專(zhuān)利名稱(chēng)：一種木聚糖酶及表達(dá)木聚糖酶的重組工程菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種木聚糖酶及表達(dá)該木聚糖酶的重組工程菌。
背景技術(shù)：
木聚糖酶是可將木聚糖降解成木糖和低聚糖的一類(lèi)酶的總稱(chēng)，通常所說(shuō)的木聚糖酶即內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶，內(nèi)切β-1，4-木聚糖酶作用于木聚糖主鏈，隨機(jī)切開(kāi)木聚糖內(nèi)部的木糖苷鍵，將其分解為低聚糖。不同來(lái)源木聚糖酶的組成和性質(zhì)不完全相同，但理化性質(zhì)存在相似性，如相對(duì)分子質(zhì)量在O. 8萬(wàn)-14. 5萬(wàn)、pH在3-10范圍內(nèi)穩(wěn)定，最適范圍為4_7 ；不同來(lái)源木聚糖酶等電點(diǎn)在3-10 ;不同來(lái)源的木聚糖酶氨基酸組成相差不大等。
小麥和玉米等植物性原料中含有大量非淀粉多糖，特別是阿拉伯木聚糖，而它不能被單胃動(dòng)物利用。當(dāng)木聚糖進(jìn)入畜禽小腸后，部分溶于水，使得食糜含水量增加，從而使小腸內(nèi)容物的黏度增加，阻礙了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和消化酶的結(jié)合及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在小腸黏膜上的吸收，另外食糜黏度的增加抑制了內(nèi)源消化酶的活性，降低了食糜的通過(guò)速率；不溶性木聚糖包裹營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也阻礙了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的釋放，降低了營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用率。眾多研究表明添加木聚糖酶能降解木聚糖、減少微生物定植并維持腸道正常結(jié)構(gòu)，提高動(dòng)物體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用率(梁永，2012)。Panbangred和Fukusaki (1985)首次利用大腸桿菌表達(dá)矮小芽抱桿菌(Bacilluspumilus Ι0Ρ) β-木聚糖酶。隨后已有數(shù)十種不同來(lái)源的木聚糖酶基因在原核生物表達(dá)系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)了表達(dá)。目前，對(duì)木聚糖酶在不同真核系統(tǒng)中的表達(dá)也進(jìn)行了研究。應(yīng)用最普遍的真核表達(dá)系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、動(dòng)物乳腺表達(dá)系統(tǒng)、絲狀真菌外源表達(dá)系統(tǒng)等。研究證實(shí)，酵母表達(dá)系統(tǒng)作為成熟的表達(dá)系統(tǒng)已使多種不同來(lái)源的木聚糖酶實(shí)現(xiàn)了聞效表達(dá)(張紅連等，2003 ；Moreau等，1992)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種木聚糖酶及其重組表達(dá)工程菌，即利用基因工程技術(shù)手段，將煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，構(gòu)建畢赤酵母工程菌株。該菌株能高效表達(dá)木聚糖酶，且生產(chǎn)的木聚糖酶在中性偏酸性條件下具有較高的活性，可廣泛應(yīng)用于飼料添加劑領(lǐng)域。本發(fā)明一方面涉及一種從煙曲霉(Aspergillus fumigatus)中分離的木聚糖酶，其特征在于I)氨基酸序列為SEQ ID NO 1的木聚糖酶；2)在SEQ ID NO 1中限定的氨基酸中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有煙曲霉的木聚糖酶功能的，由SEQ ID NO :1衍生的蛋白質(zhì)。上述的煙曲霉的木聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列為SEQ ID NO :2。本發(fā)明還提供用于表達(dá)上述木聚糖酶的重組表達(dá)載體；所述的重組表達(dá)載體攜帶有序列為SEQ ID NO : 2的編碼基因。本發(fā)明另一個(gè)方面涉及一種用于表達(dá)上述木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，該工程菌攜帶有表達(dá)煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的木聚糖酶基因的表達(dá)載體；該畢赤酵母(Pichia pastoris) ZHEl菌株，已于2012年12月5日保藏于位于武漢洛珈山武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NO :M2012504。本發(fā)明另一方面涉及上述畢赤酵母工程菌的應(yīng)用，用于生產(chǎn)木聚糖酶。本發(fā)明構(gòu)建的畢赤酵母工程菌能高效表達(dá)煙曲霉的木聚糖酶基因，搖瓶發(fā)酵酶活達(dá)到277U/ml。本發(fā)明的重組木聚糖酶在中性偏酸性范圍內(nèi)具有較高的酶活，最適pH值為6.0，在pH 5. 0-7. O的范圍內(nèi)能保持80%以上的活性；最適反應(yīng)溫度為55°C，在溫度40-60°C的范圍內(nèi)，能保持50%以上的活性。通過(guò)在日糧中添加本發(fā)明的木聚糖酶，肉雞的只采食量、只增重分別提高了 5. 7%U2. 2% ;糞樣中能量含量、蛋白含量比對(duì)照組分別降低了 0.7^^2% ;表觀能量利用率提高了 2. 1%，蛋白質(zhì)表觀利用率提高了 6.6%。本發(fā)明的 木聚糖酶可有效提高飼料中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率，從而節(jié)約糧食資源和養(yǎng)殖成本，增加生產(chǎn)效益。


圖1 :PCR擴(kuò)增瓊脂糖凝膠電泳圖。圖2 :畢赤酵母工程菌發(fā)酵上清液SDS-PAGE電泳圖，箭頭所指處為重組木聚糖酶。圖3 :重組木聚糖酶的作用pH-相對(duì)酶活曲線。圖4 :重組木聚糖酶的作用溫度-相對(duì)酶活曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)例對(duì)本發(fā)明的方法做進(jìn)一步說(shuō)明，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通?？砂闯Ｒ?guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫(xiě)的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。本領(lǐng)域相關(guān)的技術(shù)人員可以借助實(shí)施例更好地理解和掌握本發(fā)明。但是，本發(fā)明的保護(hù)和權(quán)利要求范圍不限于所提供的案例。實(shí)施例1煙曲霉木聚糖酶基因的克隆1.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)NCBI GenBank號(hào)為XM746007.1上基因序列設(shè)計(jì)引物，上游引物為5’AAATACGTAACACCCGGCTCGGAGCAATAC 3’ ；下游引物為5’ AAGCCTAGGCTAAAAACAGTGATAGTAGC 3，。1. 2目的基因ZHEl的PCR擴(kuò)增以煙曲霉基因組cDNA為模板，利用上下游引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4min，94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸40s，30個(gè)循環(huán)后，72°C延伸lOmin。凝膠回收試劑盒回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，命名為ZHE1，瓊脂糖凝膠電泳(圖1)分析顯示，產(chǎn)物大小為609bp。1.3目的基因測(cè)序驗(yàn)證將擴(kuò)增產(chǎn)物ZHFl克隆至pMDlS-T載體，送至北京華大基因測(cè)序中心進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得ZHFl的核苷酸序列為SEQ ID NO :2，其編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :1。通過(guò)NCBI同源序列比對(duì)，確定擴(kuò)增的基因?yàn)槟揪厶敲富?。?shí)施例2畢赤酵母工程菌的構(gòu)建2.1表達(dá)載體的構(gòu)建將擴(kuò)增得到的木聚糖酶基因ZHEl片段，用快速限制性?xún)?nèi)切酶Avrll、SnaBI進(jìn)行雙酶切，IOOuL 酶切體系為PCR 產(chǎn)物 30uL, IOXbuffer IOuL, AvrII5uL, SnaBI 5uL, ddH2050uL。37°C酶切2h后，瓊脂糖凝膠電泳回收片段。將表達(dá)載體pPIC9k用快速限制性?xún)?nèi)切酶AvrI1、SnaBI進(jìn)行雙酶切，IOOuL酶切體系為載體 25uL，IOXbuffer IOuL，AvrII 5uL, SnaBI 5uL, ddH20 55uL。37°C酶切 2h 后，瓊脂糖膠電泳回收片段。將經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶AvrII和SnaBI雙酶切的ZHEl片段和pPIC9k載體相連接構(gòu) 建表達(dá)載體pPIC9k-ZHEl。12uL連接體系為ZHE1片段為3. 5uL，pPIC9k載體為6. 5uL，10XT4DNA ligase bufferl. 2uL, T4 DNA ligase O. 8uL。22 °C 連接 5Η，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂布含氨芐青霉素終濃度100ug/mL的LB平板，37°C過(guò)夜培養(yǎng)。挑取轉(zhuǎn)化子測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到LB液體培養(yǎng)基中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)，提質(zhì)粒，即為重組酵母表達(dá)質(zhì)粒PPIC9K-ZHE1。2. 2畢赤酵母工程菌的構(gòu)建及驗(yàn)證將pPIC9K-ZHEl用PmeII進(jìn)行線性化，線性化片段用柱純化試劑盒純化后，通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生長(zhǎng)出的菌落即為畢赤酵母工程菌株。挑取單個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接于BMGY培養(yǎng)基中，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)Id后，再轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中，30°C，250rpm振蕩培養(yǎng)，每天添加O. 5%的甲醇。誘導(dǎo)表達(dá)4d后，離心去除菌體，將上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，工程菌表達(dá)的木聚糖酶分子量為20kDa左右，圖2中箭頭所指處即為重組木聚糖酶。將該陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子命名為畢赤酵母ZHEl (Pichia pastoris ZHE1)，并于2012年12月5日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M2012504。將上清液進(jìn)行木聚糖酶活力測(cè)定，結(jié)果顯示，搖瓶水平下保藏的工程菌中木聚糖酶的表達(dá)量達(dá)到277U/ml，從而證明該菌株能夠高效的表達(dá)重組木聚糖酶。而且，連續(xù)傳代也沒(méi)有出現(xiàn)轉(zhuǎn)入的載體丟失的現(xiàn)象。酶活力檢測(cè)方法取2ml濃度為I %的木聚糖底物(pH5. 5乙酸-乙酸鈉緩沖液配制)，加入到比色管中，37°C平衡lOmin，再加入2ml經(jīng)pH5. 5乙酸乙酸鈉緩沖液適當(dāng)稀釋并經(jīng)37°C平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混勻于37°C精確保溫反應(yīng)30min。反應(yīng)結(jié)束后，加入5ml DNS試劑，混勻以終止反應(yīng)。然后沸水浴煮沸5min，用自來(lái)水冷卻至室溫，加蒸餾水定容至25ml，混勻后，以標(biāo)準(zhǔn)空白樣為空白對(duì)照，在540nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)F。酶活單位定義在37°C、pH值為5. 5的條件下，每分鐘從濃度為5mg/ml的木聚糖溶液中釋放
Iμ mol還原糖所需要的酶量即為一個(gè)酶活力單位U。酶活計(jì)算公式
.[(/], — Ar ) X K + I ,, ,xlF iX N X 1000
Mxt
式中XD為稀釋酶液中木聚糖酶的活力，U/ml ;AF為酶反應(yīng)液的吸光度；AB為酶空白液的吸光度；K為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；(；為標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距；Μ為木糖的摩爾質(zhì)量，150. 2g/mol ；t為酶解反應(yīng)時(shí)間，min ;N為酶液稀釋倍數(shù)；1000為轉(zhuǎn)化因子，Immol=IOOO μ mol。實(shí)施例3木聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定3.1最適反應(yīng)pH的測(cè)定采用pH值分別為2. 0,3. 0,4. 0,5. 0,6. 0,7. 0,8. O的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液，
將發(fā)酵的上清液進(jìn)行稀釋測(cè)定，木聚糖底物也分別用對(duì)應(yīng)PH值的緩沖液配制，在37°C下分別進(jìn)行木聚糖酶活力測(cè)定，計(jì)算酶活，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做pH-相對(duì)酶活曲線。結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明的重組木聚糖酶最適反應(yīng)pH值為6. 0，為酸性木聚糖酶。3. 2最適反應(yīng)溫度的測(cè)定在ρΗ5· 5 條件下，分別測(cè)定 30°C、35 V、40°C、45 V、50°C、55 V、60 V、65 V溫度時(shí)
發(fā)酵上清液的木聚糖酶活力，以最高酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活，做溫度相對(duì)酶活曲線。結(jié)果如圖4所示，本發(fā)明生產(chǎn)的木聚糖酶最適反應(yīng)溫度為55°C。3. 3溫度耐受性測(cè)定用PH5. 5的乙酸-乙酸鈉緩沖液稀釋發(fā)酵上清液，木聚糖底物也用對(duì)應(yīng)pH值的緩沖液配制。在651、701、751下分別處理21^11和5min，然后在37°C，pH5. 5的條件下測(cè)定酶活，以未處理的酶活為100%，計(jì)算相對(duì)酶活。結(jié)果如表I所示，65°C處理2min后，木聚糖酶的殘余酶活為22. 61%，70°C處理2min后，殘余酶活為5. 08%，75°C處理后，無(wú)酶活。表I重組木聚糖酶溫度耐受性檢測(cè)表
權(quán)利要求
1.一種木聚糖酶，其特征在于 1)氨基酸序列為SEQID NO:1的木聚糖酶； 2)在SEQID NO:1中限定的氨基酸中經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有煙曲霉的木聚糖酶功能的，由SEQ ID N0:1衍生的蛋白質(zhì)。
2.用于編碼權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的編碼基因，其核苷酸序列為SEQID N0:2。
3.用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的重組表達(dá)載體；所述的重組表達(dá)載體攜帶有序列為SEQ ID NO:2的編碼基因。
4.一種用于表達(dá)權(quán)利要求1所述的木聚糖酶的畢赤酵母工程菌，其保藏編號(hào)為CCTCCNO: M2012504。
5.權(quán)利要求4所述的畢赤酵母工程菌在生產(chǎn)木聚糖酶中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種木聚糖酶及其重組表達(dá)工程菌。本發(fā)明通過(guò)將煙曲霉的木聚糖酶基因轉(zhuǎn)化入畢赤酵母中，構(gòu)建得到畢赤酵母工程菌，保藏編號(hào)為CCTCC NO: M 2012504。該工程菌能高效分泌表達(dá)木聚糖酶，搖瓶發(fā)酵酶活高達(dá)277U/mL。重組木聚糖酶在中性偏酸性范圍內(nèi)具有較高的酶活，最適pH值為6.0，在pH 5.0-7.0的范圍內(nèi)能保持80%以上的活性；最適反應(yīng)溫度為55℃，在溫度40-60℃的范圍內(nèi)，能保持50%以上的活性。本發(fā)明的重組木聚糖酶可廣泛用作飼料添加劑，能有效提高營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的利用率。
文檔編號(hào)C12N1/19GK103013958SQ20121056284
公開(kāi)日2013年4月3日 申請(qǐng)日期2012年12月21日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月21日
發(fā)明者肖志壯, 張霞, 王海, 李冬冬 申請(qǐng)人:青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司