專利名稱：一種小鼠胰島細胞的分離純化方法
技術領域：
本發(fā)明屬于細胞分離技術領域，特別涉及一種小鼠胰島細胞的分離方法。
背景技術：
糖尿病已成為威脅人類健康的第三大殺手，糖尿病病人的高血糖狀態(tài)，有利于細菌在體內(nèi)生長繁殖，同時也抑制了白細胞吞噬細菌的能力，使病人的抗感染能力下降。常見的有泌尿道感染、呼吸道感染、皮膚感染、神經(jīng)細胞、神經(jīng)纖維易產(chǎn)生病變等。糖尿病人發(fā)生冠心病的機會是非糖尿病病人的2 3倍，視網(wǎng)膜病變也是糖尿病人的常見病。目前在國內(nèi)9000多萬的糖尿病患者中，I型糖尿病的患者占到了約5%左右，而胰島細胞移植是治療I型糖尿病最有效的途徑之一。 小鼠具有品系純正、可重復性好、繁殖力強、科研周期短和可進行基因調(diào)控等諸多優(yōu)點，已廣泛應用于胰島移植和糖尿病研究領域。但小鼠由于體積小，胰島結構細微，這對小鼠胰島細胞團分離操作造成一定的難度。傳統(tǒng)的小鼠胰島分離方法主要包括三步用膠原酶充盈小鼠胰腺，胰腺消化和胰島純化。其中最為關鍵的步驟在于胰腺是否可以被膠原酶充盈，充盈的程度決定了所分離胰島的數(shù)量和質量。但是，在實際的分離過程中，某些小鼠模型或者小鼠胰腺胰管解剖結構變異的情況下，傳統(tǒng)的分離方法無法正常分離胰島。1976年Lacy團隊第一次提出一種基于膠原酶的胰島分離方法,此方法的提出極大的推動了胰島相關的體內(nèi)體外實驗研究的開展。在這種方法中，胰腺從麻醉的動物上取下并剪成碎片，這樣做可以增加組織的表面積，使膠原酶更加充分的發(fā)揮消化作用。接下來，剪成碎片的胰腺組織放入膠原酶溶液中進行消化，同時不斷的攪拌和搖晃加速消化過程。后來的Gotoh對此方法進行了改良(稱為CBD法):膠原酶通過膽總管注射至胰腺，然后將充盈好的胰腺放至37°C中靜置消化，而不需要將胰腺剪成碎塊。顯然，從胰島的質量和數(shù)量角度考慮，Gotoh改良后的方法更加有效。但是，對于胰管走形變異的小鼠、幼鼠、高脂喂養(yǎng)的小鼠、胰腺炎及胰島新生小鼠模型無法使用CBD法進行胰島分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種小鼠胰島細胞的分離方法，該方法豐富了小鼠胰島細胞分離的可選技術，提高了分率成功率，也更好地遵從了動物福利原則。本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案來實現(xiàn)一種小鼠胰島細胞的分離純化方法，其步驟包括(I)胰腺充盈將小鼠麻醉、皮膚消毒后沿腹正中切開，充分暴露胰腺；剪斷與脾部胰腺相連接的韌帶組織，將脾靜脈和脾交界處夾閉并剪破心臟，在脾靜脈與門靜脈交匯處進針至脾靜脈，注射膠原酶充盈液；將充盈好的脾部胰腺從腹腔中游離下來后浸潰在膠原酶溶液中；(2)胰腺消化將步驟(I)中得到的胰腺膠原酶溶液水浴消化，并加入Hank’ s液后離心分離，取沉降物。
(3)分離純化在步驟(2)中得到的沉降物經(jīng)過重懸沉淀、過濾、離心處理后得到小鼠膜島細胞。所述步驟(I)中，將小鼠麻醉所注射的麻藥劑量與小鼠體重比為45-60mg :1kg。所述步驟(I)的膠原酶充盈液為含有XI型膠原酶的hank’s液，其中XI型膠原酶濃度為 O. 4-0. 5mg/mL。所述步驟(I)中的膠原酶充盈液注射量為l-2mL。所述步驟(2)中水浴溫度為37°C -37. 5°C。所述步驟(2)中膠原酶溶液中XI型膠原酶的濃度為O. 4-0. 5mg/mL。所述步驟(3)中，將沉降物中加入Hank’s液后重懸沉淀、過濾，將濾液離心分離并取沉降物；在沉降物中加入梯度離心液重懸沉淀，加入Hank’ s液離心分離，取上清液離心 分離后在沉降物中加入分離液，手撿得到小鼠胰島細胞。所述分離液為牛白蛋白與hank’ s液的混合液，該混合液中牛白蛋白的濃度為1%-1. 5%。胰島在胰腺中的分布并非隨機分布，超過71%的胰島分布于脾部胰腺中。脾靜脈和腸系膜上靜脈相交后組成肝門靜脈，小鼠的脾部胰腺血供相對單一，脾靜脈是唯一支配小鼠脾部胰腺的靜脈。由脾靜脈、小靜脈、毛細血管組成了一個相對封閉的管道系統(tǒng)。本發(fā)明就是利用這個封閉的管道系統(tǒng)作為膠原酶的充盈線路，達到了很好的分離胰島效果，本發(fā)明的這種小鼠胰島細胞的分離方法稱為脾靜脈法(以下簡稱SV法)。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于1、本發(fā)明的小鼠胰島細胞分離純化的方法在操作上簡單易行，而且所用到的膠原酶的配置濃度低、胰腺消化時間短，所用整個分離純化過程成本低、效率高；2、SV法所分離的胰島在形態(tài)上和CBD法沒有明顯差異，而且大多數(shù)SV法所分離的胰島可以正常貼壁。3、SV法所分離的胰島在功能上和CBD法沒有明顯差別，而且SV法分離得到的胰島在高糖刺激下胰島素釋放有增加的趨勢，所用SV法完全可以作為CBD法的補充或者替代方法，特別適用于CBD法無法使用的小鼠，豐富了小鼠胰島分離的可選技術，提高了分率成功率。


圖1是小鼠胰島細胞形態(tài)圖，其中圖1a為CBD法分離的胰島細胞，圖1b為SV法分離的胰島細胞。圖2是采用SV法分離出可以貼壁的胰島細胞形態(tài)圖。圖3是采用SV法和CBD法分離得到的胰島細胞的凋亡率對比圖。圖4是采用SV法和CBD法分離得到的胰島細胞在高糖刺激下的胰島素分泌能力對比圖。圖5是移植小鼠血糖水平對比圖。圖6是采用SV法和CBD法分離得到的胰島細胞移植成活的免疫熒光圖。
具體實施例方式下面結合實施例，對本發(fā)明作進一步說明實施例所用到的試劑
Hank，s 液Hank’ s 鹽平衡液(HBSS, GIBCO, cat. no. 14025)；膠原酶溶液膠原酶XI (Sigma, cat. no. C7657),濃度為 O. 4-0. 5mg/mL ;梯度離心液梯度離心液1077 (SIGMA, cat. No. 10771)；麻藥戊巴比妥鈉；膠原酶充盈液將XI型膠原酶溶至hank’s液中至終濃度為O. 5mg/mL,并吸取ImL加入15mL離心管備用；分離液將牛白蛋白加入hank’ s液中，終濃度為1%。實施例所用到的器械設備解剖顯微鏡、37°C水浴箱、離心機(Eppendorf，5810R)、 5-mL 注射器套管針(BDIntima II，cat. No. 383408)、40 目篩網(wǎng)(Bel Ico Glass, Inc, Catno.1985-00040)。實施例1(I)手術操作小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉溶液麻醉(45mg/kg體重)，一旦充分麻醉，采用75%的酒精消毒皮膚，然后沿腹正中線做切口，充分暴露胰腺。(2)胰腺充盈剪斷膈脾韌帶和胃脾韌帶以游離脾部胰腺，同時剪開降結腸和直腸與胰腺之間的韌帶組織；將脾部胰腺從左側水平翻轉至右側，可以清楚的看到位于胰腺背面且位置表淺的脾靜脈。用止血鉗在脾靜脈和脾交界處夾閉防止膠原酶溶液灌入脾臟。切開橫膈膜，并且把心臟剪破以終止胰腺的血供；在解剖顯微鏡下，在脾靜脈與門靜脈交匯處將24G套管針穿入脾靜脈。緩慢注入1-2毫升膠原酶充盈液直至脾部胰腺完全充盈；將充盈好的脾部胰腺從腹腔中游離下來并放入預置了 I毫升膠原酶充盈液的15毫升離心管中。(3)胰腺消化將15毫升離心管放入37. 5°C水浴箱中靜止消化15分鐘。消化過程中用手振蕩離心管2-3次。通過加入預冷的IOmL Hank’s液來終止消化。4°C下1000轉離心30秒,棄上清。重新加入IOmL預冷的Hank’ s液，4°C下1000轉離心30秒,棄上清。(4)胰島純化加入IOmL Hank’ s液重懸沉淀，并將重懸液通過40目篩網(wǎng)以除去脂肪等無法消化的大塊組織。用15mL離心管收集濾液，4°C下1000轉離心30秒，棄上清；用5mL梯度離心液重懸沉淀,吹打混勻。然后緩慢加入5mLHank’ s液,形成明顯的上下分層。1500轉離心20分鐘(此時胰島位于上清液中)；將上清液轉移至新的15mL離心管中，1000轉離心30秒，棄上清，并加入5mL分離液至離心管中。(5)手撿在體式顯微鏡下，用20微升移液器手撿胰島并培養(yǎng)。小鼠胰島細胞對比測試結果采用以上實施例分離純化小鼠胰島細胞的方法(以下簡稱SV法)和傳統(tǒng)的CBD法進行對比測試試驗，具體如下(I)胰島細胞形態(tài)圖1為小鼠胰島細胞形態(tài)圖，其中圖1a為CBD法分離的胰島細胞，圖1b為SV法分離的胰島細胞，從圖中可看成，使用SV法分離得到的胰島在形態(tài)上與傳統(tǒng)的CBD法所分離的胰島沒有明顯差別。經(jīng)過I天的體外培養(yǎng)，大多數(shù)SV法所分離的胰島可以正常貼壁，如圖2所示，表明胰島可以從惡劣的胰島分離步驟中恢復活性。(2)胰島細胞的凋亡比率將分離到的胰島打散成單個細胞，并通過流式細胞儀統(tǒng)計細胞的凋亡比率，結果如圖3顯示，采用CBD法和SV法兩種方法所分離到的胰島在凋亡比率上沒有明顯的差異。(3)胰島細胞對高糖刺激的反應性
高糖刺激的胰島素分泌實驗是比較公認的檢測胰島分泌功能狀態(tài)的實驗方法，具體結果如圖4所示，兩種方法所分離的胰島在對高糖刺激的反應性沒有明顯差異，而且實驗結果表明，SV法分離得到的胰島在高糖刺激下胰島素釋放有增加的趨勢。(4)胰島細胞移植測試為了觀察SV法所分離的胰島能否在胰島移植中應用，將兩種方法所分離的胰島分別移植至STZ糖尿病小鼠的腎包膜下(n=4)，在移植后第14天開始連續(xù)6天上午10點鐘監(jiān)測隨機血糖。兩組小鼠均可以恢復至正常血糖，各時間點均沒有明顯差異。具體如圖5所示，兩種方法分離出的胰島細胞均可以有效的降低糖尿病小鼠的血糖。所以，當CBD法無法使用時，SV法成為最佳的替代方法，通過SV法可以同樣獲得高活性的小鼠胰島，極大的提高了小鼠分離成功率。圖6為免疫熒光圖為腎組織切片，圖中顯示，采用CBD法和SV法兩種方法所分離到的小鼠胰島細胞均移植成活，并且兩種方法分離的胰島在腎包膜下的形 態(tài)沒有明顯差異。
權利要求
1.一種小鼠胰島細胞的分離純化方法，其步驟包括 (1)胰腺充盈將小鼠麻醉、皮膚消毒后沿腹正中切開，充分暴露胰腺；剪斷與脾部胰腺相連接的韌帶組織，將脾靜脈和脾交界處夾閉并剪破心臟，在脾靜脈與門靜脈交匯處進針至脾靜脈，注射膠原酶充盈液；將充盈好的脾部胰腺從腹腔中游離下來后浸泡在膠原酶充盈液中； (2)胰腺消化將步驟(I)中得到的胰腺用膠原酶溶液水浴消化，并加入Hank’s液后離心分離，取沉降物。
(3)分離純化在步驟(2)中得到的沉降物經(jīng)過重懸沉淀、過濾、離心處理后得到小鼠胰島細胞。
2.根據(jù)權利要求1所述的小鼠胰島細胞的分離純化方法，其特征在于所述步驟(I)中，將小鼠麻醉所注射的麻藥劑量與小鼠體重比為45-60mg :1kg。
3.根據(jù)權利要求1所述的小鼠胰島細胞的分離純化方法，其特征在于所述步驟(I)中的膠原酶充盈液為含有XI型膠原酶的hank’s液，其中XI型膠原酶濃度為O. 4-0. 5mg/mL。
4.根據(jù)權利要求3所述的小鼠胰島細胞的分離純化方法，其特征在于所述步驟(I)中的膠原酶充盈液注射量為l_2mL。
5.根據(jù)權利要求1所述的小鼠胰島細胞的分離純化方法，其特征在于所述步驟(2)中水浴溫度為37°C -37. 5°C。
6.根據(jù)權利要求1所述的小鼠胰島細胞的分離純化方法，其特征在于所述步驟(2)中膠原酶溶液中XI型膠原酶的濃度為O. 4-0. 5mg/mL。
7.根據(jù)權利要求1所述的小鼠胰島細胞的分離純化方法，其特征在于所述步驟(3)中，將沉降物中加入Hank’s液后重懸沉淀、過濾，將濾液離心分離并取沉降物；在沉降物中加入梯度離心液重懸沉淀，加入Hank’ s液離心分離，取上清液離心分離后在沉降物中加入分離液，手撿得到小鼠胰島細胞。
8.根據(jù)權利要求6所述的小鼠胰島細胞的分離純化方法，其特征在于所述分離液為牛白蛋白與hank’ s液的混合液，該混合液中牛白蛋白的濃度為1%_1. 5%。
全文摘要
本發(fā)明屬于細胞分離技術領域，特別涉及一種小鼠胰島細胞的分離方法，將小鼠麻醉、皮膚消毒后沿腹正中切開，充分暴露胰腺；剪斷與脾部胰腺相連接的韌帶組織，將脾靜脈和脾交界處夾閉并剪破心臟，在脾靜脈與門靜脈交匯處進針至脾靜脈，注射膠原酶充盈液；將充盈好的脾部胰腺從腹腔中游離下來后浸漬在膠原酶充盈液中。將胰腺膠原酶溶液水浴消化，并加入Hank’s液后離心分離，取沉降物。將沉降物經(jīng)過重懸沉淀、過濾、離心處理后得到小鼠胰島細胞。本發(fā)明的小鼠胰島細胞分離純化的方法在操作上簡單、易行，而且所分離到的胰島細胞在形態(tài)上和功能上和CBD法沒有明顯差異，豐富了小鼠胰島分離的可選技術，提高了分離功率。
文檔編號C12N5/071GK103013907SQ20121056347
公開日2013年4月3日 申請日期2012年12月21日 優(yōu)先權日2012年12月21日
發(fā)明者寧光, 李峰, 曹亞南, 姜秀麗 申請人:上海市內(nèi)分泌代謝病研究所