專利名稱：奶的生產方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種改進奶產品半衰期的方法。尤其地，它涉及一種生產有較長保質期的奶的方法。
背景技術：
奶產品的變質可能由很多原因所導致。奶產品可能由于使用外國材料作為包裝材料或容器，而與產品發(fā)生反應導致化學變化而發(fā)生變質。牛油類的脂肪常遭受腐敗，這是由用于分解脂肪內的脂肪酸，使之成為更小分子不導致增重的脂肪酸，同時，釋放某種氣味的化學反應而造成的。
像其他食品一樣，奶產品自然地受到微生物的污染。為了保持活性微生物的數(shù)量盡可能低，人們發(fā)展了一些物理上除掉微生物細胞的方法——例如通過改進衛(wèi)生設備，加熱和控制溫度。冷藏也延長了奶產品變質的時間。
奶產品的另一個變質的原因是奶成分被包括脂蛋白脂肪酶(lipoproteinlipases，LPLs)和金屬蛋白酶(metalloproteases)在內的酶所降解。酶是所有活的物體產生的化學物質，細菌產生酶來分解食物，這幫助細菌進入營養(yǎng)物質并在環(huán)境中擴散。
至于脂蛋白脂肪酶(LPLs)，則通過所述過程水解奶脂肪并散發(fā)惡臭。脂蛋白脂肪酶(LPLs)能被失活，然而一些細菌性脂蛋白脂肪酶(LPLs)是耐熱性的。耐熱性脂蛋白脂肪酶(LPLs)是酸敗的主要原因(Cousin，1982)。
發(fā)明摘要本發(fā)明的首要方面，提供了一種改進奶，加工的奶產品，濃縮液等的半衰期的方法。尤其地，提供一種改進奶保質期的方法。
根據本發(fā)明方法的第一個方面，包括如下步驟制備能縮短奶半衰期或能幫助其它微生物縮短奶半衰期的至少一種微生物中存活或生長所必需的分子的抗體，并使之與奶進行接觸。所述抗體，有希望在接觸奶時，與所述分子形成一種抗體-抗原反應并且會消耗，移除或阻止所述分子成為所述微生物的營養(yǎng)源或者阻礙所述分子的活性。一類這種抗體是來自熒光假單胞菌(PseudomonasFluorescens)的脂蛋白脂肪酶(LPLs)產生的抗體。
根據本發(fā)明方法的第二個方面，包含如下步驟誘導動物乳腺產生至少一種抗體，所述抗體是由能縮短奶半衰期或能幫助其它微生物縮短奶半衰期的至少一種微生物的存活或生長所必需的分子制備得到的抗體。
根據本發(fā)明的第三個方面，提供了一種制造含有抗體的奶的方法，所述方法包含如下步驟根據上述方法誘導抗體，然后收集并隨意處理哺乳動物產生的含有抗體的奶。所述奶的收集采用正常的奶處理過程即為有效。
根據第四方面，本發(fā)明提供一種改進了保質期的奶產品，所述奶產品根據上述任何一種方式制備，并且由所述方法制備得到的奶被加工成奶產品。本發(fā)明也提供了一種改進了保質期的奶產品，所述產品是一種保質期通過添加由能縮短奶半衰期或能幫助其它微生物縮短奶半衰期的至少一種微生物中存活或生長所必需的分子制備得到的抗體來改進的奶產品或其衍生物。
本發(fā)明的其它目的，特征，和優(yōu)點，可以在上述具體描述中，和下述優(yōu)選實施例的具體描述中體現(xiàn)。
附圖的簡要描述

圖1是由于接種在動物腹股溝區(qū)域的染料遷移造成的乳房上的乳腺被染成藍色的照片(照片由默多克大學的解剖學系教授Martin CAKE提供)；圖2是山羊的鼻內免疫的照片；
圖3是在綿羊腹股溝內根據本發(fā)明的一個方面植入抗原釋放裝置的照片；圖4顯示綿羊體內圖3的植入的抗原釋放裝置的位置；圖5是用來植入抗原釋放裝置的設備的示意圖；圖6顯示抗原釋放裝置內的脂肪酶根據本發(fā)明的一個方面擴散到奶瓊脂盤的照片。隨著酶從管孔中擴散開，它水解奶瓊脂內的脂質，明顯地在棒管周圍形成暗色區(qū)帶。脂肪酶蛋白是用來模擬本發(fā)明的發(fā)展的抗原。
圖7是用各種方法免疫山羊得到的羊奶內的抗脂肪酶抗體的水平的圖表。采用各種方法免疫山羊得到的羊奶內的抗脂肪酶抗體的水平。每種方法下兩種動物的平均吸收值被分成28天。最大抗體水平通過抗原釋放裝置(CRD)和肌肉注射的方式得到。
圖8顯示在兩種被分別植入抗原釋放裝置(ARD)和給予肌肉注射的動物體內的各自抗脂肪酶抗體吸收水平的圖表；兩種被分別植入抗原釋放裝置(CRD)和給予肌肉注射的動物體內的抗脂肪酶抗體水平。該兩個結果突出了免疫過程的繁殖的自然屬性。
圖9顯示通過各種方法免疫的山羊血清內的抗脂肪酶抗體的水平的圖表；每種方法下兩種動物的平均吸收值被分成28天。
圖10顯示通過抗原釋放裝置(ARD)和肌肉注射免疫山羊得到羊奶中(◆)和血清中(■)的平均抗脂肪酶抗體水平的比較。
圖11顯示植入抗原釋放裝置的山羊羊奶中(◆)和血清中(■)產生的抗脂肪酶抗體的圖表。羊奶中的抗脂肪酶抗體水平和血清中沒有觀察到含有抗脂肪酶抗體說明植入腹股溝區(qū)域的抗原釋放裝置內的抗原擴散進入了乳房上的淋巴結；圖12顯示接種山羊的奶中的IgG、IgA和IgM的水平的圖表。兩組動物在0，10和19天的時候，在不同部位(組1(G1)在側腹而組2(G2)在靠近乳房上淋巴結的區(qū)域)進行接種。采用ELISA方法判斷IgG，IgA和IgM的相對水平。與組1的動物相比，在組2動物的奶中的所有這三類免疫球蛋白的水平都更高；圖13顯示在玻璃載玻片上的羊奶瓊脂的擴散試驗的照片揭示抗脂肪酶抗體抑制了脂肪酶分解脂肪的活性。載玻片1在孔中加入PBS或生理鹽水。載波片25mg/ml來自熒光假單胞菌(P.fluorescens)的脂肪酶。載波片35mg/ml脂肪酶的抗體陰性血清溶液(1∶1稀釋)。載波片45mg/ml脂肪酶的抗脂肪酶抗體陽性血清溶液(1∶1稀釋)。
圖14顯示擴散試驗的照片，揭示了在1％瓊脂1％奶的條件下，抗脂肪酶抗體對脂肪酶分解脂肪的活性的抑制效果。孔11∶1預采血的血清和PBS的溶液?？?1∶1預采血的血清和脂肪酶的溶液。孔32.5mg/ml脂肪酶?？?1∶1抗脂肪酶血清(38天)和PBS的溶液?？?1∶1抗脂肪酶血清(38天)和脂肪酶。孔60.85％PBS。
圖15顯示比較抗脂肪酶抗體和非脂肪酶抗體的抑制活性圖。脂肪酶的抗體在兩種不同動物(X0247和X0248)的血清中培養(yǎng)。這些抗脂肪酶抗體陽性血清與來自4種動物的非脂肪酶抗體陽性血清比較。所有含有血清的板中僅孔5含有以1∶1稀釋的含有脂肪酶的不同抗體的血清溶液；圖16顯示在含有抗脂肪酶抗體的血清8種稀釋液中培養(yǎng)的羊奶的pH值的圖表，揭示pH值隨著抗體濃度的降低而改變，說明血清中的抗體有劑量反應。陽性對照(僅脂肪酶無血清)和陰性對照(僅生理鹽水或PBS)也用來一同比較。在實驗開始之前和培養(yǎng)1個小時之后測定羊奶的pH值。在1∶2和1∶5的稀釋度時，pH變化最小。隨著抗體濃度的降低，pH變化變得明顯，說明血清中的抗體有劑量反應；圖17顯示在無抗脂肪酶抗體的血清中培養(yǎng)的羊奶的pH值圖表。經過一段時間培養(yǎng)(1小時)之后pH值的改變說明羊奶中的脂肪酶正在水解脂肪；圖18顯示含有抗脂肪酶抗體的羊奶的pH值和37℃1個小時內脂肪酶的不同水平的圖表。對含有高抗體水平的血清而言，pH值沒有顯著變化，這說明抗脂肪酶抗體抑制脂肪的水解。相反，與帶有少量(或無)抗脂肪酶抗體的羊奶的同樣比較說明脂肪的水解；圖19顯示羊奶中脂肪被脂肪酶(LPL)水解導致隨著自由脂肪酸的減少(◆)pH值也降低的圖表。血清的脂肪酶抗體降低脂肪酸的速率。pH降低的速率依賴于劑量。與抗體(◆)濃度較高(1000μl)時相比，在抗體(■)濃度(500μl)較低時降低的速率更快；圖20顯示通過血清抗脂肪酶抗體對脂肪水解依賴劑量的抑制的圖表。羊奶被脂肪酶(LPL)“穿刺”。3種不同濃度的抗脂肪酶抗體被添加并與2種沒有任何抗體的羊奶比較(◆PBS；■抗體陰性血清)。通過最低抗體濃度(◆240μl)的pH值變化測得的水解曲線與無抗體情況下的測試相似，說明缺乏抗體能抑制酶。在較高抗體濃度(500μl和1000μl)時，水解形態(tài)和速率不同是由抗體的抑制效果導致的；圖21顯示在有和無抗脂肪酶抗體的羊奶中的脂肪水解的圖表?？怪久笇χ久富钚缘囊种谱饔迷?0℃經過11天來評估。結果顯示抗脂肪酶抗體能夠抑制脂肪的水解(◆，▲)。然而，有證據顯示酸敗機制在10℃時最旺盛。無論是在含有抗體，不含抗體或含有生理鹽水(PBS)的情況下，pH值的變化速率是相似的。
圖22顯示在含有或不含有抗脂肪酶抗體的羊奶中的脂肪水解圖表。通過4℃經過13天的間隔測量pH值的改變來檢測在含有或不含有抗脂肪酶抗體時脂肪被脂肪酶的水解的情況?？贵w陽性實驗(◆)的pH值在這13天內保持不變?？贵w陰性試驗以及生理鹽水(PBS)陰性對照(分別為▲和■)的pH值在大約第6天時開始降低。曲線的形狀發(fā)生改變，說明與羊奶變質有關的動力學的可能有差異。
發(fā)明描述概述本領域技術人員會感激，本發(fā)明在此處描述的內容與那些特別描述的不同，均容許改變和修改。應該理解，本發(fā)明包括所有此類改變和修改。本發(fā)明也包括涉及或在本說明書中描述的所有步驟，特征，合成物和化合物，單獨或集合的任何和所有組合物或任何兩個或更多的步驟或特征。
本文中引用的任何文件，參考書目，專利申請或專利都是作為參考，這意味著它們應該被作為本文的一部分進行閱讀和考慮。本文中引用的文件，參考書目，專利申請獲專利并非僅出于簡潔的原因而在本文中重復。
本發(fā)明不限于這里描述的特定實施例的范圍，所述實施例僅是為了舉例而存在。
功能相當?shù)漠a品，合成物和方法明顯都屬于這里描述的本發(fā)明的范圍。
通過詳細說明，縮寫CRD和ARD可以互換使用。都指代這里描述的，公開的和要求權利的抗原釋放裝置。
整個具體描述，除非內容需要，否則單詞“包含”，或類似“包含著”或“正包含”，都表示包含一定的整數(shù)或整數(shù)集合而不排除任何其他的整數(shù)或整數(shù)集合。
這里所選用的術語的其他定義可能在本發(fā)明和應用的描述中找到。除非由不同方式定義，這里采用的所有其他科學的和技術術語都與本發(fā)明所屬領域的普通技術人員的通常理解相一致。
本發(fā)明的具體描述本發(fā)明基于通過接觸由假單胞菌種(例熒光假單胞菌)產生的脂蛋白脂肪酶的抗體這一項偶然的發(fā)現(xiàn)。可能產生與普通巴氏滅菌比較，擁有改良屬性和保質期的奶產品。
本發(fā)明的第一方面提供一種改進奶的半衰期的方法，包括如下步驟a)奶與抗體接觸，所述抗體針對如下至少一種i)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生存所必需的分子；ii)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子；iii)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物的生存所必需的分子；優(yōu)選地，本方法也能延長奶的保質期。
希望得到的抗體，當與奶接觸時，能與所述分子發(fā)生抗體-抗原反應并且能耗盡，移動或阻止所述分子成為微生物的營養(yǎng)源或阻礙分子的活性。該類抗體是一類針對來自假單胞菌種(如熒光假單胞菌)的脂蛋白脂肪酶的抗體。
本發(fā)明的方法應用于由哺乳動物產生的奶。優(yōu)選地，生產奶的哺乳動物為嚙齒動物或反芻動物。更優(yōu)選的，所述哺乳動物為山羊，綿羊或牛。盡管哺乳動物是乳牛品種最佳；但產奶的山羊或綿羊品種也能采用。
這里使用的術語“奶”指哺乳動物產生的乳汁或初乳或任何全脂奶的衍生物，如液體或固體形態(tài)的脫脂乳或乳清。
這里使用的術語“抗原”指任何能夠在處理過的哺乳動物體內引起抗體反應的物質，所述抗體能連接一種分子，該分子是為能縮短奶的半衰期或幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物生存和/或生長所必需的分子。本發(fā)明采用的抗原性物質包括，但不僅限于來自假單胞菌種熒光細菌(如假單胞菌)的脂蛋白脂肪酶和金屬蛋白酶。半抗原和多肽作為抗原來使用首先要通過本領域技術人員普遍知道的化學方法與類似蛋白這樣的載體物質相連。(Hanly等；多克隆抗體制備方法的評論，ILAR期刊(1995)，373，93-118)。
被用于本發(fā)明的方法的抗體分子包括完整的免疫球蛋白分子，基本完整的免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的包含抗體決定簇的部分。所述含有抗體決定簇的部分包括本領域公知的Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2和F(V)。Fab和F(ab’)2?？贵w的這些部分通過采用公知的方法分別在基本完整的抗體上由木瓜蛋白酶和胃蛋白酶的蛋白水解反應來制備得到。以美國專利號4,342,566為例。Fab’抗體部分同樣是公知的并且通過用巰基乙醇還原F(ab’)2部分的兩條重鏈之間的二硫鍵，并由碘代乙酰胺類試劑烷化前述步驟得到的蛋白硫醇而得到。包含完整抗體分子的抗體是優(yōu)選的，并在這里采用。
本發(fā)明的第二方面，提供一種改良奶的半衰期的方法，包括如下步驟a)在動物的乳腺中誘導產生至少一種抗體，所述抗體針對如下至少一種i)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生存所必需的分子；ii)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子；iii)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物的生存所必需的分子；iv)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子。
優(yōu)選地，所述方法同樣延長奶的保質期。
誘導奶產生抗體的方法包括如下步驟在至少一個乳房上的淋巴結附近或內部植入至少一種抗原釋放裝置，使用時抗原釋放裝置在乳房上的淋巴結周圍的組織區(qū)域釋放一種抗原，刺激抗體分泌物進入乳腺。
根據本發(fā)明的這一方面，向乳房上的腺體植入的距離至少要足夠近到使抗原釋放裝置釋放的抗原能激起哺乳動物(植入到的)的抗體反應維持一定的水平從而使得乳汁產生的抗體達到有效治療效果或抗菌性的水平。例如，ARD可以植入(牛、羊等的)乳房。可選地，抗原釋放裝置優(yōu)選植入離至少一個乳房上的淋巴結距離遠至150mm處，使用時抗原釋放裝置朝乳房上的淋巴結周圍的組織區(qū)域釋放一種抗原，刺激抗體分泌物進入乳腺。優(yōu)選地，抗原釋放裝置植入在靠近或在離乳房上淋巴結大約在1mm和100mm之間距離處。最優(yōu)選地，距離在50mm和100mm之間。
抗原釋放裝置的植入靠近或位于至少一個乳房上淋巴結內導致抗原釋放裝置內含抗原朝淋巴結附近和淋巴結內的組織區(qū)域釋放(圖1)。這反過來刺激淋巴結產生針對抗原的抗體。這些抗體被分泌到乳腺從而進入哺乳動物的乳汁。
抗原釋放裝置的尺寸，特性和選擇根據已選抗原的尺寸和性質來定。希望抗原釋放裝置的選擇能夠讓內含的抗原從所述裝置內以能維持在期望水平從而導致被植入的哺乳動物產生抗體反應的速度釋放。
慢釋放化合物的裝置在，例如，美國專利號3,279,996中被描述，同時維持抗原釋放的免疫增強裝置在，例如，澳大利亞專利號740133中被描述。
充滿有益物質的多孔硅注入在專利號DE69917625D中被描述。一種分子遞送的可植入裝置在美國專利號6,716,208中被描述。其他持續(xù)釋放準備物的適當例子包括含有蛋白的固態(tài)防水性聚合物的半透膜，所述膜是以有形物質的形式存在，例如，薄膜，或壓縮成遞送裝置的微縮膠囊。持續(xù)釋放膜的例子包括聚合物，水凝膠[例如，Langer等在生物醫(yī)學材料研究期刊15167-277(1981)和Langer在化學技術1298-105(1982)中描述的聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸鹽)(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))或聚(乙烯基醇)(poly(vinylalcohol))]，聚交酯(美國專利號3,773,919，EP58,481)，L-谷氨酸(L-glutamic acid)共聚物和γ乙烷-L-谷氨酸酯(gammaethyl-L-glutamate)(Sidman等，生物聚合物22547-556 )，無降解乙烯-乙烯基醋酸鹽(non-degradable ethylene-vinyl acetate)(Langer等，如前)，可降解乳酸-乙醇酸(lactic acid-glycolic acid)共聚物，如LUPRONDEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物和亮丙瑞林組成可注射微滴)，和聚-D-(-)-3羥基丁酸(poly-D-(-)-3-hydroxybutyric acid(EP133,988))，另外的參考是B.Baras，M.A.Benoit&J.Gillard(2000)“影響抗原從噴霧干燥的聚(DL-交酯)微粒(poly(DL-lactide))中釋放的參數(shù)”。國際制藥學期刊，200133-145。
當如乙烯-乙烯基醋酸鹽(ethylene-vinyl acetate)和乳酸-乙醇酸(lacticacid-glycolic acid)類的聚合物保證分子釋放超過100天，某種水凝膠釋放蛋白的時間周期較短。當裝入膠囊的抗原在體內維持較長時間時，可能會在37℃時由于暴露在水份中而變性或聚合，導致生物活性的喪失及免疫原性可能會改變。
能夠想到針對所述機理的抗體穩(wěn)定化的合理方法。例如，如果發(fā)現(xiàn)聚合機制是由于硫-二硫鍵交換導致的分子間SS或二硫鍵造成的，穩(wěn)定化可以通過修改硫氫殘基，酸性溶液的親水化，控制水份含量，采用合適的添加劑，和研究特殊的聚合物膜化合物來實現(xiàn)。
持續(xù)釋放片段化合物也包括脂質體捕獲片斷。包含所述抗體的脂質體通過已有技術制備DE3,218,121；Epstein等，國家科學院學報美國823688-3692(1985)；Hwang等，國家科學院學報美國774030-4034(1980)；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP142,641；日本專利申請83-118008；美國專利號4,485,045和4,544,545；和EP102,324。通常脂質體是一類微型(大約200-800埃)單層薄膜形式。其他用來在乳房上淋巴結附近的組織內緩慢釋放抗原的裝置包含在本發(fā)明內。
用于治療的抗原有效量根據，比如，施用目標，施用路線，抗原和/或助劑的類型和哺乳動物的自身條件來定。因此，要獲得最佳效果需要治療師滴定劑量和修訂施用模式。典型地，操作者在劑量達到預期效果時停止施用抗原。治療的過程通過傳統(tǒng)方法很容易被監(jiān)控。
本發(fā)明的進一步方面，提供了一種誘導奶中抗體持續(xù)釋放的方法，還包括步驟通過在乳腺內，腹膜內，肌肉內，鼻內選擇一條施用路線來施用初級化合物。初級合成物的施用可能發(fā)生在植入抗原釋放裝置之前，其間或之后。優(yōu)選地，初級化合物遞送到粘膜表面，這樣在粘膜表面(乳腺是其中之一)的抗體產品能優(yōu)先得到激發(fā)。
施用初級化合物可以是單次施用，或可在幾天或幾周內相隔一段時間多次施用。初級化合物的施用時間通常根據同時免疫實驗方案來進行間隔(例如，每2周)。為了避免局部刺激和充血，通常優(yōu)選地，初級化合物不應該在同一位置以超過每兩周的頻率施用。所述初級步驟的首次揭露刺激了低水平的抗體產生，隨后通過抗原釋放裝置釋放抗原來增加和維持抗體產生。
本發(fā)明的方法也可以包括一個在植入抗原釋放裝置之后，通過選自乳腺內，腹膜內，肌肉內和/或鼻內的施用路徑，對哺乳動物施用含有抗原的輔助化合物的輔助步驟。優(yōu)選地，輔助化合物遞送到粘膜表面，這樣在粘膜表面(乳腺是其中之一)的抗體產生能優(yōu)先得到激發(fā)。
此類輔助化合物可以是單次施用，或可在幾天或幾周內相隔一段時間多次施用。輔助化合物的施用通常分隔開以滿足操作者的便利。為了避免局部刺激和充血，通常優(yōu)選地，輔助化合物的施用在同一位置以不超過每周一次的頻率為宜。
在優(yōu)選的方式中，施用的抗原在每一步驟所采用的都一樣。因此，同樣的抗原可以用于抗原釋放裝置，初級化合物和/或輔助化合物。
在抗原釋放裝置和初級及輔助化合物中都需要使用助劑。助劑可以成為組織庫從而緩釋免疫原，同時作為淋巴系統(tǒng)的激活劑非特異性的增強免疫反應[Hood等，在免疫學，p.384，第二版，Benjamin/Cummings，MenloPark，California(1984)]。本發(fā)明與抗原一同使用的合適的助劑包括但不僅限于如下Freund的完整助劑(Freund’s complete adjuvant(FCA))，F(xiàn)reund的非完整助劑(Freund’s incomplete adjuvant(FIA))，TiterMax GoldTM，助劑65，霍亂毒素B亞組，IL1-B片段163-171合成人類助劑，alhydrogel；或者百日咳博德特氏菌，胞壁酰二肽(muramyl dipeptide，MMD)，細胞素(cytokines)，皂草苷(saponin)，Adju-Phos，Algal Glucau，Algammuliu，鋁水凝膠(Alhydrogel)，抗原形成劑(Antigen Formulation)，(Avridine)，Bay R1005，(calcitrial)，磷酸鈣(calcium phosphate)，凝膠(Gel)，CRL1005，霍亂全毒素(CT)(choleraHolotoxin(CT))，DDA，DHEA，DMPC，DMPG，DOC/明礬復合物，γ菊粉，Gerbu助劑，GMDP，Imiquimod，Imuither，γ干擾素，ISCOM(s)，Iscoprop 7.0.3，Loxoribine，LT-OA或LT口服助劑，MF59，MONTANIDE ISA51和ISA720，MPL，MTP-PE，MTP PE脂質體，murametide，murapalmitive，NAGO，非離子表面活性劑小泡，Pleuram，PLGA，PGA和PLA，聚醚(Pluronic)L121，PMMA，PODDS，聚鐳(Poly Ra)，Polyru Polyphophazene，聚山梨醇酯80，蛋白螺旋(ProteinCochleates)，QS-21，Quil A，Rehydrogel HPA，Rehydrogel LV，S-28465，SAF-1，Sclavo，多肽，Seudai Protediposomes，含仙臺的脂膜，Span 85，specal，squalene，stearyl Tyrosine，Theramide，Threonyl-MDP，Ty顆粒，saponin Q521，MF59，明礬等。
關于施用初級化合物或輔助化合物的步驟，優(yōu)選地，根據現(xiàn)有實驗方法在液體介質中懸浮抗原性物質用來輸液或注射?？梢圆捎萌魏维F(xiàn)有的合適的載體，稀釋液，緩沖液，和助劑。合適的懸浮液包括生理鹽水，水，和生理緩沖液。
初級化合物或輔助化合物的施用是通過注射完成，優(yōu)選地在注射前抗原先在適當載體中通過使用助劑來乳化，例如，實驗室勻質劑。此類方法的一個實施例中，水性抗原與3倍體積的助劑混合，并乳化至形成穩(wěn)定的油包水結構。穩(wěn)定乳化物的產生能通過采用現(xiàn)有技術的實驗方法被證實。
在本發(fā)明的進一步方面，本方法進一步包含一個預篩選步驟。所述步驟中，對每個動物的產生抗體的能力進行測試和篩選。動物個體間存在合理的產生抗體能力的差異。所述預選步驟，動物顯示最佳的抗體滴定反應被選擇，并幫助減少動物間的差異因素。所述步驟能被類似用來構建一組特別適合產生抗體的動物。
根據本發(fā)明的第三個方面，提供一種生產含有抗體的半衰期得到延長的奶，所述方法包括如下步驟根據前面具體描述的方法誘導抗體，然后收集并隨意處理哺乳動物產生的含有抗原的奶。奶的收集可以根據正常的奶的制備過程來進行。優(yōu)選地，所述方法也延長奶的保質期。
根據本發(fā)明的第四個方面，本發(fā)明提供一種改進半衰期的奶產品，所述奶產品由前述任何一種方法得到的奶制備得到并且由所述方法得到的奶制成奶產品。
本發(fā)明也提供一種改進了半衰期的奶產品，所述產品是通過添加針對至少一種如下物質的抗體而改進其半衰期的奶產品或其衍生物i)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生存所必需的分子；ii)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子；iii)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物的生存所必需的分子；
iv)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子。
所述奶直接采自哺乳動物即是有用的，但可以根據需要進行加工。加工步驟的例子包括加熱，紫外線照射，濃縮，添加食品添加劑，干燥成濃縮物，奶粉等。
本發(fā)明也提供一種延長保質期的奶產品，所述產品是通過添加針對至少一種如下物質的抗原而延長其保質期的奶產品或其衍生物i)對能夠縮短奶的保質期的至少一種微生物生存所必需的分子；ii)對能夠縮短奶的保質期的至少一種微生物生長所必需的分子；iii)對能夠幫助其它微生物縮短奶的保質期的至少一種微生物的生存所必需的分子；iv)對能夠幫助其它微生物縮短奶的保質期的至少一種微生物生長所必需的分子。
能從本發(fā)明的方法獲益的奶和奶產品可以包括食品，飲料(例如，能量或運動飲料)和動物飼料。例如，奶可能可以作為一種成份添加到嬰兒食品，面包產品(例如，面包，發(fā)酵食品或蛋糕)或供應面包的產品(如，奶油凍或面包餡或澆頭)，奶雞蛋面糊或面包粉，谷類，糖果，香精或乳狀飲料，水果餡，肉湯，湯，醬(如，肉醬)或食品增稠劑，UHT加工過的肉湯，配餐(如，素食餐/配料)，肉制品(如，肉糜，香腸，肉夾餅，烤肉，罐頭肉，肉派，配置魚類，餡餅，肉醬和糊)，批薩面料，寵物食品，藥物或營養(yǎng)品，番茄產品，調味品(如沙拉或低脂肪調味品)，快餐或餅干醬(如，開胃菜或甜醬)，糊(如，面條)，加入脂肪的粉，乳蛋餅或果餡餅，奶酪或奶油類似和其他本發(fā)明中沒有具體描述的日用品的替代品(如，甜點，調味奶飲料，奶昔，奶酪，奶酪醬或蘸料)。
實施例本發(fā)明的進一步特征在如下的例子中更完整地被描述，但不僅限于以下實施例。應該理解，這里的具體描述僅是為了對本發(fā)明進行舉例。不應該以任何方式認為是對本發(fā)明上述廣泛描述的限制。
實施例1制備無助劑抗原釋放裝置材料(i)0.15g D-甘露醇(Sigma-Aldrich)(ii)0.15g檸檬酸鈉(Proanalys)(iii)11.25mg熒光假單胞菌的脂肪酶(Sigma-Aldrich)(iv)0.75ml硅膠A(Dow Corning Q7-4850)(v)0.75ml硅膠B(Dow Corning Q7-4850)(vi)2×2.5ml一次性注射器(Terumo)(vii)2×1ml注射器(Terumo)(viii)2×12G×4英寸無菌全鋼皮下注射器針頭(ix)37℃培養(yǎng)箱(x)無菌培養(yǎng)皿(xi)無菌解剖刀(xii)無菌spachella(xii)32ml McCartney玻璃瓶方法(i)拔去注射器針頭活塞(ii)用壓舌板將硅膠A放入1ml注射器內?；钊呕刈⑸淦?，分0.75ml入一個2.5ml注射器。
(iii)對硅膠B重復上述步驟。
(iv)脂肪酶，甘露醇和檸檬酸鈉在小McCartney玻璃瓶中混勻，吸入含有硅膠A的2.5ml注射器中。硅膠B從原注射器移到另一個2.5ml注射器，并在一個注射器中形成硅膠A和硅膠B之間有效“三明治”夾雜脂肪酶，甘露醇和檸檬酸鈉的情況?；钊麖目盏淖⑸淦鞣呕剡@個注射器。第一個注射器中的內容全部移到第二個注射器然后活塞再次蓋上。重復此過程20次使所有試劑有效混合。所有試劑最終移到兩個12G針內并在37℃保存三天。硅膠從針內提煉出來，在打開的板中切割成3cm長柄放置在UV光下24小時，再放入10ml離心管中-20℃無菌保存。每3cm ARD在總共250μl硅膠中含有1mg脂肪酶，13mg甘露醇，13mg檸檬酸鈉。
實施例2制備含有助劑的抗原釋放裝置材料(i)0.3g D-甘露醇(Sigma-Aldrich)(ii)0.3g檸檬酸鈉(Proanalys)(iii)22.50mg熒光假單胞菌的脂肪酶(Sigma-Aldrich)(iv)1.2mg IL1-B人合成片段163-171(Sigma)(v)1.5ml硅膠A(Dow Corning Q7-4850)(vi)1.5ml硅膠B(Dow Corning Q7-4850)(vii)2×2.5ml一次性注射器(Terumo)(viii)2×1ml注射器(Terumo)(ix)2×126×4英寸無菌全鋼皮下注射器針頭(x)37℃培養(yǎng)箱(xi)無菌培養(yǎng)皿(xii)無菌解剖刀(xiii)無菌spachella(xiv)32ml McCartney玻璃瓶方法(i)拔去注射器活塞
(ii)用壓舌板將硅膠A放入1ml注射器內?；钊呕刈⑸淦?，分0.75ml入一個2.5ml注射器。
(iii)對硅膠B重復上述步驟。
(iv)脂肪酶，甘露醇和檸檬酸鈉在小McCartney玻璃瓶中混勻，吸入含有硅膠A的2.5ml注射器中。硅膠B從原注射器移到另一個2.5ml注射器，并在一個注射器中形成硅膠A和硅膠B之間有效“三明治”夾雜脂肪酶，甘露醇和檸檬酸鈉的情況。活塞從空的注射器放回這個注射器。第一個注射器中的內容全部移到第二個注射器然后活塞再次蓋上。重復此過程20次使所有試劑有效混合。所有試劑最終移到兩個12G針內并在37℃保存三天。硅膠從針內抽提出來，在打開的板中切割成3cm長柄放置在UV光下24小時，再放入10ml離心管中-20℃無菌保存。每3cm ARD在總共250μl硅膠中含有1mg脂肪酶，13mg甘露醇，13mg檸檬酸鈉，50μg IL1-B。
實施例3遞送ARD一個含有10ml無菌可換針頭型微量注射針，10G×4英寸無菌全鋼皮下注射器，和90mm×10G無菌全鋼焊條(圖5)的裝置，所述裝置的針筒活塞上附加穿通整個針頭的棒桿?；钊笸舜蟾?cm為靠近針頭的位置留出空間插入抗原釋放裝置。這樣，當活塞推入時，抗原釋放裝置被棒桿推出針筒(圖5)。
動物被背朝下放在地上，并由動物處理人控制住。靠近乳房在它右后方大約3cm×10cm區(qū)域用碘酒擦拭。2ml 2％利諾卡因(lignocaine)由26G皮下注射針筒打入皮膚組織作為局部麻醉。含有ARD的10G針筒刺入所述區(qū)域的后端并沿皮下推到前端。所述活塞壓下并且針頭同時后退。刺入點用碘酒擦拭過。大多數(shù)情況下抗原釋放裝置能在原位被感知。
實施例4制備脂肪酶鼻部接種體材料(i)15.5mg來自熒光假單胞菌的脂肪酶(Sigma-Aldrich)(ii)38.75ml 0.85％生理鹽水(Excel實驗室)(iii)1mg霍亂毒素B亞組(US Biological)(iv)2.5ml注射器(v)50ml無菌管(Falcon)(vi)8-10cm長大約20G塑料管(如，來自快速輸液系統(tǒng)(Terumo))方法(i)所有試劑在首次施用當天混合于50ml管內。
(ii)剩下的4℃保存到下次使用。
實施例5遞送鼻部接種體2.5ml接種體(包含1mg脂肪酶，64.5μg霍亂毒素B亞組)被吸入帶有20G輸液管的注射器。60-80％管長放置入動物的右側鼻孔并緩緩打入同時從鼻孔內退出管子(圖2)。
實施例6制備脂肪酶肌肉注射接種體材料(i)36.5mg來自熒光假單胞菌的脂肪酶(Sigma)(ii)9.1ml 0.85％的生理鹽水(Excel實驗室)(iii)TiterMax GoldTM助劑(iv)McCartney玻璃瓶(v)3ml全塑料注射器(Teruma)
(vi)無菌全鋼雙軸(double-hub)(vii)23G×1英寸皮下注射器針頭方式(i)在首次施用當天將脂肪酶和生理鹽水在McCartney玻璃瓶中混和至4mg/ml的濃度。剩下的4℃保存到下次使用。
實施例7遞送肌肉內接種體0.5ml 4mg/ml的脂肪酶的生理鹽水溶液被吸入注射器中，并根據廠商指示，用0.5ml TiterMax GoldTM進行乳化。接種體用接到注射器的23G×1英寸針筒在左后退的背部進行肌肉內(IM)施用。動物在第7天，第14天和第21天接受IM注射。
實施例8免疫的實驗方案1動物在側腹處被施以IM注射，這是獲得免疫的常規(guī)方法。
兩只動物在第0天通過肌肉途徑(IM)注射來自熒光假單胞菌的脂肪酶以獲得免疫，1250μg脂肪酶通過750μl titremax進行乳化后才使用。動物分別在第12天和第24天接受首次注射(950μg脂肪酶和560μl titremax)和二次注射(2500μg脂肪酶和500μl titremax)。動物在免疫當天被抽血，并且血液樣本在免疫過程之后每隔一月進行采集。
實施例9免疫的實驗方案2
動物通過抗原釋放裝置和/或注射進行抗原接種。表1概述了針對6個動物和一種抗原的接種的日程表。
表1抗原釋放裝置(ARD)的初期實驗方案。
試驗CRD和S/C注射抗原促使乳房分泌抗體




由施例10免疫的實驗方案3實驗方案采用每組兩只動物的總共12只山羊。6種不同的實驗方法分別施加到2只動物身上來確定制備穩(wěn)定抗體水平的奶的最佳程序，如表4和表5所示。
表4刺激奶中產生抗體的免疫的實驗方案。

表5刺激奶中產生抗體的免疫的實驗方案。






總共對12只山羊進行研究，每兩只羊采用同一種接種形式?？怪久缚贵w的存在通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)來測定。平均吸收值小于空白對照的每日奶樣品被劃分成小塊(圖6)。結果在動物內是可重復的，如圖7所示。
所有6種方法都能成功產生抗體。然而，每一組的抗體相對濃度都不同。最高平均吸收值代表產生抗體的最高濃度，被記錄在組4動物中。組4動物在實驗的第0天植入ARD，并在第7，14和21天在后側腹部位進行3次后續(xù)注射。
組4的平均吸收值比組1山羊產生的值要高，組1山羊僅在第7，14和21天接受IM注射。
組1和組4動物大概在第14天的時候出現(xiàn)反應。在第15天時，抗脂肪酶抗體水平充分升高，可能是二次免疫反應的結果?？贵w的較高水平維持了整個研究過程，本例中是直到第28天。
對接種動物血清中的抗脂肪酶抗體水平也進行了測量，如圖8，9，10和11所示。圖8顯示在內植有抗原釋放裝置(ARD)和被進行肌肉內注射的兩只動物中的抗脂肪酶抗體的各自吸收水平的結果。圖9顯示根據不同試驗方案免疫的山羊的血清中抗脂肪酶抗體水平的結果。圖10顯示帶有抗原釋放裝置(ARD)并進行肌肉內注射的山羊免疫產生的奶與血清中平均抗脂肪酶抗體水平的比較結果。圖11顯示在植入抗原釋放裝置的山羊的奶和血清中產生的抗脂肪酶抗體。奶中的抗脂肪酶抗體水平及血清中不含抗脂肪酶抗體說明植入腹股溝區(qū)域的抗原釋放裝置釋放的抗原正在擴散到乳房上淋巴結。
實施例11免疫實驗方案4本實驗方案采用每組兩只正在泌乳的山羊(Capra hircus)，總共使用4只山羊。采用的抗原是來自熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的脂肪酶。
·免疫實驗方案的準備工作1.乳化30mg脂肪酶于15ml 0.85％生理鹽水。
2.根據制造商的說明書采用Titermax Gold進行乳化。生理鹽水中的脂肪酶與等體積Titermax Gold(1∶1)混合。
3.分裝1ml到2.5ml注射器中以施用(每1ml劑量含有1mg脂肪酶)。
4.兩組動物在第0，10和19天接種。
5.組1接種在左側腹，組2接種在乳房上淋巴結附近。
6.收集奶和血清。
·為酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)涂布板1.制備2.5μg/ml抗原的涂布緩沖液溶液。
2.100μl所述混合液分裝到96孔ELISA板的每個孔中。
3.蓋上板并在4℃下留待過夜。
·酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方案1.使用前，所述涂布板用PBS Tween洗3遍。
2.在PBS Tween中含有1％人血清的血清稀釋液。
3.將100μl所述血清稀釋液裝入每孔。
4.將1μl待測樣品裝入每孔。
5.板在37℃培養(yǎng)2小時。
6.板用PBS Tween洗3遍。
7.制備1/1000稀釋的小鼠α-綿羊IgG，小鼠α-綿羊IgA和小鼠α-綿羊IgM的1％血清稀釋液(1％人血清的PBS Tween溶液)。
8.100μl裝入對應的孔中。
9.板在37℃培養(yǎng)2小時。
10.板用PBS Tween洗3遍。
11.制備1/2500稀釋的兔α-小鼠IgG(H+L)的1％血清稀釋液。
12.100μl裝入每孔。
13.37℃培養(yǎng)2小時。
14.板用PBS Tween洗3遍。
15.制備1/100稀釋的250mg/ml磷酸硝基苯酯的乙醇胺緩沖液。
16.100μl裝入每孔。
17.室溫培養(yǎng)大約20到30分鐘。
18.50μl 3.75M的NaOH終止反應。
19.405nm讀ElISA板。
·結果收集的奶通過ELISA分析IgG，IgA和IgM的水平。組1(肌肉注射入側腹-標明為G1)和組2(刺激乳房上淋巴結-G2動物)的結果如圖13，顯示各組的奶中產生的所有三類免疫球蛋白都具有較高水平。
實施例12收集并保存奶樣品材料(i)Beckman Acuspin冷凍離心(ii)來自高溫霉菌(Mucor meihei，Sigma)的二類粗凝乳(Rennet TypeII)的Hp水溶液，其濃度為2mg/ml(iii)10ml無菌離心管(iv)P1000微量分注器(pipetteman)(v)1ml移液管(vi)5ml塑料儲存管(vii)37℃培養(yǎng)箱方法不帶任何化學或機械刺激地手工采集奶，并將奶置入32mlMcCartney玻璃瓶。通常在早晨未被幼仔分食的情況下收集奶。樣本在收集后即儲存在冰上并且盡可能快的轉移。奶被轉移到無菌10ml離心管內并在4℃以2000rpm的轉速離心15分鐘。奶通過移液管從固體脂肪層下吸入并置入干凈的10ml管中。移液管小心穿透脂肪層進入下方的奶層。2mg/ml粗凝乳(Rennet)溶液以0.4ml粗凝乳對5ml奶的比例加入奶中，搖晃所述管并在37℃培養(yǎng)1到2小時。管子以5000rpm×15分鐘的狀態(tài)4℃離心。上層通過移液管轉移并-20℃保存。
奶中的抗體通過ELISA進行定量。
實施例13收集并保存血液樣本材料(i)7ml的9ml真空管(VacutainersTM(Bectco Dickinson))進行血清收集(ii)20G×1.5英寸真空管配套針和固定器方法采用真空收集管(VacutainersTM)，固定器和針從靜脈中采集血樣。管子保存在4℃。樣本以4000rpm×15分鐘在4℃離心。上層通過移液管轉移并-20℃保存。
實施例14酶聯(lián)免疫吸附試驗材料(i)10×磷酸生理鹽水緩沖液(PBS)；1L二次蒸餾水，1.91g KH2PO4(BDHChemicals Aust Pty Ltd)，6.1g Na2HP04(ASAX Chemicals)，2g KCl(BDH ChemicalsAust Pty Ltd)，(ii)80g NaCl，1.95g NaN3(Sigma Aldrich)，pH到7.4
(iii)200ml pH9.6的碳酸鹽涂布緩沖液；200ml二次蒸餾水，3.18g Na2CO3(BBH)，5.88g NaHCO3(BDH)，0.39g NaN3(Sigma)。
(iv)0.85％生理鹽水(Excel Laboratories)(v)0.25mg/ml來自熒光假單胞菌(Sigma Aldrich)的脂肪酶的碳酸鹽涂布緩沖液溶液(vi)PBS-TW20板洗液(BDH)；200ml 10×PBS(如上)，1800ml蒸餾水，1ml Tween-20(Labchem)(vii)血清稀釋液；200ml甘油(BDH)，29g NaCl(BDH)，0.2g KH2PO4(BDH)，0.61g Na2HPO4(BDH)，0.2g KCl(BDH)，1.95g NaN3(Sigma)，蒸餾水定容到1L，1.5ml Tween-20(Labchem)，pH到7.4。4℃保存。使用前，往一定體積內添加干燥的BSA(CSL)，濃度為1％。
(viii)生理鹽水0.85％(Excel Laboratories)(ix)驢抗-山羊IgG-辣根過氧化物酶(HRP)(Promega)(x)1M H2SO4(AJAX Finechem)(xi)TMBS EIA溶液(BioRad)部分A&B(xii)P200微量分注器及槍頭(xiii)P20微量分注器及槍頭(xiv)NuncTM孔吸96孔ELISA板(xv)BioRadTM96孔板分光光度模型450方法100μl脂肪酶的碳酸鹽緩沖液添加到ELISA板的孔中并且4℃過夜保存。板用PBS-TW洗3次。100μl血清稀釋液加入孔中進行血清分析，并且90μl加入孔中進行奶樣分析。1μl血清樣品和10μl奶樣加入血清稀釋液中。通過輕輕叩擊所述板獲得混合物。所述板4℃過夜保存。板用PBS-TW洗3次。100μl1/2500稀釋的驢抗-山羊IgG-HRP的0.85％生理鹽水溶液添加到每孔。板在室溫下培養(yǎng)1小時。板用PBS-TW洗3次。TMBS的部A的9部分和部B的1部分在Schott玻璃瓶中混合并且往每孔中添加100μl。板在室溫下培養(yǎng)10分鐘。100μl1M H2SO4添加入每孔中，板在分光光度計的450nm處讀數(shù)。獲得吸收結果的打印輸出。收集來自所有測量動物的每一奶和血樣本的吸收值被測量。每個動物以吸收值為y軸，時間(天)為x軸制圖，得到每組(2個實驗個體組成)的平均吸收值。
實施例15脂肪酶在奶瓊脂載玻片上的擴散(i)制備1％(1g/100ml)瓊脂(Oxoid Cat No L13，Basingstoke，Hampshire，England)的磷酸鹽生理鹽水緩沖液(pH7.4)。
(ii)添加100μl全脂奶(Masters，Perth，Australia)到5ml1％瓊脂內。
(iii)對載玻片而言，2.5ml“奶瓊脂”倒?jié)M玻璃，能用10分鐘(2％奶于1％瓊脂。)(iv)在奶瓊脂凝膠上用瓊脂打孔機準備五個1.5mm直徑的洞，并且通過真空移掉瓊脂。
(v)瓊脂膜與熒光假單胞菌(Aldrich，Milwaukee，WI，USA)的脂肪酶共同過夜培養(yǎng)。5mg/ml脂肪酶制備于0.85％生理鹽水中。
(vi)表示脂肪酶實驗中脂肪降解的擴散區(qū)帶，與帶有(a)生理鹽水，(b)脂肪酶+抗體陰性血清和(c)脂肪酶+抗脂肪酶陽性血清進行比較。
結果如圖13顯示。每一個奶載玻片上，5個孔都用生理鹽水(載玻片1)，脂肪酶(載玻片2)，帶有抗體陰性血清的脂肪酶(載玻片3)和帶有抗脂肪酶抗體陽性血清的脂肪酶(載玻片4)填滿。載玻片2上，可以看到當脂肪酶水解奶薄膜中的脂肪時產生的水解區(qū)帶。陰性對照(載玻片1內的生理鹽水)確定酶對水解區(qū)帶有作用。脂肪酶的水解活性能被抗脂肪酶抗體抑制，以載玻片4為證。載玻片3，包含抗體陰性血清，確定是抗體而不是其他血清成分抑制了酶。
實施例15奶瓊脂板
(i)制備1％奶在1％瓊脂中。
(ii)10ml溶液倒入Petri盤中室溫放置。
(iii)在瓊脂上用瓊脂打孔機準備六個1.5mm直徑的洞，并且通過真空移掉瓊脂。
(iv)孔被以下溶液填滿1∶1預抽血血清+PBS溶液(孔1)，1∶1預抽血血清+脂肪酶溶液(孔2)，2.5mg/ml脂肪酶(孔3)，1∶1抗脂肪酶血清(38天)+PBS溶液(孔4)，1∶1抗脂肪酶血清(38天)+脂肪酶(孔5)，和0.85％PBS(孔6)(請參閱圖5對照每孔的位置)。
結果如圖14和15顯示。
圖14顯示1％奶在帶有孔的1％瓊脂板上，含有1∶1比例的預抽血血清+PBS溶液(孔1)，1∶1預抽血血清+脂肪酶溶液(孔2)，2.5mg/ml脂肪酶(孔3)，1∶1抗脂肪酶血清(38天)+PBS溶液(孔4)，1∶1抗脂肪酶血清(38天)+脂肪酶(孔5)，和0.85％PBS(孔6)。
在孔2和孔3中，脂肪水解的區(qū)帶是脂肪酶活性的證據。孔5中，脂肪酶的活性被添加含有抗脂肪酶活性的血清而抑制?？?，血清中不含有抗體，顯示沒有水解活性。這顯示血清的這些成分不影響奶中的脂肪。相似地，含有抗脂肪酶抗體的血清不水解奶中的脂肪(孔4)。行6是陰性對照(僅含有PBS)并顯示沒有脂肪水解。
總的來說，添加脂肪酶能水解以孔2和孔3為證的奶瓊脂盤內的奶中含有的脂肪。當比較孔3和孔2的區(qū)帶直徑時，看來血清中有元素能增強水解活性。這是未曾預料到的，由于血清是一種富含蛋白質的溶液，它可能含有能與脂肪酶協(xié)同作用的元素。然而，脂肪酶的水解活性，包括血清因子，已經完全被含有抗脂肪酶抗體的物質所抑制(見孔5)。單獨血清(孔1和4)和生理鹽水(孔6)不產生水解活性。
如圖15所示，同樣的奶瓊脂盤設置來比較對脂肪酶的抑制活性。X0247和X0248含有不同來源的抗脂肪酶抗體。X0249，X0250，X0251和X0252含有直接針對其他蛋白質的抗體。六個盤中的每一個的孔2和3，有明顯的脂肪水解。含有各自的抗體的孔5內，只有在含有抗脂肪酶抗體的奶盤X0247和X0248種才能看到明顯的抑制。相反，其他抗體不抑制脂肪酶活性。
實施例16通過pH的脂肪酶試驗發(fā)生脂肪水解(i)在McCartney瓶中，添加5ml0.05M碳酸鈉(Ajax-Univar)到10ml新鮮奶(Harvey Fresh，Harvey，Western Australia)中(ii)在37℃培養(yǎng)所述混合物5分鐘。
(iii)在另一個McCartney中，40℃培養(yǎng)500μl5mg/ml脂肪酶。
(iv)添加奶/碳酸鈉溶液到所述脂肪酶中。
(v)插入pH試紙并在預定30秒間隔后記錄pH值。
圖16概括了測量脂肪酶水解活性的實驗結果。主要地，鮮奶與脂肪酶一起37℃培養(yǎng)。在實驗開始之前和添加脂肪酶的30秒間隔后測量奶的pH值。由于奶中脂肪被水解，釋放出來的自由脂肪酸降低了奶中的pH值。與脂肪酶一起在37℃培養(yǎng)的奶中pH值的改變被制成圖表(圖16)。pH值的下降為一個雙曲線模式。當添加抗脂肪酶抗體時，pH變化速率以劑量-依賴方式下降。在添加更高濃度的抗脂肪酶抗體時pH變化速率更低。進一步，曲線形狀是線性的。
實施例17通過采用抗脂肪酶抗體抑制脂肪被脂肪酶水解(i)通過pH進行的脂肪水解試驗被用于比較研究來評價抗脂肪酶抗體的抑制屬性。特別地，一系列脂肪水解試驗通過下列添加物確立a.預抽血血清(如.抗體陰性血清)，
b.240μl抗脂肪酶陽性血清，c.500μl抗脂肪酶陽性血清，d.1000μl抗脂肪酶陽性血清。
(ii)pH值在30秒間隔時測量，結果作圖。
實施例16和17的結果如圖16，17和18所示。進一步的數(shù)據如圖19和20所示。
圖17中，來自圖16的數(shù)據采用兩組附加數(shù)據系列來做圖。奶與脂肪酶和抗體陰性血清(■)一同培養(yǎng)。顯示pH變化的曲線與對照(如.僅奶+脂肪酶)的曲線類似?？怪久缚贵w滴定到較低濃度(如.1000μl，500μl和250μl)。結果表明抗體濃度是速率限制因素。250μl曲線是拋物線形而非線性，表明抗體水平受限并且酶的水解活性不完整。
試驗在10℃和4℃時重復進行。在10℃，含有抗體和不含抗體的含有脂肪酶的奶的pH變化速率是類似的，表明與脂肪酶水解不同的機制正在工作。4℃時，沒有抗體的變化速率與含有抗脂肪酶抗體的樣本比較要更快。
實施例18通過測量作為脂肪水解標志的pH值來估計保質期(i)通過在10℃和4℃時的pH變化測量脂肪水解。
(ii)每天測量一系列含有生理鹽水(PBS)，10％預抽血血清(抗體陰性血清)和10％抗脂肪酶陽性血清的樣本的pH值。
結果如圖21和22所示。
奶與脂肪酶和含有抗脂肪酶抗體的8種稀釋度的血清一同培養(yǎng)。制備比較用陽性對照(僅含脂肪酶無血清)和陰性對照(僅生理鹽水或PBS)。實驗開始前和培育1小時后測量奶的pH值。在1∶2和1∶5稀釋度，pH改變最小。隨著抗體濃度減小，pH變化明顯，說明抗體劑量對奶脂肪被脂肪酶水解的作用有影響。
相反，與不含抗體的血清一同培養(yǎng)的奶顯示了脂肪酶的水解活性。經過培育時間(1小時)的pH改變說明脂肪酶正在水解奶中的脂肪。
盡管本發(fā)明的描述中參考了某種優(yōu)選實施例，許多變化和修正可以在本發(fā)明廣泛原理范圍內發(fā)生。因此，應當認為優(yōu)選實施例和所有此類改變和修正都屬于本發(fā)明的范圍和精神內。
權利要求
1.一種改進奶的半衰期的方法，包括如下步驟a)奶與抗體接觸，所述抗體針對如下至少一種i)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生存所必需的分子；ii)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子；iii)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物的生存所必需的分子；iv)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物的生長所必需的分子。
2.如權利要求1所述的方法，所述方法延長奶的保質期。
3.如權利要求1或2所述的方法，所述抗體，當與奶接觸時，能與所述分子發(fā)生抗體-抗原反應并且能耗盡，排除或阻止所述分子成為微生物的營養(yǎng)源或阻礙分子的活性。
4.如權利要求3所述的方法，所述抗體是針對來自熒光假單胞菌的脂蛋白脂肪酶的抗體。
5.如權利要求1-4任一項所述的方法，所述抗體分子選自下列完整的免疫球蛋白分子，基本完整的免疫球蛋白分子和包含抗體決定簇的免疫球蛋白分子的一部分。
6.如權利要求5所述的方法，所述包含抗體決定簇的免疫球蛋白分子的一部分選自下列Fab，F(xiàn)ab’，F(xiàn)(ab’)2和F(V)部分。
7.一種改進奶的半衰期的方法，包括如下步驟a)在動物的乳腺中誘導產生至少一種抗體，所述抗體針對如下至少一種i)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生存所必需的分子；ii)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子；iii)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物的生存所必需的分子；iv)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子。
8.如權利要求7所述的方法，所述方法延長奶的保質期。
9.一種誘導奶產生抗體從而改進奶的半衰期的方法，包括如下步驟a)在至少一個乳房上的淋巴結附近或內部植入至少一種抗原釋放裝置，使用時抗原釋放裝置朝乳房上的淋巴結周圍的組織區(qū)域釋放一種抗原，刺激抗體分泌物進入乳腺。
10.如權利要求9所述的方法，所述奶的保質期得到延長。
11.如權利要求9所述的方法，所述植入點足夠接近乳房上的腺體，以使得經過抗原釋放裝置的周期后，抗原從抗原釋放裝置中釋放并誘導奶產生抗體。
12.如權利要求11所述的方法，所述抗原釋放裝置被植入離至少一個乳房上的淋巴結距離遠至100mm處。
13.如權利要求12所述的方法，所述抗原釋放裝置被植入距離至少一個乳房上淋巴結在大約1mm和100mm之間。
14.如權利要求13所述的方法，所述抗原釋放裝置被植入距離至少一個乳房上淋巴結在大約50mm和100mm之間。
15.一種誘導奶中抗體持續(xù)釋放以延長奶的半衰期的方法，包括如下步驟a)施用初級化合物；并且b)在靠近，最靠近或在至少一個乳房上淋巴結內植入至少一個抗原釋放裝置，使用時抗原釋放裝置朝乳房上淋巴結周圍的組織區(qū)域釋放一種抗原，從而刺激抗體分泌物進入乳腺。
16.一種誘導奶中抗體持續(xù)釋放以延長奶的半衰期的方法，包括如下步驟a)在靠近，最靠近或在至少一個乳房上淋巴結內植入至少一個抗原釋放裝置，并且b)在抗原釋放裝置植入后對哺乳動物施用含抗原的輔助化合物；使用時抗原釋放裝置朝乳房上淋巴結周圍的組織區(qū)域釋放一種抗原，從而刺激抗體分泌物進入乳腺。
17.一種誘導奶中抗體持續(xù)釋放以延長奶的半衰期的方法，包括如下步驟a)施用初級化合物；b)在靠近，最靠近或在至少一個乳房上淋巴結內植入至少一個抗原釋放裝置，并且c)在抗原釋放裝置植入后對哺乳動物施用含抗原的輔助化合物使用時抗原釋放裝置朝乳房上淋巴結周圍的組織區(qū)域釋放一種抗原，從而刺激抗體分泌物進入乳腺。
18.如權利要求15或17所述的方法，所述初級化合物的施用路線選自乳腺內，腹膜內，肌肉內或鼻內。
19.如權利要求15或17所述的方法，所述初級化合物的施用發(fā)生在植入抗原釋放裝置之前。
20.如權利要求15或17所述的方法，所述初級化合物的施用發(fā)生在植入抗原釋放裝置的過程中。
21.如權利要求15或17所述的方法，所述初級化合物被遞送到粘膜表面。
22.如權利要求15或17所述的方法，所述初級化合物是單次施用。
23.如權利要求15或17所述的方法，所述初級化合物在間隔幾天或幾周后被多次施用。
24.如權利要求16或17所述的方法，所述輔助化合物的施用路線選自乳腺內，腹膜內，肌肉內和/或鼻內。
25.如權利要求16或17所述的方法，所述輔助化合物被遞送到粘膜表面。
26.如權利要求16或17所述的方法，所述輔助化合物是單次施用。
27.如權利要求16或17所述的方法，所述輔助化合物在間隔幾天或幾周后被多次施用。
28.如權利要求15-27任一項所述的方法，所述抗原的施用方法的每一步驟都是相同的。
29.如權利要求15-28任一項所述的方法，所述抗原釋放裝置，初級化合物和輔助化合物進一步包含一種助劑。
30.如權利要求1到29任一項所述的方法，在施用抗原釋放裝置前進一步包含有預選步驟，選用呈現(xiàn)最佳抗體反應的動物運用到權利要求1到29中任何一種方法中。
31.一種生產含有抗體的半衰期得到改進的奶的生產方法，所述方法包括如下步驟a)采用權利要求15-30任一項所述的方法誘導抗體；并且b)收集哺乳動物產生的含有抗體的奶所述抗體延長奶的半衰期。
32.如權利要求31所述的方法，所述抗體延長奶的保質期。
33.一種延長了半衰期的奶產品，所述奶產品從根據權利要求1-32中任一種方法產生的奶中制備得到，并且由所述方法產生的奶處理成奶產品。
34.一種延長了保質期的奶產品，所述奶產品從根據權利要求1-32中任一種方法產生的奶中制備得到，并且由所述方法產生的奶處理成奶產品。
35.一種延長了半衰期的奶產品，所述產品是奶產品或其衍生物，該產品的半衰期通過添加針對如下至少一種物質制得的抗體而獲得延長i)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生存所必需的分子；ii)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子；iii)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物的生存所必需的分子；iv)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子。
36.一種延長了保質期的奶產品，所述產品是奶產品或其衍生物，該產品的保質期通過添加針對如下至少一種物質制得的抗體而獲得延長i)對能夠縮短奶的保質期的至少一種微生物生存所必需的分子；ii)對能夠縮短奶的保質期的至少一種微生物生長所必需的分子；iii)對能夠幫助其它微生物縮短奶的保質期的至少一種微生物的生存所必需的分子；iv)對能夠幫助其它微生物縮短奶的保質期的至少一種微生物生長所必需的分子。
37.如權利要求33-36任一項所述的奶產品，所述含有抗體的奶通過加熱，紫外照射，濃縮，添加食品添加劑，干燥成濃縮物或奶粉的方式制成奶產品。
全文摘要
改進奶半衰期的方法，包括a)奶與抗體接觸，所述抗體針對如下至少一種i)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生存所必需的分子；ii)對能夠縮短奶的半衰期的至少一種微生物生長所必需的分子；iii)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物的生存所必需的分子；iv)對能夠幫助其它微生物縮短奶的半衰期的至少一種微生物的生長所必需的分子。
文檔編號A23C3/00GK101072508SQ200580038762
公開日2007年11月14日 申請日期2005年10月6日 優(yōu)先權日2004年10月6日
發(fā)明者泰匡官, 威廉·約翰·彭黑爾, 皮特·邁克爾·吉爾林 申請人:農業(yè)生物技術有限公司