專利名稱：一種重組表達(dá)質(zhì)粒及其在制備抗腫瘤免疫基因治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物制藥領(lǐng)域中的基因藥物，特別是涉及一種可激活機(jī)體免疫反應(yīng)并具有抗腫瘤效果的抗腫瘤免疫基因治療藥物。
背景技術(shù)：
惡性腫瘤的免疫耐受除了與腫瘤細(xì)胞本身特征性低表達(dá)主要組織相容性抗原和協(xié)同刺激分子如B7. I、CD86等外，還與腫瘤所處的微環(huán)境有密切關(guān)系。在腫瘤微環(huán)境中存在大量免疫抑制性細(xì)胞因子如IL-10、腫瘤生長(zhǎng)因子β等，腫瘤細(xì)胞正是通過(guò)微環(huán)境中細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的調(diào)節(jié)來(lái)逃避抗腫瘤免疫反應(yīng)(Coussens LM, Werb Z. Inflammation andCancer[J]. Nature,2002,420(6917) :860-7 ；6abrilovich D. Mechanisms and functionalsignificance of tumour-induced dendritic-cell defects[J]. Nat Rev Tmmunol,2004,4(12) :941-52.)。因此，可以通過(guò)改變腫瘤微環(huán)境中的細(xì)胞因子來(lái)影響腫瘤的免疫微環(huán)境，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞的免疫反應(yīng)。腫瘤的免疫基因治療就是基于以上原因逐步發(fā)展起來(lái)的。免疫基因治療實(shí)際上是遞送某些細(xì)胞因子基因或共刺激分子基因進(jìn)入腫瘤細(xì)胞或體細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)這些基因在體內(nèi)的表達(dá)來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的免疫微環(huán)境，激發(fā)或調(diào)動(dòng)機(jī)體免疫功能從而控制或殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，免疫基因治療因?yàn)槠淞己玫陌踩院陀行砸殉蔀槟[瘤免疫治療研究中的常用方法。人們對(duì)腫瘤的免疫基因治療已經(jīng)進(jìn)行了大量的研究，最初選擇單一的細(xì)胞因子基因介導(dǎo)免疫治療，之后逐步向具有協(xié)同作用的免疫調(diào)節(jié)因子基因聯(lián)合應(yīng)用的方向發(fā)展(Tatsumi T, Takehara T, Kanto T, et al. B7-1 (CD80)-gene transfer combinedwith interleukin_12administration elicits protective and therapeuticimmunity against mouse hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,1999,30(2)422-9. ；Hofbauer GF, Baur T, Bonnet MC, et al. Clinical phase I intratumoraladministration of two recombinant ALVAC canarypox viruses expressing humangranulocyte-macrophage colony-stimulating factor or interleukin-2 thetransgene determines the composition of the inflammatory infiltrate [J].Melanoma Res，2008，18 (2) :104-11.)。其中，可用于免疫調(diào)節(jié)因子基因聯(lián)合應(yīng)用的研究有B7. I與IL-12在小鼠模型中能夠產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)(Tatsumi T, Takehara T, Kanto T, et al. B7-1 (CD80)-gene transfer combined withinterleukin-I2administration elicits protective and therapeutic immunityagainst mouse hepatocellular carcinoma[J]. Hepatology,1999,30 (2) :422-9. ；LeeYS, Kim JH, Choi KJ, et al.Enhanced antitumor effect of oncolytic adenovirusexpressing interIeukin-I2and B7—1 in an immunocompetent murine model.Clin Cancer Res. 2006 Oct I ；12(19) :5859-68.) ；GM-CSF 和 IL-2 聯(lián)合應(yīng)用能夠在局部產(chǎn)生生物學(xué)和免疫學(xué)效果(Hofbauer GF, Baur T, Bonnet MC, et al. Clinicalphase I intratumoral administration of two recombinant ALVAC canarypoxviruses expressing human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor orinterleukin-2 the transgene determines the composition of the inflammatoryinfiltrate. Melanoma Res. 2008 ；18(2) :104-11. )GM_CSF 與 B7. I 聯(lián)合應(yīng)用能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)(Choi KJ, Kim JH, Lee YS, et al. Concurrent delivery ofGM-CSF and B7—1 using an oncolytic adenovirus elicits potent antitumor effect.Gene Ther. 2006Jul ；13(13) :1010-20. ；Sumimoto H, Tani K, Nakazaki Y, et al. GM-CSFand B7~l (CD80)co-stimulatory signals co-operate in the induction of effectiveanti-tumor immunity in syngeneic mice[J].Int J Cancer,1997,73 (4) :556-61.)；病毒載體形式的IL-12和GM-CSF基因聯(lián)合不僅能夠發(fā)揮協(xié)同作用產(chǎn)生更強(qiáng)的抗腫瘤免疫還能夠預(yù)防胸腺萎縮(Zhang SN, Choi IK, Huang JHChoi KJ, et al. OptimizingDC vaccination by combination with oncolytic adenovirus coexpressingIL-12and GM-CSF. Mol Ther. 201IAug ；19(8) :1558-68. Zhang SN, Choi IK, Kim JS，YunCO.Strengthening of antitumor immune memory and prevention of thymic atrophymediated by adenovirus expressing IL_12and GM-CSF. Gene Ther. 201IOct 13. [Epub ahead of print])。雖然文獻(xiàn)已證實(shí)IL_12，GM_CSF和B7. I其中兩兩之間可以分別聯(lián)合應(yīng)用，但顯然其較更多細(xì)胞因子的聯(lián)合應(yīng)用仍有局限性，而尋找更多因子聯(lián)合應(yīng)用以及聯(lián)合方式是研究者的新課題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種使用多細(xì)胞因子進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)的重組表達(dá)質(zhì)粒及其應(yīng)用，例如提供一種可激活機(jī)體免疫反應(yīng)并具有抗腫瘤效果的抗腫瘤免疫基因治療藥物。本發(fā)明提供的重組表達(dá)質(zhì)粒，其同時(shí)攜帶人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因。其中所述人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因在載體中的位置為自上游至下游依次為人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因，所述GM-CSF基因與B7. I基因通過(guò)linker相聯(lián)構(gòu)成融合基因，并通過(guò)IRES序列與IL-12基因相連。用于構(gòu)建所述重組表達(dá)質(zhì)粒的出發(fā)載體為任意一種可在哺乳動(dòng)物表達(dá)外源基因的真核表達(dá)載體，如 pVAXl、pSilencel. 0-U6 (Ambion, Austin, TX, USA)、pEGFP_Nl (ClonTech公司)、pCMV (Stratagene 公司)、pSV40 (Marker Gene 公司)、pSI、pCI、pCI-neo (Promega公司)、pPICZ a、pTEFl、pcDNA3. I 或 pcDNA (Invitrogen 公司)。WpVAXl為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pVAX-IL-12-GB。本發(fā)明所提供的抗腫瘤免疫基因治療藥物，其活性成分為上述攜帶人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的重組表達(dá)質(zhì)粒。在所述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑和表面活性劑。本發(fā)明同時(shí)提出利用前述重組表達(dá)質(zhì)粒制備腫瘤免疫基因治療藥物的方案。采取以上技術(shù)方案，本發(fā)明的有益效果
本發(fā)明抗腫瘤免疫基因治療藥物的活性成分為命名為pVAX-IL-12-GB的重組表達(dá)質(zhì)粒，是將人IL-12、GM-CSF和B7. I三種免疫調(diào)節(jié)因子基因克隆到同一質(zhì)粒DNA載體PVAXI中，通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)實(shí)現(xiàn)上、下游基因的共同表達(dá)，將該載體導(dǎo)入宿主，能夠同時(shí)表達(dá)人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12、GM-CSF和B7. 1，這是因?yàn)镮RES序列可以使上、下游兩個(gè)基因翻譯在同一條mRNA，因而表達(dá)出的蛋白在時(shí)間和空間上接近，人IL-12基因位于IRES的上游，融合基因GM-CSF-B7. I位于IRES下游，在GM-CSF和B7. I兩種蛋白間加入一個(gè)表達(dá)8肽的I inker,可以被細(xì)胞內(nèi)一種普遍存在蛋白酶-furin識(shí)別并切斷,使GM-CSF和B7. I分子分離，從而不影響它們的空間構(gòu)象，以利于發(fā)揮各自的生物學(xué)效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明藥物的活性成分IL-12、GM-CSF和B7. I三種免疫調(diào)節(jié)因子基因可在真核細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，同時(shí)采用電穿孔的方式注射小鼠證實(shí)其可以在活體內(nèi)表達(dá)。本發(fā)明是一種新型抗腫瘤免疫基因治療劑，多種抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)因子聯(lián)合應(yīng)用，能夠發(fā)揮彼此間的協(xié)同刺激作用，更好的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，為進(jìn)一步開展腫瘤免疫基因治療研究 奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，應(yīng)用前景廣闊。


圖I為重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的雙酶切和PCR鑒定結(jié)果圖2為轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的293T細(xì)胞的IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果圖3為轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的293T細(xì)胞的IL-12基因基因的蛋白表達(dá)水平的ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)結(jié)果圖4為檢測(cè)轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的細(xì)胞的GM-CSF基因的蛋白表達(dá)水平的ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)結(jié)果圖5為轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的細(xì)胞中B7. I的蛋白表達(dá)水平的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果圖6為轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的細(xì)胞中B7. I的蛋白表達(dá)水平的熒光顯微鏡下圖片圖7為質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB通過(guò)電穿孔遞送后動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)驗(yàn)證的免疫組化染色
結(jié)果
具體實(shí)施例方式實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下述實(shí)施例中所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方法。實(shí)施例I、重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的制備本發(fā)明抗腫瘤免疫基因治療藥物的活性成分為攜帶人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB，在該質(zhì)粒中，人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因在載體中的位置為自上游至下游依次為人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因，所述GM-CSF基因與B7. I基因通過(guò)linker相聯(lián)構(gòu)成融合基因(GM-CSF-B7. I)，并通過(guò)IRES序列與IL-12基因相連，即自IRES上游為IL-12基因、IRES下游為融合基因GM-CSF-B7. I。質(zhì)粒的構(gòu)建方法如下將含有人IL-12基因的pCI-IL-12質(zhì)粒(構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)王偉，高江平，于繼云等.人白細(xì)胞介素12雙亞基共表達(dá)pVAXl-IRES-hIL12載體的構(gòu)建與表達(dá)[J].軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31 (6) 600-3)先用 BssHII 酶(New England Biolabs 公司)單酶切，Klenown I 酶(New England Biolabs 公司)補(bǔ)平回收后再用 Nhe I 酶(New EnglandBiolabs公司)單酶切，得到一平一粘的人IL-12基因片段，將攜帶IRES序列和由GM-CSF基因和B7. I基因組成的融合基因GM-CSF-B7. I (該融合基因是將GM-CSF基因與B7. I基因是通過(guò)linker相聯(lián)構(gòu)成的，linker序列為GGCGGCAGGGGTCGACGCGGCGGC(序列表中序列I))的載體pVAX-IRES-GM-CSF-B7. I (簡(jiǎn)稱pVAX_IRES_GB，構(gòu)建方法參見文獻(xiàn)劉寧，閻瑾琦，冉多良等.腫瘤基因疫苗免疫增效載體PVAX1-IRES-GM/B7的構(gòu)建與表達(dá)[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊，2008，32 (3) =249-52)先用Cla I酶單酶切，再用Klenown I酶補(bǔ)平后用NheI酶單酶切得到一平一粘的載體片段，最后將兩個(gè)片段用T4DNA連接酶(TaKaRa公司或New England Biolabs)連接后轉(zhuǎn)化入E. coli. DH5 α感受態(tài)大腸桿菌,用含50 μ g/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)平板進(jìn)行篩選，挑取陽(yáng)性克隆，提質(zhì)粒(用北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司的質(zhì)粒小量提取試劑盒)，用限制性內(nèi)切酶Nhe I和Pme I進(jìn)行雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖I所示(Ml. DNA Marker (DL 5000) ；1.質(zhì)粒 pVAX-IL_12_GB ;2·質(zhì)粒 pVAX-IL_12_GB 的 Nhe I 和Pme I雙酶切產(chǎn)物；M2. DNA Marker (DL 2000))，經(jīng)酶切獲得了 4000bp的通過(guò)IRES序列相連的IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的融合基因(GM-CSF-B7. I)片段和3000bp的載體片段，與預(yù)期結(jié)果相符，再對(duì)IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的融合基因(GM-CSF-B7. I)片段進(jìn)行PCR鑒定，IL-12基因的PCR鑒定引物為上游引物Fl :5’-ATCGATCTAGCCACCATGGAGACAGAC-3’(序列表中序列 2)和下游引物 Rl :5’-GCGCGCTAACTGCAGGGCACAGATGC-3’(序列表中序列3) ,GM-CSF基因和B7. I基因的融合基因(GM-CSF-B7. I)的PCR鑒定引物為上游引物F2 5，-ATGGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGC-3 ’(序列表中序列 4)和下游引物R2 5，-TTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTCTCAATCTC-3 ’(序列表中序列 5)(所用 PCR 弓丨物均由Invitrogen公司合成)，PCR反應(yīng)條件為先94°C預(yù)變性5min ;然后94°C變性30s，58°C退火30s，72°C延伸lmin，共30個(gè)循環(huán)。PCR鑒定結(jié)果如圖I所示(Ml. DNA Marker (DL5000) ；1.質(zhì)粒 pVAX-IL-12-GB ;3. IL-12 基因的 PCR 鑒定結(jié)果；M2. DNA Marker (DL 2000)),PCR可以擴(kuò)增出1800bp的IL-12基因片段和1200bp的GM-CSF-B7. I融合基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明經(jīng)擴(kuò)增依次獲得了 1800bp的IL-12基因片段和1200bp的GM-CSF基因和B7. I基因融合基因(GM-CSF-B7. I)片段，與預(yù)期結(jié)果相符，最后將經(jīng)酶切鑒定和PCR鑒定正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送英駿生物技術(shù)公司進(jìn)行測(cè)序分析，測(cè)序結(jié)果表明獲得了序列及插入位置均正確的依次攜帶人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因，并且GM-CSF基因和B7. I基因構(gòu)成融合基因(GM-CSF-B7. I)，并通過(guò)IRES序列與IL-12基因相連的重組表達(dá)質(zhì)粒，命名為pVAX-IL-12-GB，即為本發(fā)明所述抗腫瘤免疫基因治療藥物的活性成分。本實(shí)施例構(gòu)建的pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒，特別設(shè)計(jì)使用IRES序列以使上、下游兩個(gè)基因翻譯在同一條mRNA，人IL-12基因位于IRES的上游，融合基因GM-CSF-B7. I位于IRES下游，因而使表達(dá)出的蛋白在時(shí)間和空間上接近；在GM-CSF和B7. I兩種蛋白間加入一個(gè)表達(dá)8肽的I inker,可以被細(xì)胞內(nèi)一種普遍存在蛋白酶-furin識(shí)別并切斷，使GM-CSF和B7. I分子分離，從而不影響它們的空間構(gòu)象，以利于發(fā)揮各自的生物學(xué)效應(yīng)。本申請(qǐng)以后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證該pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒設(shè)計(jì)的獨(dú)特性和有效性。實(shí)施例2、檢測(cè)轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的細(xì)胞中IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因的表達(dá)水平一、將pVAX-IL-12-GB重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞將轉(zhuǎn)染有pVAX-IL-12-GB重組表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌液接種于200mL LB液體培養(yǎng)基中，在37°C下培養(yǎng)200rpm振蕩12小時(shí)，大量提取pVAX_IL-12_GB超純質(zhì)粒(用天根生化科技公司的無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大量提取試劑盒)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的293T細(xì)胞提前I天分到六孔板中，第2天長(zhǎng)至60%-70%時(shí),用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000 (Invitrogen公司)將pVAX-IL-12-GB超純質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，6小時(shí)后更換有10%胎牛血清的1640完全培養(yǎng)基 (Gbico公司產(chǎn)品)，以轉(zhuǎn)染pVAXl空載體質(zhì)粒(Invitrogen公司產(chǎn)品)為空白對(duì)照，每種質(zhì)粒兩個(gè)復(fù)孔，5% C02、37°C繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。二、轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的293T細(xì)胞的IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因的mRNA表達(dá)水平檢測(cè)吸取轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞上清,按照每孔O. 5mL加入Trizol (Invitrogen公司產(chǎn)品)，一步法提取細(xì)胞總RNA，以提取的細(xì)胞總RNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄合成其cDNA (用東洋紡公司逆轉(zhuǎn)錄試劑盒)，再以合成的cDNA為模板，對(duì)IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以檢測(cè)IL-12基因、GM-CSF-B7. I融合基因在293T轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的表達(dá)水平，IL-12基因的PCR鑒定引物為上游引物Fl 5’ -ATCGATCTAGCCACCATGGAGACAGAC5-3’ 和下游引物 Rl 5，-GCGCGCTAACTGCAGGGCACAGATGC-3，，GM-CSF-B7. I 融合基因(GM-CSF-B7. I)的PCR 鑒定引物為上游引物 F2 :5 ’ -ATGGCACCCGCCCGCTCGCCCAGCCCCAGCACGC-3，和下游引物 R2 :5’ -TTATACAGGGCGTACACTTTCCCTTCTCAATCTC-3’ (所用 PCR 引物均由 Invitrogen 公司合成)，PCR反應(yīng)條件為先94°C預(yù)變性5min ;然后94°C變性30s，62°C退火30s，72°C延伸lmin，共25個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)結(jié)束后，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行I %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示(M.DNA marker(DL2000)l.RT-PCR鑒定IL-12基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染pVAX-IL-12-GB的293T細(xì)胞；2. RT-PCR鑒定IL-12基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染pVAX的293T細(xì)胞；3. RT-PCR 鑒定 GM-CSF-B7. I 融合基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染 pVAX-IL_12_GB 的 293T 細(xì)胞；4. RT-PCR鑒定GM-CSF-B7. I融合基因的轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)染pVAX的293T細(xì)胞)，經(jīng)擴(kuò)增獲得了 1800bp的IL-12基因片段和1200bp的GM-CSF-B7. I融合基因片段，與預(yù)期結(jié)果相符，表明轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的293T細(xì)胞的IL-12基因和GM-CSF-B7. I融合基因在mRNA水平獲得表達(dá)。三、ELISA法檢測(cè)轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX_IL-12_GB的細(xì)胞中IL_12、GM_CSF的蛋白表達(dá)水平吸取轉(zhuǎn)染后48小時(shí)的細(xì)胞上清，4°C、3000r/min離心20min，吸取上清分裝。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果將上清稀釋100倍和200倍后用于檢測(cè)IL-12的分泌表達(dá)水平，將上清稀釋5倍和10倍后檢測(cè)GM-CSF的分泌表達(dá)水平，用人IL-12和人GM-CSF的ELISA檢測(cè)試劑盒(北京奇松生物有限公司產(chǎn)品)分別檢測(cè)人IL-12和人GM-CSF的表達(dá)水平，顯色后用Bio-RAD酶標(biāo)儀450nm讀取OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品檢測(cè)結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其中，人IL-12的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示(a. IL-12ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；b.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清中IL-12的濃度)，人GM-CSF的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示(a. GM-CSFELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線；b.轉(zhuǎn)染后細(xì)胞上清中GM-CSF的濃度)，統(tǒng)計(jì)分析得到濃度與OD值的線性關(guān)系人 IL-12 為 y = 23. 31x (R2 = O. 989)，人 GM-CSF 為 y = 311. 5x (R2 = O. 994)。根據(jù)以上公式，可以計(jì)算出人IL-12在轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染空載體的細(xì)胞上清中的含量分別為 3930. 65 (±59. 04)pg/mL 和 396. 85 (±30. 47)pg/mL，統(tǒng)計(jì)分析兩組細(xì)胞上清中人 IL-12含量存在明顯差異(P < O. 01)，人GM-CSF的轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB和空載體pVAX的細(xì)胞上清中含量分別為1921. 17 (±26. 72)pg/mL和329. 03 (±28. 10)pg/mL，統(tǒng)計(jì)分析細(xì)胞上清中人IL-12和人GM-CSF含量，結(jié)果轉(zhuǎn)染pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒的細(xì)胞上清中人IL-12、人GM-CSF表達(dá)量與轉(zhuǎn)染空載體組細(xì)胞上清中的表達(dá)量存在顯著差異(P < O. 01)，表明人IL-12、人GM-CSF在轉(zhuǎn)染有pVAX_IL-12_GB載體的細(xì)胞中獲得高水平表達(dá)。
四、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染有質(zhì)粒pVAX-IL-12-GB的細(xì)胞中B7. I的蛋白表達(dá)水平B7. I基因位于融合基因的下游，可以錨定在細(xì)胞膜上，可通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)和免疫熒光檢測(cè)B7. I分子在細(xì)胞膜上的表達(dá)水平，方法為0. 5%胰酶消化細(xì)胞，預(yù)冷的含有2%新生牛血清的PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入I 100稀釋的FITC標(biāo)記的抗B7. I的抗體(eBioscience公司產(chǎn)品)200μ I重懸細(xì)胞，4°C避光孵育I小時(shí)后，PBS洗滌細(xì)胞2遍，500 μ I重懸細(xì)胞，分別進(jìn)行流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)和熒光顯微鏡觀察。其中，Β7. I蛋白表達(dá)水平的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果如圖5所示(a.轉(zhuǎn)染pVAX空質(zhì)粒細(xì)胞；b.轉(zhuǎn)染pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒細(xì)胞)，流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)表達(dá)B7. I蛋白的細(xì)胞量可達(dá)20%，與轉(zhuǎn)染空載體的293T細(xì)胞存在明顯差異；熒光顯微鏡下圖片見圖6所示(a.轉(zhuǎn)染pVAX空質(zhì)粒細(xì)胞；b.轉(zhuǎn)染pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒細(xì)胞，X 40)，也可以見到表達(dá)下游B7. I基因的細(xì)胞發(fā)出綠色熒光，而轉(zhuǎn)染pVAX空質(zhì)粒的細(xì)胞無(wú)熒光染色。檢測(cè)結(jié)果表明pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后，可以檢測(cè)人IL_12、GM_CSF和B7. I三種免疫調(diào)節(jié)因子在同一真核表達(dá)載體中獲得表達(dá)。五、pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒的遞送和動(dòng)物體內(nèi)的表達(dá)驗(yàn)證將pVAX-IL-12-GB超純質(zhì)粒用PBS稀釋到濃度為O. 5 μ g/ μ 1，按照50 μ g/100 μ I重組質(zhì)粒PVAX-IL-12-GB注射入C57BL/6小鼠(來(lái)源于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心)后腿股四頭肌組織，隨后即用BTX公司ECM-830型電穿孔導(dǎo)入儀在注射部位施以電壓刺激，電脈沖條件為180V，25ms，間隔6ms，IHzX6次，以pVAX空質(zhì)粒作為對(duì)照。48小時(shí)后頸椎脫臼法處死小鼠，手術(shù)剝?nèi)⌒∈竺庖卟课患∪饨M織，立即將其放置于4%多聚甲醛溶液中進(jìn)行組織固定，組織固定后7天，石蠟包埋固定切片，將制備好的石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，用兔抗人IL-12多克隆抗體和“二步法免疫檢測(cè)試劑”(中杉金橋生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品)對(duì)免疫小鼠的肌肉組織切片進(jìn)行染色。檢測(cè)結(jié)果如圖7所示(a.電穿孔注射pVAX質(zhì)粒小鼠肌肉組織免疫組化檢測(cè)；b.電穿孔注射pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒小鼠肌肉組織免疫組化檢測(cè)，X 20)，注射pVAX_IL-12_GB質(zhì)粒的小鼠肌肉組織內(nèi)可以觀察到大量棕褐色陽(yáng)性顆粒(一所指向的褐色顆粒，這些褐色顆粒是基因表達(dá)后人IL-12抗體免疫組化染色的陽(yáng)性結(jié)果，而注射pVAX空載體的小鼠肌肉組織內(nèi)未能檢測(cè)到明顯陽(yáng)性表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電穿孔的方法可以有效地將免疫基因治療劑pVAX-IL-12-GB遞送到小鼠體內(nèi)，并且該免疫基因治療劑也可以在小鼠活體內(nèi)成功表達(dá)。本實(shí)施例充分證實(shí)了實(shí)施例I構(gòu)建的pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒能夠同時(shí)表達(dá)人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12、GM-CSF和B7. I。本發(fā)明將三者構(gòu)建到同一載體中實(shí)現(xiàn)其共同表達(dá)，可以實(shí)現(xiàn)三者協(xié)同作用從而誘導(dǎo)更強(qiáng)的抗腫瘤免疫反應(yīng)，針對(duì)腫瘤、慢性感染性疾病這些病因復(fù)雜或由多基因控制的疾病，本發(fā)明多基因聯(lián)合應(yīng)用的效果顯然較依靠單一因子或兩種因子聯(lián)用效果要優(yōu)異；另一方面，文獻(xiàn)(參見背景技術(shù)中的介紹)證實(shí)了 IL-12，GM-CSF和B7. I兩兩之間分別聯(lián)合均可以發(fā)揮協(xié)同作用，增強(qiáng)彼此抗腫瘤免疫反應(yīng)，其作用效果能夠互相促進(jìn)，未見相互之間作用抵消或產(chǎn)生負(fù)效應(yīng)的報(bào)道，而本發(fā)明中細(xì)胞因子之間的連接物也是在生物制藥領(lǐng)域中經(jīng)過(guò)證實(shí)有效可用的生物材料，由此可以確證本發(fā)明提供的pVAX-IL-12-GB質(zhì)粒作為抗腫瘤免疫基因治療藥物應(yīng)該是安全和有效的。免疫基因治療通過(guò)細(xì)胞因子以及共刺激分子等基因直接在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)和加工，從而完整地保留了表達(dá)產(chǎn)物的天然結(jié)構(gòu)和生物活性。細(xì)胞因子基因在體內(nèi)持續(xù)分泌和/或共刺激分子基因在免疫活性細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞表面的持續(xù)表達(dá)，能夠改變腫瘤細(xì)胞周圍的 免疫微環(huán)境，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)。與此同時(shí)克服了細(xì)胞因子直接注射需要反復(fù)多次給藥以及引起嚴(yán)重的全身副反應(yīng)等缺點(diǎn)。免疫基因治療因?yàn)槠淞己玫陌踩院陀行砸殉蔀槟[瘤免疫治療研究中的常用方法。
權(quán)利要求
1.一種重組表達(dá)質(zhì)粒，其同時(shí)攜帶人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于所述人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因在載體中的位置為自上游至下游依次為人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因，所述GM-CSF基因與B7. I基因通過(guò)linker相聯(lián)構(gòu)成融合基因，并通過(guò)IRES序列與IL-12基因相連。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于用于構(gòu)建所述重組表達(dá)質(zhì)粒的出發(fā)載體為任意一種可在哺乳動(dòng)物表達(dá)外源基因的真核表達(dá)載體，如pVAXl、pSilencel. 0-U6 (Ambion, Austin, TX, USA)、pEGFP-Nl (ClonTech 公司)、pCMV (Stratagene公司)、pSV40 (Marker Gene 公司)、pSI、pCI、pCI-neo (Promega 公司)、pPICZ a、pTEFl、pcDNA3. I 或 pcDNA (Invitrogen 公司)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)質(zhì)粒，其特征在于以pVAXl為出發(fā)載體構(gòu)建的攜帶人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12基因、GM-CSF基因和B7. I基因的重組表達(dá)質(zhì)粒命名為pVAX-IL-12-GB。
5.一種抗腫瘤免疫基因治療藥物，其活性成分為權(quán)利要求I至4任一所述的重組表達(dá)質(zhì)粒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的抗腫瘤免疫基因治療藥物，其特征在于在所述藥物中還可以加入一種或多種藥學(xué)上可接受的載體，所述載體包括藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的稀釋劑、吸收促進(jìn)劑和表面活性劑。
7.權(quán)利要求I至4任一所述重組表達(dá)質(zhì)粒在制備腫瘤免疫基因治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可激活機(jī)體免疫反應(yīng)并具有抗腫瘤效果的抗腫瘤免疫基因治療藥物。本發(fā)明抗腫瘤免疫基因治療藥物的活性成分為pVAX-IL-12-GB，是將人IL-12，GM-CSF和B7.1三種免疫調(diào)節(jié)因子基因克隆到同一質(zhì)粒DNA載體pVAX1中，通過(guò)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)實(shí)現(xiàn)上、下游基因的共同表達(dá)，將該載體導(dǎo)入宿主，能夠同時(shí)表達(dá)人免疫調(diào)節(jié)因子IL-12、GM-CSF和B7.1。本發(fā)明是一種新型抗腫瘤免疫基因治療劑，多種抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)因子聯(lián)合應(yīng)用，能夠發(fā)揮彼此間的協(xié)同刺激作用，更好的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗腫瘤免疫反應(yīng)，為進(jìn)一步開展腫瘤免疫基因治療研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，應(yīng)用前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N15/85GK102776235SQ20121006555
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年3月13日 優(yōu)先權(quán)日2012年3月13日
發(fā)明者于繼云, 張亮, 徐元基, 王偉, 董金凱, 閻瑾琦 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所