。以上兩種情況均會造成血液集中在胰腺中、血紅蛋白的釋放并擴散到細胞外空間。繼而造成了器官顏色的改變，通常為褐色或紫色。
胰腺顏色可以主觀觀測，熟練的技術(shù)人員可以鑒別深色胰腺(其不合要求，得分為-1)，和淺色胰腺(其合乎要求，得分為+1)；但是，更加客觀的測定使用色度計，其根據(jù)反射光與入射光的比值即“反射比”檢測顏色。如果反射比小于約60，得分為-1，若在約60以上，則得分為+1。
用于器官的第三個指標是脂肪含量。為測定此指標，將約2×2×0.5cm的活組織檢查樣本浸入DTZ約5分鐘。染色之后，該組織在放大倍數(shù)為10倍的解剖鏡下觀察。胰島顯紅色，脂肪組織顯綠色。選擇觀察視野，評估整個綠色部分的百分比。如果總脂肪含量在約25％以上，則該器官得分為-1，而脂肪含量小于約25％時得分為+1。
可以理解的是，當然也存在其他用來判定器官脂肪含量的方法，所有這些方法都能在此處使用。
所采用的第四個指標是胰島分界。對于此參數(shù)，使用同樣的染色和觀測方法。用直徑大于50μm的胰島來評估胰島分界。詳細地說，如果兩組或多組DTZ染色的胰島細胞自胰島中心呈放射性，并超出了正常情況下平滑清晰分界的胰島外部邊界/平面，則判定為分界不佳。如果超過50％的胰島是分界優(yōu)良的，該指標被賦值為+1，如果低于50％，得分為-1。
最后一個指標是胰島的大小，以其直徑相對于所研究動物物種的平均胰島直徑作為判定指標。所研究器官中胰島的平均直徑是否大于該物種的平均值是作為評分目的的決定因素。對于很多物種，平均胰島直徑大約是100微米。鼠、豬、人以及其他許多物種的胰島均是如此。如果如上述所測量的大部分胰島的直徑超過100μm，則得分為+1，否則得分為-1。另外一方面，如果胰島的平均直徑與豬的不同，則采用該物種的胰島平均直徑作為參照值。例如，眾所周知，一種叫做羅非魚的魚類，擁有非常大的胰島，直徑平均大約是5mm。當研究羅非魚的胰腺時，其判斷點應為5mm，如果胰島的平均直徑大于5mm則應該給予正分。
將所檢測的每一個胰腺的這五個指標的得分列表，如果總分大于或等于+1，該器官被認為是合適的胰島供體。
下表列出了總分大于或等于+1的十個器官的典型結(jié)果。
表1個別供體胰腺的活組織檢查得分

為了比較，在圖1A和1B的照片中給出了得分為+3的胰腺(圖1A)和得分為-1的胰腺(圖1B)的顯微照片。在圖1A中，大的胰島(＞100μm)是明顯的，其良好分界也很清楚。相對的，圖1B中所示的胰腺顯示出小的且分界不佳的胰島。
根據(jù)本文中所描述方案的標準，圖1B中所示的胰腺將不進行進一步處理，但是，出于作為對照的目的，對它也繼續(xù)進行了處理，在以下實施例中會論及。
實施例2按照實施例1中提出的評價指標，對得分大于或等于+1的胰腺以及作為對照的得分為-1的胰腺進行了下一步的處理。對腺體的脂肪和結(jié)締組織進行整理，接著在主胰管中插入一根16g的鈍頭不銹鋼針管。在30℃條件下，將含有濃度為1.5-2.0g/l膠原蛋白酶P的HBSS溶液以50ml/mm的速率灌入，每克胰腺提供2ml溶液。
接下來，在30℃條件下，用500ml HBSS和2％PS與200ml膠原蛋白酶溶液一起浸過胰腺。使用39℃的外循環(huán)水將器官緩慢升溫到37℃，并保持消化溫度在36～37℃。當該器官顯示解離、并對手動壓力的抵抗力很小時(大約10～20分鐘總時間之后，在達到37℃之后大約5～10分鐘)，終止消化。
收集消化物并離心，吸走上清，將所得沉淀懸浮在10％PS和器官保存溶液中。接著，在含有添加2％PS的HBSS溶液的50ml試管中，用濃度梯度為1.105、1.095、1.085、1.05g/cm3的不連續(xù)Ficoll純化胰島。試管在650g、4℃條件下離心，收集含有胰島的分層，并用含有10％PS的HBSS溶液洗三遍，其后借助于解剖鏡將它們從非胰島組織中手工純化出來。重懸這些胰島，取兩個各0.5ml的樣品用于胰島產(chǎn)物的計數(shù)。
以圖1A和圖1B所示的胰腺為例，對于得分為+3的胰腺，胰島產(chǎn)量為105,000EIN(胰島當量數(shù)，由Ricordi，et al.定義，見上文)，純度為98.8％。相比之下，圖1B所示器官的產(chǎn)量為44,000EIN。
實際上，表1中的10個胰腺的平均產(chǎn)量為130,000EIN，平均每克消化后的組織為1,101EIN。所有樣本的純度均高于90％，其中9個器官的胰島活力高于89％，測定方法如下文所述。
實施例3在分離胰島之后，測定各種參數(shù)，其中包括純度、活力，如上文所提及。
純度是通過用DTZ對大約500EIN的胰島染色10分鐘來確定的，然后使用解剖鏡和數(shù)碼相機進行標準圖像分析。
活力是通過用雙乙酸熒光素(FDA)和溴化乙錠(EB)對樣本染色來測定的。詳細地說，將大約500EIN胰島樣本加入含10％PS、1％抗生素/抗真菌素(“A/A”)的1ml RPMI溶液中。然后，將由10mg的FDA和1ml丙酮制成的20μl FDA染劑、由30μl EB和1ml PBS制成的200μl EB加入。對胰島避光染色7分鐘，然后隨機選取10-50個胰島的樣品，在熒光顯微鏡下觀察，拍照，從而使用標準圖像分析方法來測定其活力。
也通過將大約500EIN胰島置于酸性乙醇提取溶液(7.2ml 1N鹽酸，400ml 100％變性乙醇)中來測量胰島的胰島素含量。所述樣本存放在-20℃，并實施胰島素RIA。
表2

實施例4本實施例及后續(xù)實施例將闡明如上所述鑒定為有用并分離出的胰島是否能用于大珠子。
將純化的胰島重懸在RPMI 1640+10％PS+1％A/A溶液中，達到2000EIN/ml的容積。將這些胰島平均分配在試管中，使得每個試管包含1ml含有2000EIN的懸浮液。
經(jīng)重力沉降后，去除上清，向每個樣品中加入0.5ml 50℃的在最小必需培養(yǎng)基加2.5％HEPES緩沖液中制備的1.5％瓊脂糖，，攪拌均勻。接著，將懸濁液在無菌礦物油下排出，形成四個具有光滑表面和均勻胰島分布的珠子。
取出大珠子，洗兩遍(RPMI+5％PS+1％A/A)。這些大珠子在5％濕潤二氧化碳的條件下，在同樣的溶液中培養(yǎng)5～7天，之后，用RPMI+1％A/A洗三遍，接著進行第二次瓊脂糖包被。為此目的，用移液器將60℃的0.5ml含有5％瓊脂糖的HEPES緩沖液加MEM轉(zhuǎn)移到無菌的塑料勺中，將每個大珠子滾動3～5次從而產(chǎn)生均勻的、第二瓊脂糖包被。將它們移入無菌礦物油從而產(chǎn)生光滑的表面，取出大珠子，用RPMI+2.5％PS+1％A/A洗兩遍，在37℃含5％濕潤二氧化碳的空氣中培養(yǎng)。
包含封裝了胰島的大珠子經(jīng)檢測可以保持活力超過六個月，在此之后，放射性免疫測定顯示它們能繼續(xù)產(chǎn)生高水的胰島素。
實施例5本實施例描述的實驗用于闡述根據(jù)如上所述分離得到的胰島是否能在體內(nèi)發(fā)揮功能。
采用雄性，非肥胖型糖尿病CB17-PrKdc<scid>/J小鼠，年齡7～9周。適應一周后，動物接受275mg/kg鏈脲霉素，其將誘導糖尿病。9天后，當它們血液中平均葡萄糖水平超過480mg/dl時，開始使用胰島素療法。
在施用鏈脲霉素后的34～35天，動物接受大約1000EIN的豬胰島，其是按照Bowen，et al.，Aust.J.Exp.Biol.Med.Sci.，58441-447(1980)中的方法在血栓中移植的，該文獻通過參考并入本文中。簡單地說，將胰島從懸浮液中沉淀下來，吸去培養(yǎng)基。然后，從動物體內(nèi)取出大約5～10μl的血液，將之加入胰島中，并使之凝結(jié)成血栓。用等體積的克他命(167mg/l)、甲苯噻嗪(33mg/ml)和生理鹽水麻醉受體動物。所述混合物以0.5ml/100g的劑量皮下施用。然后，在左側(cè)腰窩切開一個小口以暴露腎，利用解剖鏡在腎囊上切開一個小口，將腎囊與腎分離開，將上述胰島/血栓放置于囊下，縫合切口，使動物恢復。
在移植后第38～39天對動物施行腎切除術(shù)。簡單的說，在麻醉之后，將接受移植物的腎暴露，結(jié)扎腎血管，摘除每個動物的腎。5天之后，處死動物，收集胰腺用于在組織學上確定全部胰島β細胞被破壞。
組織樣本在10％中性緩沖液甲醛溶液中放置24小時，然后轉(zhuǎn)移到70％乙醇中。
接下來，用石蠟包埋組織，將5μm的切片用蘇木精和伊紅染色。胰腺和移植后的腎的切片用標準方法對含胰島素與胰高血糖素的細胞染色，然后進行研究。
所有小鼠在胰島移植后血糖恢復正常。腎切除術(shù)后，所有小鼠在四天內(nèi)均變?yōu)楸憩F(xiàn)出高血糖。
前述實施例闡明了本發(fā)明的特征，本發(fā)明是用來評估胰腺以確定由其來源的胰島是否具有臨床可用性的方法。本方法涉及檢測五種指定指標中的至少三種以及對每一個指標賦值。根據(jù)上述的描述，數(shù)值選擇可以是+1或-1。如果實行三種檢測后，該器官得分是+3，則測試可以終止，因為即使后兩個指標均為-1，該器官的總分也不會小于+1。
如果五種指標中的三種被檢測后器官得分為+1，則對第四種指標進行檢測，因為三種檢測后得分為+1并不能保證最后的總分為+1或更高。如果第四種指標的檢測結(jié)果是+1，那么可以考慮結(jié)束測試，這同樣是因為如果四種檢測之后得分為+2，那么該器官最后的總分不可能小于+1。
如果，在四種檢測后，器官得分為0，那么應該進行第五種檢測以獲得決定性的結(jié)果。
相反的，如果在三種檢測后器官得分為-3，就沒有必要繼續(xù)檢測了，同樣，四種檢測后得分為-2也不需要做最后的檢測。(注意，根據(jù)本發(fā)明，三種檢測后可能的得分只有+3，+1，-1，-3，四種測試后可能的得分只有+4，+2，0，-2，-4；但是，+4和-4的得分本排除了繼續(xù)檢測的必要性。所以，盡管期望進行進一步檢測，但卻不是必需的。)選擇先進行哪三個檢測取決于熟練的技術(shù)人員；但是，熱缺血時間是一項研究人員可控的指標，可以被優(yōu)選作為首先檢測的三項指標之一。剩下的兩項檢測將取決于熟練技術(shù)人員的選擇。
本文中闡述的方法可被用于任何物種的胰腺，包括、但是不限于以下物種牛、豬、綿羊、鼠、靈長類，人，魚或者另外的物種。
從根據(jù)本發(fā)明所選擇的胰腺中獲得的胰島可以“照原樣”被用于如實施例中所示的情形，或者可以例如如U.S.Patent Nos 5,643,569和Re 38,027中所述以被包膜的大珠形式應用，以上均通過引用并入本文。
本發(fā)明的其他方面對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說是清楚的，不需進一步詳細闡述。
所采用的術(shù)語和表達方式被用作描述性的術(shù)語，但不具有限制性，在使用這些術(shù)語和表達方式時，無意排除本發(fā)明或其中一部分所顯示和所描述的特征的任何等效物，并且應該承認各種修飾在本發(fā)明的范圍內(nèi)是有可能的。
權(quán)利要求
1.一種用于確定分離的胰腺是否可作為治療上有用的胰島的來源的方法，其包括以下各項(i)確定所述分離的胰腺的熱缺血時間，和以下的至少兩項(ii)確定所述分離的胰腺的顏色，(iii)確定所述分離的胰腺的脂肪含量，(iv)確定所述分離的胰腺中胰島的分界，和(v)確定從所述分離的胰腺中分離出的胰島的平均大小，其中(a)在(i)中，熱缺血時間少于約15分鐘的被賦值為+1分，而大于約15分鐘的被賦值為-1分；(b)所述顏色的反射比在約60以上的被賦值為+1分，在約60以下的被賦值為-1分；(c)脂肪含量在約25％以下的被賦值為+1分，在約25％以上的被賦值為-1分；(d)胰島分界在約50％以上的被賦值為+1分，在約50％以下的被賦值為-1分，并且(e)胰島的平均直徑等于或者大于所述物種的平均值的被賦值為+1分，在所述物種的平均值以下的被賦值為-1分，由此最終的正分表明所述胰腺是治療上有用的胰島的來源。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括(i)和(ii)-(v)中的至少三項。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括(i)-(v)的所有項。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括(i)、(ii)和(iii)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括(i)、(ii)和(iv)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括(i)、(ii)和(v)。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括(i)、(iii)和(iv)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括(i)、(iii)和(v)。
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其包括(i)、(iv)和(v)。
10.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其包括(i)-(iv)。
11.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其包括(i)、(ii)、(iii)和(v)。
12.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其包括(i)、(ii)、(iv)和(v)。
13.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其包括(i)和(iii)-(v)。
全文摘要
本發(fā)明涉及評估胰腺作為治療上有用的胰島的來源的方法。本發(fā)明闡述了一類評分系統(tǒng)，并列出了五個指標。如果其中有三個指標是正值，那么該胰腺是治療上有用的胰島的合適來源。
文檔編號C12N5/071GK101056988SQ200580039062
公開日2007年10月17日 申請日期2005年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者勞倫斯·加茲達, 艾伯特·L·魯賓, 巴里·史密斯 申請人:羅格森研究所