專利名稱：艱難梭菌素及其使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本申請一般涉及鑒別和分離足以產(chǎn)生細(xì)菌素，并且更確切地是特異性地殺死艱難梭菌(Clostridium difficile)的R-型高分子量細(xì)菌素的基因簇，以及改變它的殺菌特異性的方法，以及其生產(chǎn)和使用。發(fā)明背景
艱難梭菌是專性厭氧、形成孢子的革蘭氏陽性菌，它是對于人和其它動物而言眾所周知的病原體(Bartlett 等，1977 ；Bartlett 等，1979 ；Keel 等，2007 ；Sunenshine 和McDonald，2006)。在低濃度下，艱難梭菌可無害地存在于哺乳動物的胃腸(GI)道中，但擴(kuò)張時(經(jīng)常是施用抗生素減少共生菌的結(jié)果)艱難梭菌細(xì)菌產(chǎn)生充足的外毒素以引起疾病，所述疾病的范圍從輕微腹瀉疾病到特征偽膜性腸炎，后者是危及生命的，尤其是對年長的人和具有顯著共病的其他人(Bartlett，2002)。由于這種病原體形成的孢子廣泛傳播，并且在醫(yī)院和長期護(hù)理設(shè)施中難以被根除或滅活，所以患者在進(jìn)入這樣的設(shè)施后被艱難梭菌定植的可能性急劇增加(Bartlett，2007)。實際上，最近已經(jīng)很好地記載了艱難梭菌的一種相對新的菌株，它是艱難梭菌-BI/NAP1/027的劇毒的產(chǎn)毒素的細(xì)菌菌株，該菌株在大規(guī)模爆發(fā)環(huán)境中引起嚴(yán)重疾病(Spigaglia 等，2002 ；Pepin 等，2004 ；McDonald 等，2005 ；Muto 等，2005 ；Loo 等，2005 ；Belmares等，2009)。艱難梭菌相關(guān)性疾病(CDAD)在兒童中的發(fā)病率(以前風(fēng)險低)已經(jīng)實質(zhì)性地增長(Benson 等，2007 ;Zilberberg 等，2010)。由于誘導(dǎo)艱難梭菌相關(guān)性疾病的高風(fēng)險，通過施用抗生素來預(yù)防性地消除無癥狀攜帶者或被定植的受試者中的病原體是強(qiáng)烈禁忌的。由革蘭氏陰性菌制成的R-型細(xì)菌素已經(jīng)被描述并且被該細(xì)菌調(diào)用以殺死其它競爭性革蘭氏陰性菌，甚至在一些情況下殺死其它種或?qū)俚母锾m氏陰性菌(Kageyama等，1964 ；Kageyama 等，1964a ；Kingsbury, D, 1966 ；Blackwell and Law, 1981 ；Blackwell 等，1982 ；Campagnari 等，1994 ；Strauch 等，2001 ； Jabrane 等，2002)。已經(jīng)描述，R-型綠胺桿菌素的基板附著區(qū)(BPAR)向異源受體結(jié)合域(RBD)的融合導(dǎo)致具有針對革蘭氏陰性菌的新型殺菌特異性的新型R-型綠膿桿菌素的產(chǎn)生(Williams等，2008 ；Scholl等，2009)。在革蘭氏陽性菌中已經(jīng)描述了其它高分子量細(xì)菌素或R-型細(xì)菌素(Coetzee等，1968 ;Thompson和Pattee, 1981 ；Zink等，1995)。然而,對于革蘭氏陽性菌產(chǎn)生的R-型高分子量細(xì)菌素結(jié)構(gòu)知之甚少。但是盡管這已經(jīng)得到描述，沒有一個是在基因水平上被表征或以對開發(fā)有用的試劑支持或必要的方式來操作。對于2種梭菌種-肉毒棱菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌，已經(jīng)描述了高分子量細(xì)菌素(Ellison和Kautter, 1970 ;Anastasio等，1971 ；Nieves等，1981)。沒有一個被描述為由艱難梭菌產(chǎn)生或殺死艱難梭菌。發(fā)明概述本發(fā)明基于編碼對艱難梭菌的其它菌株是殺菌的艱難梭菌特異性R-型細(xì)菌素(本文稱作“艱難梭菌素(doffocin)”)的整個遺傳基因座或基因簇的分離；艱難梭菌素基因簇的表達(dá)和好氧細(xì)菌中的艱難梭菌素的產(chǎn)生；以及這樣的發(fā)現(xiàn)艱難梭菌素基因簇的開放閱讀框(ORF) 1374確定該艱難梭菌素針對艱難梭菌菌株的殺菌譜。本發(fā)明提供以下實用方法通過基因工程化改變艱難梭菌素的特異性以產(chǎn)生新型艱難梭菌素，以及直接或間接制造和施用艱難梭菌素以從定植的動物(包括人)的胃腸(GI)道中消除艱難梭菌。施用艱難梭菌素可以治療或預(yù)防艱難梭菌感染或相關(guān)性疾病的發(fā)展，而不會像傳統(tǒng)的抗生素那樣傷害身體健康所必須的共生GI細(xì)菌。 根據(jù)本發(fā)明，提供編碼R-型高分子量(hmw)細(xì)菌素的分離核酸分子。在一個實施方案中，提供編碼R-型高分子量(hmw)細(xì)菌素的分離的核酸分子，其中所述核酸分子來自艱難梭菌的菌株的基因組，并且其中所述R-型hmw細(xì)菌素包含多肽，所述多肽與選自由SEQ ID NO :4-16、18、19，以及66-80組成的組的多肽具有至少80%同一性，并且R-型hmw細(xì)菌素具有與艱難梭菌的至少一種其它菌株的受體結(jié)合的受體結(jié)合域(RBD)，并且因此具有針對艱難梭菌的其它一種或多種菌株的殺菌活性。在具體的實施方案中，所述核酸分子來自選自由以下各項組成的組的艱難梭菌菌株的基因組，S卩Cd4、Cdl6、Cdl9108、Cdl9123、Cdl9126、Cdl9145，以及ATCC登記號43593。在一些實施方案中，菌株是Cdl6并且核酸分子包括SEQ ID NO :1，或者菌株是Cd4并且核酸分子包括SEQ ID NO 610在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供被本發(fā)明的核酸分子編碼的分離的R-型細(xì)菌素。在一方面，所述R-型細(xì)菌素在好氧生產(chǎn)細(xì)菌中表達(dá)。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供具有殺菌活性的分離的R-型高分子量(hmw)細(xì)菌素，其中R-型hmw細(xì)菌素包括梭菌屬的細(xì)菌的第一物種的第一菌株的基板附著區(qū)(BPAR)，以及來自所述第一物種的第二菌株，或來自所述梭菌屬或感染梭菌種的噬菌體的第二物種的受體結(jié)合域(RBD)，或RBD的修飾形式，其中細(xì)菌素具有針對艱難梭菌的至少一種菌株的殺菌活性。在具體實施方案中，BPAR來自艱難梭菌的第一菌株并且RBD來自艱難梭菌的第二菌株或來自感染艱難梭菌的噬菌體。在一些實施方案中，BPAR與SEQ ID NO16,54-56以及78的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少80%同一性。在其它實施方案中，RBD與SEQ ID NO 17以及49-56的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少80%同一性。在某些實施方案中，BPAR與含有SEQ ID NO : 16或78的50個或更多個連續(xù)氨基酸或含有SEQ ID NO 54-56的50個或更多個連續(xù)氨基酸的多肽具有至少80%同一性。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供含有本發(fā)明的核酸分子的表達(dá)盒。表達(dá)盒可被包含在表達(dá)載體(如質(zhì)粒)中，或可被包含在生產(chǎn)細(xì)胞的染色體中。在一些實施方案中，表達(dá)盒含有可操作地連接至編碼R-型細(xì)菌素的核酸分子上的異源啟動子。這些啟動子可以是可誘導(dǎo)的、可阻抑的或組成性激活的。在一方面，啟動子是可誘導(dǎo)的；在另一方面，啟動子是可阻抑的。在一些實施方案中，通過添加或去除小分子誘導(dǎo)劑、阻抑物或去阻抑物來誘導(dǎo)啟動子。在一方面，啟動子由小分子誘導(dǎo)劑或去阻抑物誘導(dǎo)。在具體方面，盒的表達(dá)由可操作地連接的recA基因調(diào)節(jié)，所述recA基因編碼組成性活性RecA蛋白并且受響應(yīng)于小分子誘導(dǎo)劑或去阻抑物的異源啟動子的控制。
在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供含有本發(fā)明的表達(dá)盒的生產(chǎn)細(xì)胞。表達(dá)盒可以包含在生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)的游離表達(dá)載體中?；蛘撸a(chǎn)細(xì)胞可以在它們的染色體中包含本發(fā)明的核酸分子或表達(dá)盒。在某些實施方案中，生產(chǎn)細(xì)胞是非病原性且非專性的厭氧菌。在一些實施方案中，非病原性且非專性的厭氧菌是來自選自由芽孢桿菌屬、乳桿菌屬以及李斯特菌屬組成的組的細(xì)菌屬的物種。在某些實施方案中，非病原性且非專性的厭氧菌來自芽孢桿菌屬。在一些方面，細(xì)菌是枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。在具體方面，枯草芽孢桿菌(B. subtilis)缺乏PBSX基因簇。在另一個實施方案中，生產(chǎn)細(xì)胞是專性厭氧的但非病原性的細(xì)菌。在本發(fā)明的又一個實施方案中，提供生產(chǎn)本發(fā)明的R-型hmw細(xì)菌素的方法。所述方法包括將含有可操作地連接至對誘導(dǎo)或阻抑劑敏感的可誘導(dǎo)的或可阻抑的啟動子上的本發(fā)明的核酸序列的生產(chǎn)細(xì)胞暴露于有效誘導(dǎo)R-型細(xì)菌素的表達(dá)的濃度的試劑，以及純化表達(dá)的R-型細(xì)菌素。在一些實施方案中，編碼R-型細(xì)菌素的核酸分子與生產(chǎn)細(xì)胞的基因組是異源的。在具體方面，核酸分子包含在生產(chǎn)細(xì)胞的染色體中，或包含在生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)的染色體外表達(dá)載體中。在某些實施方案中，生產(chǎn)細(xì)胞是非病原性且非專性的厭氧菌。在一 些實施方案中，非病原性且非專性的厭氧菌是來自選自由芽孢桿菌屬、乳桿菌屬以及李斯 特菌屬組成的組的細(xì)菌屬的物種。在某些實施方案中，非病原性且非專性的厭氧菌來自芽孢桿菌屬。在一些方面，細(xì)菌是枯草芽孢桿菌。在具體方面，當(dāng)被誘導(dǎo)以產(chǎn)生R-型細(xì)菌素時枯草芽孢桿菌不裂解。在另一方面，枯草芽孢桿菌缺乏PBSX基因簇。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供殺死病原菌的方法。所述方法包括使病原菌與本發(fā)明的R-型細(xì)菌素相接觸，借此R-型細(xì)菌素結(jié)合并殺死病原菌。在一方面，病原菌是艱難梭菌。在一方面，艱難梭菌是在動物中并且將殺菌量的R-型細(xì)菌素施用于所述動物。在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供治療或預(yù)防動物中艱難梭菌的疾病引起的感染的方法。所述方法包括向有需要的動物直接施用殺菌量的本發(fā)明的R-型細(xì)菌素，通過施用生產(chǎn)細(xì)胞間接施用試劑，或施用產(chǎn)生天然艱難梭菌素但已被基因修飾而不產(chǎn)生毒素的艱難梭菌細(xì)菌的孢子。在具體實施方案中，動物中艱難梭菌的感染通過向有需要的動物施用一定量的本發(fā)明的生產(chǎn)細(xì)胞以產(chǎn)生殺菌量的細(xì)菌素來治療，從而治療感染。在一方面，編碼細(xì)菌素的核酸受Iac啟動子的控制并且向動物施用乳糖。在一些實施方案中，動物是哺乳動物。在一方面，哺乳動物是人。附圖
簡述圖I提供了 SEQ ID NO :1_80的核酸或氨基酸序列。圖2.艱難梭菌素對臨床艱難梭菌分離株的殺菌活性。指示菌株號沿著矩陣的頂部示出；標(biāo)星號的菌株是NAP1/027/BI菌株。所測試的艱難梭菌素的艱難梭菌來源的身份(identity)沿著左邊界示出。菌株獲自LC Fortier (4和16)、ATCC (43593)，或加利福尼亞州卡爾弗城的RMAlden研究實驗室。圖3示出了 difl6的掃描電子顯微圖。注意到花樣尾絲附器。圖4示出了 dif4對靶菌株Cdl9135的點滴試驗結(jié)果的照片。將純化的艱難梭菌素連續(xù)稀釋10倍，并且將所述稀釋液的5 μ I的等分部分點滴在靶艱難梭菌細(xì)菌的菌苔上。在37°C下厭氧地孵育過夜后，通過菌苔上的生長的清除(clearing)指示艱難梭菌素殺死情況。
圖5 示出了 dif4( “4”)和 difl6( “16”)的過濾的(“F，，)和未過濾的(“UF”)制品的銀染的SDS-PAGE的照片。箭頭指示條帶，將所述條帶切離并通過質(zhì)譜法鑒別。圖6示出了來自Cd630和Cdl6的艱難梭菌素基因簇的圖解。基因座由編碼肌尾噬菌體科噬菌體尾部裝置特有的結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)裝配蛋白的ORF-ORF 1362至0RF1375組成，這在圖譜之下指示。側(cè)接這些基因的是編碼推定的噬菌體樣調(diào)節(jié)蛋白的基因。底部箭頭指示其中ORF被轉(zhuǎn)錄的方向，并且ORF的推定功能在圖譜之上指示。圖7是在艱難梭菌菌株19099的菌苔上測試的由枯草芽孢桿菌BDR123-488 (部分I)和BDR123-491 (部分2)產(chǎn)生的difl6的點滴試驗的圖像。圖8提供了由來自產(chǎn)生活性艱難梭菌素的艱難梭菌的5種菌株的每一種的ORF1374基因編碼的局部氨基酸序列(SEQ ID NO :81_86，分別按照外觀的順序)的ClustalW分析的結(jié)果。在每排對齊的序列下，表示那個位置的由所有5種基因編碼的氨基酸身份；“”表示那個位置的由所有5種基因編碼的高度類似的氨基酸；并且”表示那個位 置的由所有5種基因編碼的稍微類似的氨基酸；序列比對中給定位置的空白表示由所有5種基因編碼的零氨基酸類似性。圖9是由BDR123-580和“Dif4_16”產(chǎn)生的“Dif4”的點滴試驗圖像。后者由枯草芽孢桿菌 BDR123-587 產(chǎn)生，其中 dif4(SEQ ID NO 49)的 of 1374 被轉(zhuǎn)換成 dif 16 (SEQ IDNO 17)的orfl374。如所指示，將這兩種由枯草芽孢桿菌產(chǎn)生的艱難梭菌素在菌株19137和19145的菌苔上進(jìn)行測試?！癉if4-16”的殺菌特異性已經(jīng)從dif4的殺菌特異性轉(zhuǎn)換成dif 16的殺菌特異性。發(fā)明詳述定義如本文所使用，“R-型高分子量(hmw)細(xì)菌素”還簡稱為“R_型細(xì)菌素”并且包括R-型綠膿桿菌素、艱難梭菌素、單利菌素(monocin)、小腸結(jié)腸炎菌素(enterocoliticins)、腦膜炎雙球菌素(meningocins),或結(jié)構(gòu)上或基因上與卩遼菌體的肌尾噬菌體科相關(guān)的其它高分子量(hmw)細(xì)菌素。R-型細(xì)菌素包括R-型綠膿桿菌素、艱難梭菌素、小腸結(jié)腸炎菌素、單利菌素，以及腦膜炎雙球菌素的修飾版本(Williams等2008 ；Strauch 等，2001 ；Kingsbury, 1966 ；Zink 等 1995)。如本文所使用，術(shù)語“艱難梭菌素”指代分離自或衍生自艱難梭菌的R-型高分子量細(xì)菌素，并且包括獲自艱難梭菌的天然顆粒以及通過非天然的生產(chǎn)細(xì)胞中的艱難梭菌素基因簇的表達(dá)而獲得的顆粒。艱難梭菌素還可以是由衍生自艱難梭菌的一種或多種菌株的基因編碼的多肽組成的工程化顆粒，并且與SEQ ID NO :2-23、49和62-80的一個或多個多肽具有80 %或更多的同一性。本發(fā)明的R-型細(xì)菌素可以是不耐熱的、耐弱酸的、耐胰蛋白酶的、經(jīng)約65，OOOxg下的離心分離可沉積的，以及通過電子顯微鏡法可分辨的(Kageyama等，1962 ；Bradley,1967 ；Daw等，1996 ； Jabrane等，2002 ；Fortier等，2007)。在許多情況下，本文公開的工程化R-型細(xì)菌素具有這些特性的一種或多種(任意組合)。本文公開的R-型細(xì)菌素另一個常見的特性是它們不含有核酸因此復(fù)制不足，如此導(dǎo)致它們在殺死靶細(xì)菌之后或期間不能如許多噬菌體那樣自我復(fù)制。R-型細(xì)菌素僅僅是蛋白質(zhì)，而不是有機(jī)體。本文公開的R-型細(xì)菌素是包含多種蛋白質(zhì)，或多肽、亞基的復(fù)雜分子，并且類似肌尾噬菌體科的噬菌體的尾部結(jié)構(gòu)。在天然生成的R-型細(xì)菌素中，亞基結(jié)構(gòu)由細(xì)菌的基因組，如艱難梭菌或銅綠假單胞菌的基因組編碼，并且形成R-型細(xì)菌素以充當(dāng)針對其它細(xì)菌的天然防御(Kageyama，1975)。簡單的R-型細(xì)菌素分子通?？梢詺⑺烂舾械陌屑?xì)菌(Kageyama 等，1964 ；Kageyama 等，1964a ；Morse 等，1980 ； Strauch 等，2001)?！鞍屑?xì)菌”指代被本公開內(nèi)容的R-型細(xì)菌素結(jié)合，和/或其生長、存活，或復(fù)制從而被抑制的一種或多種細(xì)菌。在一些實施方案中，靶細(xì)菌來自梭菌屬。在具體的實施方案中，細(xì)菌是艱難梭菌。在一方面，多于一種艱難梭菌的菌株被祀向。艱難梭菌的不例性菌株包括但不限于NAP1/BI/核糖核酸型027，以及圖2中所列的那些。術(shù)語“生長抑制”或其變體指代細(xì)菌細(xì)胞分裂速率的減緩或停止或細(xì)菌細(xì)胞分裂的中斷，或指代一種或多種細(xì)菌的死亡。如本文所使用，“核酸”或“核酸分子”通常指代單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物(純的或混合的)。此術(shù)語可涵蓋含有核苷酸類似物或修飾的主鏈殘基或接頭的核酸，它們是合成的、天然生成的，以及非天然生成的，具有類似于參比核酸 的結(jié)合、結(jié)構(gòu)，或功能特性，并且以類似于參比核苷酸的方式代謝。這類類似物的實例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯，2-0-甲基核糖核苷酸，以及肽-核酸(PNA)。在一些語境中，術(shù)語核酸可與基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸，以及多核苷酸互換使用。特定的核酸序列還涵蓋其保守修飾的變體(例如簡并密碼子取代)和互補(bǔ)序列，以及明確指示的序列。具體地，簡并密碼子取代可以通過生成序列來實現(xiàn)，其中一個或多個選擇的(或所有)密碼子的第三(“擺動”)位置被混合堿基和/或脫氧肌苷殘基取代。因此，本文公開的編碼蛋白序列的核酸序列還如本文所描述涵蓋其修飾變體。如本文所使用的關(guān)于氨基酸序列的術(shù)語“區(qū)段”指代鄰近的氨基酸序列，其長度可能為10、12、15、20、25、50或100個氨基酸殘基。如本文所使用，術(shù)語“異源的”當(dāng)用于指代蛋白質(zhì)或核酸序列的部分時，表明所述序列包含兩個或更多個通常在本質(zhì)上不處于相同的相互關(guān)系的序列。在一個實例中，異源序列來自不同物種的細(xì)菌。在另一個實例中，異源序列來自相同物種的細(xì)菌的不同菌株。在一方面，異源序列來自艱難梭菌的不同菌株。在另一方面，異源序列來自細(xì)菌和噬菌體或來自細(xì)菌和DNA的合成的、非天然序列。術(shù)語“多肽”、“肽”，以及“蛋白質(zhì)”在本文中通?；Q使用以指代氨基酸殘基的聚合物。在本文中，氨基酸可以被稱作它們通常已知的三個字母的符號或稱作由IUPAC-IUB生物化學(xué)命名委員會推薦的單字母符號。毒力因子是有助于有機(jī)體的病原性但不一定有助于它的一般成活力的那些分子。損失毒力因子后，有機(jī)體病原性降低但未必成活力降低。毒力因子可具有眾多功能的任何一種，例如調(diào)節(jié)基因表達(dá)、提供粘附力或遷移率、提供毒素、注入毒素、泵出抗生素，或形成保護(hù)性涂層(包括生物薄膜)。適度因子是有助于有機(jī)體在它的環(huán)境中的一般成活力、生長速率或競爭力的那些分子。損失適度因子后，有機(jī)體成活力或競爭力降低并且由于此危害，間接地病原性降低。適度因子也可具有眾多功能的任何一種，例如獲取營養(yǎng)物、離子或水；形成細(xì)胞膜或細(xì)胞壁的組分或防護(hù)劑；復(fù)制、修復(fù)或誘變核酸；針對環(huán)境或競爭性侵入提供防御或進(jìn)攻。
如本文所使用，術(shù)語“生產(chǎn)細(xì)胞”指代能夠產(chǎn)生或表達(dá)編碼艱難梭菌素的核酸分子，并且其天然不含有這樣的核酸分子的細(xì)胞。生產(chǎn)細(xì)胞可能能夠在氧的存在下存活并生長，并且被含有編碼艱難梭菌素的核酸分子的載體轉(zhuǎn)移，它可被并入生產(chǎn)細(xì)胞的染色體中或者可以是游離的。生產(chǎn)細(xì)胞可以是革蘭氏陽性菌。在某些實施方案中，生產(chǎn)細(xì)胞可以是來自芽孢桿菌屬、乳桿菌屬梭菌屬或李斯特菌屬的細(xì)菌。在一些實施方案中，細(xì)菌是來自選自由枯草芽孢桿菌、淀粉液化芽孢桿菌，以及巨大芽孢桿菌組成的組的芽孢桿菌屬的物種。在一方面，細(xì)菌是枯草芽孢桿菌。在具體方面，生產(chǎn)細(xì)胞是缺乏PBSX基因簇的枯草芽孢桿菌。在其它實施方案中，細(xì)菌是來自選自由嗜酸乳酸桿菌、干酪乳酸桿菌以及保加利亞乳酸桿菌組成的組的乳酸桿菌屬的物種。在又一個實施方案中，細(xì)菌是無害李斯特菌(Listeriainnocua)。在另一個實施方案中，非病原性生產(chǎn)細(xì)胞可以是大腸桿菌(Escherichia coli)或?qū)儆谒缶鷮佟０l(fā)明實施方式的詳細(xì)描述分離自艱難梭菌的R-型細(xì)菌素具有殺菌活性.
為了測試殺菌活性，通過自始至終在嚴(yán)格的厭氧條件下將細(xì)胞培養(yǎng)至中期對數(shù)生長期然后將培養(yǎng)物暴露于3 μ g/ml的絲裂霉素C制成兩種艱難梭菌-Cd4和Cdl6 (來自LCFortier)的裂解物。細(xì)菌細(xì)胞裂解之后，將裂解物中的顆粒濃縮并通過高速離心來純化(參見實施例I)。通過電子顯微鏡法顯示這些制品含有濃縮的無頭噬菌體樣顆粒(圖3)。濃縮并且純化之后，通過點滴板方法，借此再次在嚴(yán)格的厭氧條件下將樣品涂覆在靶艱難梭菌細(xì)菌的菌苔覆層上，評估制品的殺菌活性。由于大多數(shù)噬菌體尾樣細(xì)菌素通常靶向不同于生產(chǎn)細(xì)菌的菌株，所以測試起初由一組29種艱難梭菌臨床分離株組成的靶菌株。過夜孵育之后，檢查平板來確定殺菌活性的存在，這如通過艱難梭菌細(xì)菌的菌苔的清除所指示，在菌苔中純化了的材料被點滴。圖4示出了點滴在艱難梭菌菌株-Cdl9135上的來自Cd4(dif 4)的艱難梭菌素的典型點滴測定?；邳c滴測定，Dif4(來自Cd4的艱難梭菌素)和difl6(來自Cdl6的艱難梭菌素)展示出不同的殺菌譜(圖2)。Dif4對29種艱難梭菌臨床分離菌株中的10種顯示出殺菌活性，而difl6針對29種菌株中的8種具有活性。存在對兩種艱難梭菌素易感菌株的一些重疊，但兩種艱難梭菌素具有不同的殺菌譜。來自CdlOS和Cd43593的艱難梭菌素具有非常相似的殺菌譜，并且殺死29種艱難梭菌臨床分離株組中的10種NAP1/027/BI劇毒菌株中的至少9種。當(dāng)進(jìn)一步測試時，dif43593殺死所有18種另外的、獨立的NAP1/027/BI分離株。因此，dif43593殺死所有28種測試的NAP1/027/BI艱難梭菌的菌株(圖2)。艱難梭菌素基因座的鑒別.將分離并純化自Cd4的艱難梭菌素顆粒變性，并且將蛋白質(zhì)組分通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS PAGE)分離并通過銀染色檢測(圖5)。將兩個單獨的條帶- 200kD和 40kD切離并通過質(zhì)譜法分析。發(fā)現(xiàn)來自40kD條帶的肽匹配來自編碼在若干艱難梭菌菌株中的兩種艱難梭菌開放閱讀框(ORF)的預(yù)期產(chǎn)物，針對所述艱難梭菌菌株完整的基因組已經(jīng)被測序，包括參比菌株Cd630(基因庫登記號NC 009089.1)。這些的第一種是ORF 1363 (SEQ ID NO :5)-—種39，192道爾頓的噬菌體樣蛋白質(zhì)。此條帶中的第二種主要的多肽對應(yīng)ORF 1371 (SEQ ID NO :14)_ 一種39，565道爾頓的噬菌體樣基板蛋白質(zhì)。由于這些蛋白質(zhì)在分子量方面巧合地非常接近，所以它們在相同的SDS PAGE條帶中遷移。200kD條帶生成顯性多肽，所述多肽對應(yīng)ORF 1374 (SEQ ID NO 17)的C-末端部分，正是兩種其它的噬菌體樣ORF的下游。由于這些ORF在Cd630基因組內(nèi)的定位極為貼近，所以分析周圍區(qū)域。在堿基1574593和1596384之間發(fā)現(xiàn)原噬菌體樣元素，它包括ORF 1360A-1379 (圖6和SEQ ID NO:1-23)。特別注意的是在此區(qū)域編碼的結(jié)構(gòu)基因只對應(yīng)典型的肌尾噬菌體科噬菌體的尾部結(jié)構(gòu)的組分；沒有發(fā)現(xiàn)針對衣殼、衣殼裝配蛋白，或門戶蛋白的基因。也不見任何編碼推定的DNA復(fù)制或DNA包裝機(jī)的0RF。因此，此基因座與R-型(肌尾噬菌體科噬菌體尾樣)細(xì)菌素的基因座一致。側(cè)接結(jié)構(gòu)基因的是若干編碼推定的噬菌體樣調(diào)節(jié)蛋白的0RF。因為來自此基因座的ORF編碼在艱難梭菌素顆粒中發(fā)現(xiàn)的多肽以及基因簇類似R-型細(xì)菌素的基因簇的事實，我們將艱難梭菌素基因座分配至此區(qū)域。結(jié)構(gòu)基因全部編碼在一個鏈上并且以相同的方向轉(zhuǎn)錄?；虻慕M織類似R-型綠 膿桿菌素和許多肌尾噬菌體科噬菌體的基因的組織。多種結(jié)構(gòu)蛋白展現(xiàn)出針對艱難梭菌噬菌體(包括噬菌體Φ119和OC2)的序列相似性(Goh等，2007 ;Govind等，2006)。還已知艱難梭菌菌株Cd630編碼兩種完整的原噬菌體，已知兩者均為可誘導(dǎo)的(Goh等，2007)。多種艱難梭菌素ORF具有針對艱難梭菌菌株Cd630的原噬菌體I和2的序列相似性，這表明這些艱難梭菌肌尾噬菌體科噬菌體和這些艱難梭菌素共有相同的世系。特別注意的是艱難梭菌素的ORF 1374 (SEQ ID NO : 17)。此基因編碼恰好位于ORF1373，SEQ ID NO :16的下游的大的多肽，此簇中的此位置指明ORF 1374是R-型細(xì)菌素尾絲的一部分，即受體結(jié)合域(RBD)。由于已經(jīng)認(rèn)定為艱難梭菌素的電子顯微圖在尾絲區(qū)顯露出大的花樣結(jié)構(gòu)，顯然此結(jié)構(gòu)包含大蛋白質(zhì)。ORF 1373 (SEQ ID NO 16)編碼艱難梭菌素尾絲的基板附著區(qū)-BPAR，并且看似是限難梭菌的噬菌體中的相似ORF 1373的截短形式，所述相似ORF 1373編碼RBD以及BPAR，假定這類噬菌體缺乏ORF 1374。因此，天然生成的艱難梭菌素包含兩種蛋白質(zhì)=ORF 1373和ORF 1374，它們形成連接的尾絲；而艱難梭菌的噬菌體具有的尾絲包含單個蛋白質(zhì)-提供BPAR和RBD功能的稍微較長的0RF1373。根據(jù)此知識，本文采用編碼ORF 1373 (SEQ ID NO :16)或0RF1374(SEQ ID NO : 17)的核酸作為從其中構(gòu)造新的RBD特異性功能的基質(zhì)。艱難梭菌素在艱難梭菌分離株中廣泛傳播.測試一系列獨立的艱難梭菌的臨床分離株的產(chǎn)生可能具有不同殺菌譜的艱難梭菌素顆粒的能力。將臨床分離株Cdl9123、Cdl9145、Cdl9126、Cdl9108 (來自加利福尼亞州卡爾弗城的RM Alden研究實驗室)，以及ATCC Cd43593在嚴(yán)格的厭氧條件下用絲裂霉素C誘導(dǎo)，隨后將產(chǎn)生的顆粒純化并濃縮。然后將純化了的材料分別點滴在臨床收集中的其它艱難梭菌菌株的菌苔上以檢測殺菌活性。結(jié)果顯示這些分離株各產(chǎn)生具有不同殺菌譜的顆粒(來自臨床分離株Cdl9123、Cdl9145、Cdl9126、Cdl9108以及ATCC Cd43593的分別稱為 difl23、difl45、difl26、difl08 以及 dif43593 的艱難梭菌素)(圖 2·)。Difl08 和dif43593具有非常相似且寬的殺菌譜，而菌株Cdl9145產(chǎn)生的顆粒具有窄的殺菌譜。進(jìn)行誘導(dǎo)測試的一些分離株，包括Cdl9113和Cdl9150，在暴露于絲裂霉素之后裂解，但并不產(chǎn)生可檢測的艱難梭菌素顆粒。本文意識到經(jīng)基因組測序的實驗室菌株Cd630編碼艱難梭菌素基因座；并且實際上，此基因組在本文中用于鑒別艱難梭菌素基因。然而，雖然菌株Cd630在用絲裂霉素C誘導(dǎo)之后裂解，但沒有產(chǎn)生可檢測的艱難梭菌素顆粒。反而產(chǎn)生小量的原噬菌體I和原噬菌體2。
艱難梭菌素簇的鑒別和克隆.
通過絲裂霉素C誘導(dǎo)溶菌后Cd630沒有產(chǎn)生可檢測的艱難梭菌素顆粒。相應(yīng)地， 來自Cdie的艱難梭菌素基因簇反而被克隆。首先獲得Cdie的基因組序列草圖。鑒別并注釋類似于Cd630的基因座的艱難梭菌素基因座。將來自生產(chǎn)菌株Cdl6的整個艱難梭菌素基因簇克隆至BAC中(SEQ ID NO :1)，并且隨后顯示其包括在非病原性微生物和不是專性厭氧菌的微生物中產(chǎn)生活性艱難梭菌素所必須的所有基因。艱難梭菌是病原性的并且是專性的厭氧菌，這使得它是用于天然艱難梭菌素或通過重組DNA工程化修飾的艱難梭菌素的不可行的生產(chǎn)細(xì)胞。分離的艱難梭菌素簇還可以通過重組DNA技術(shù)進(jìn)行工程化，以通過響應(yīng)于添加至生產(chǎn)微生物的培養(yǎng)物或誘導(dǎo)介質(zhì)中的無毒小分子誘導(dǎo)劑或去阻抑物的異源啟動子來調(diào)節(jié)其表達(dá)。這類小分子包括但不限于四環(huán)素、無水四環(huán)素、乳糖、阿拉伯糖、木糖以及它們的非代謝類似物，如IPTG來代替乳糖。
艱難梭菌素艱難梭菌素是分離自艱難梭菌的R-型hmw細(xì)菌素，它們對艱難梭菌的其它菌株具有殺菌性。艱難梭菌素可以在絲裂霉素C的存在下分離自在厭氧條件下培養(yǎng)的艱難梭菌菌株。在一些實施方案中，艱難梭菌素來自艱難梭菌臨床分離株Cd4、Cdl6、Cdl9123、 Cdl9145、Cdl9126、Cdl9108，或 ATCC Cd43593(分別稱為 dif 4、difl6、difl23、difl45、 difl26、dif 108，以及dif43593)。在一方面，艱難梭菌素來自Cd4 ;在另一方面，艱難梭菌素來自Cdl6。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，提供編碼衍生自梭菌屬的基因組的艱難梭菌素的分尚核酸分子。在一方面，核酸分子含有SEQIDN0 :1的基因簇。在另一方面，核酸分子含有 SEQ ID N061的基因簇。在其它實施方案中，核酸分子編碼包括選自由SEQ ID NO 2-23 ； 49,62-80組成的組的一種或多種多肽的艱難梭菌素。在另外的實施方案中，核酸分子編碼包括選自由SEQ ID N0:4-16、18、19以及66-80組成的組的一種或多種多肽的艱難梭菌素。 在一方面，核酸分子編碼SEQ ID N0:2-23的多肽。在另一方面，核酸分子編碼SEQ ID NO: 49以及62-80的多肽。
還提供變體艱難梭菌素。變體艱難梭菌素包括具有與選自由SEQID NO :4_16、18、 19以及66-80組成的組的多肽具有至少80%同一性的氨基酸序列的那些艱難梭菌素。在其它實施方案中，變體艱難梭菌素具有與選自由SEQ ID NO :4-16、18、19以及66-80組成的組的多肽具有至少85%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或者甚至99%同一性的氨基酸序列。
在一些實施方案中，變體艱難梭菌素可包括異源基板附著區(qū)(BPAR)，其中BPAR與 SEQ ID NO :16、54-56，以及78的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少80%同一性。在另一個實施方案中，BPAR與SEQID NO : 16、54-56以及78的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少85% 同一性。在另一個實施方案中，BPAR與SEQ ID NO : 16、54-56以及78的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少89%同一性。在另一個實施方案中，BPAR與SEQID NO 16,54-56以及78的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少90%同一性。在又一個實施方案中，BPAR與SEQ ID NO 16、54-56以及78的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少95%同一性。在另一個實施方案中，BPAR與SEQID NO :16、54_56以及78的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少98%同一性。在再一個實施方案中，BPAR與SEQ ID NO : 16、54-56以及78的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少 99%同一性。
在另外的實施方案中，變體艱難梭菌素可包括異源受體結(jié)合域(RBD)，其中RBD與 SEQ ID NO :17以及49-53的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少80%同一性，或與含有選自由 SEQ ID N0:54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域的多肽具有至少80%同一性。 在另一個實施方案中，RBD與SEQ ID NO 17以及49-53的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少 85%同一性，或與含有選自由SEQ ID NO :54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域的多肽具有至少85%同一性。在另一個實施方案中，RBD與SEQ ID NO : 17以及49-53的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少89%同一性，或與含有選自由SEQ ID NO 54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域的多肽具有至少89%同一性。在另一個實施方案中，RBD與 SEQ ID NO :17以及49-53的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少90%同一性，或與含有選自由 SEQ ID N0:54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域的多肽具有至少90%同一性。 在另一個實施方案中，RBD與SEQ IDNO 17以及49-53的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少 95%同一性，或與含有選自由SEQ ID NO :54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域的多肽具有至少95%同一性。在另一個實施方案中，RBD與SEQ ID NO : 17以及49-53的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少98%同一性，或與含有選自由SEQ ID NO :54_56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域的多肽具有至少98%同一性。在另一個實施方案中，RBD 與SEQ ID NO 17以及49-53的一種或多種的相應(yīng)區(qū)段具有至少99%同一性，或與含有選自由SEQ IDNO 54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域的多肽具有至少99%同一性。在一些實施方案中，受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域包含SEQ ID NO :54、55或56的氨基酸殘基 51到羧基末端殘基。
在另一個實施方案中，通過將噬菌體尾部RBD融合至艱難梭菌素ORF 1373的產(chǎn)物將艱難梭菌素工程化為具有改變的殺菌譜。當(dāng)0RF1374編碼初級殺菌譜決定子或天然艱難梭菌素的RBD時，這個非常大的蛋白質(zhì)與ORF 1374蛋白復(fù)合，并且ORF 1373蛋白提供 BPAR，即它將ORF 1374蛋白的RBD附著至艱難梭菌素基板結(jié)構(gòu)上。0RF1373與肌尾噬菌體科噬菌體如 OCD2(SEQ ID NO :54)、OCD119(SEQ IDNO :55)和 OCD27(SEQ ID NO 56)的尾絲基因，以及R-型綠膿桿菌素的尾絲類似，并且共有氨基酸序列相似性。艱難梭菌素的 ORF 1373 (例如，EQID N0:16或78)與艱難梭菌肌尾噬菌體科噬菌體-ΦΟ)2 (SEQ ID NO: 54)的尾絲共有顯著的序列相似性，特別是在N-末端部分或BPAR的頭160個氨基酸方面。 然而，噬菌體尾絲比艱難梭菌素ORF 1373蛋白長，并且含有C-末端RBD以識別它們的細(xì)菌靶標(biāo)。艱難梭菌素-ORF 1373蛋白不含有此后者域，它的RBD功能已經(jīng)被由0RF1374編碼的單獨多肽替代。因此，ORF 1374可以從艱難梭菌素簇中完全缺失，并且噬菌體尾絲的RBD， 如Φ⑶2的RBD可被融合至由ORF 1373編碼的艱難梭菌素BPAR，從而生成具有噬菌體尾絲樣蛋白以及相應(yīng)地涉及供體噬菌體的寄主范圍的殺菌譜的艱難梭菌素。重要的是，因為艱難梭菌噬菌體尾絲與ORF 1373蛋白之間的氨基酸序列同源性的區(qū)域使得兩者之間能夠成功地功能性融合，人們可以從誘變或非誘變的艱難梭菌噬菌體中選擇寄主范圍變體，它們又可以是用于創(chuàng)建具有新型殺菌譜的修飾的艱難梭菌素的新的RBD來源。
在工程化艱難梭菌素的一個實施方案中，提供其中RBD已經(jīng)被來自另一種艱難梭菌菌株的RBD或被來自感染了艱難梭菌的噬菌體的RBD替代的艱難梭菌素。在一個實例中， 核酸分子包含編碼SEQ IDNO : 16或78的序列但不含有相應(yīng)的天然RBD (即，分別編碼SEQ IDNO : 17或49的序列)；反而，所述天然RBD被編碼RBD的異源序列替代。在具體的實施方案中，核酸分子含有編碼艱難梭菌的不同菌株的R-型細(xì)菌素的受體結(jié)合域(RBD)的異源序列。在一方面，核酸分子含有編碼SEQ ID NO : 16或78的序列以及編碼選自由SEQ ID NO 49-53組成的組的多肽或選自由SEQ ID NO 54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合區(qū)的序列。 在另一方面，核酸分子由編碼SEQ ID NO 2-16和18-23或SEQ ID NO 62-80的序列，以及編碼來自選自由SEQ ID NO 17和49-56組成的組的多肽的RBD的序列組成。
在工程化的艱難梭菌素的其它實施方案中，艱難梭菌素的RBD可被修飾形式的天然RBD替代。“天然RBD”指代具有與分離或克隆自艱難梭菌菌株或來自感染了艱難梭菌的噬菌體的RBD相同的氨基酸序列的RBD。來自大量艱難梭菌菌株的示例性天然RBD包括 SEQ ID NO :17和49-53。來自感染了艱難梭菌的噬菌體的示例性天然RBD包括SEQ ID NO: 54-56 (例如，氨基酸殘基51到羧基末端殘基)。在一些實施方案中，修飾的RBD包括相對于天然RBD而言RBD的氨基酸序列中的變化。氨基酸序列中的變化的非限制性實例包括取代、插入(或添加)，或缺失一個或多個氨基酸。在另外的實施方案中，艱難梭菌素包括取代或插入衍生自通過調(diào)用多樣性生成逆轉(zhuǎn)錄因子(DGR)使結(jié)構(gòu)多樣化的有機(jī)體的RBD，如在 2006年6月8日公布，公布的專利申請US 200 6-0121450所描述(如同完整陳述一樣通過引用將其并入本文)。
在一些實施方案中，修飾形式具有不同于相應(yīng)的未修飾的或天然的RBD的殺菌譜。在具體實施方案中，修飾形式與天然RBD具有至少80%同一性。在其它實施方案中， RBD具有與選自由SEQ ID NO 17和49-53組成的組的多肽，或與選自由SEQ ID NO 54-56 組成的組的多肽的受體結(jié)合區(qū)具有至少85%、88%、89%、90%、95%、96%、97%、98%或者甚至99%同一性的氨基酸序列，并且修飾的RBD具有不同于相應(yīng)的未修飾的或天然的RBD 的殺菌譜。
靶細(xì)菌
分離自患者的艱難梭菌菌株經(jīng)脈沖凝膠電泳法測定以及在它們的病原性方面差異很大。超產(chǎn)生(hyperproduce)毒素的BI/NAP1或核糖核酸型027菌株是特別有毒的， 因為它們已經(jīng)損失了基因tcdC負(fù)調(diào)節(jié)毒素A和毒素B的表達(dá)水平的功能(McDonald等， 2005)。
實際上，擁有特異性tcdC基因突變體等位基因的艱難梭菌菌株已經(jīng)顯示在醫(yī)療設(shè)施內(nèi)部和設(shè)施中流行性地傳播。這些流行性且強(qiáng)毒性菌株是尤其重要的靶細(xì)菌，通過在開始傳統(tǒng)的抗生素治療之前或之后不久口服艱難梭菌素，可以將它們從載體患者的GI道中預(yù)防性地消除。產(chǎn)生野生型水平的毒素A和B的艱難梭菌細(xì)菌同樣是重要的靶病原體， 因為它們潛在地也是致命的，尤其是對大于50歲或具有共病的患者而言(Bartlett JG, 2002)。
靶向在艱難梭菌菌株上廣傳的表面可獲得的毒力或適度因子如S-層蛋白，不論其超生產(chǎn)與否，則提供一種有吸引力的方法降低這樣的病原體的毒力或適度，如果它們出現(xiàn)以抵抗靶向的R-型細(xì)菌素的話。由于艱難梭菌素的RBD的高特異性，除艱難梭菌之外的有機(jī)體不是靶標(biāo)，這是艱難梭菌素的獨特并強(qiáng)有力的優(yōu)勢因為它們不會對正常GI功能和身體健康所必須的GI道細(xì)菌的共生菌造成損害。
“感染”指代例如在受試者或組織或非細(xì)菌細(xì)胞中細(xì)菌的生長，其中所述細(xì)菌實際上或潛在地在受試者、組織或非細(xì)菌細(xì)胞中引起疾病或癥狀。治療感染包括用能夠產(chǎn)生如 dif43593的艱難梭菌素的解毒的艱難梭菌細(xì)菌的物質(zhì)、材料、生產(chǎn)細(xì)胞，或孢子進(jìn)行預(yù)防性治療。治療受試者的非限制性實例包括捐贈器官、組織，以及細(xì)胞；醫(yī)療設(shè)備，如呼吸器或透析機(jī)；或傷口，如手術(shù)期間或之后的那些傷口。其它用途包括去除可能帶來進(jìn)一步生長方面的問題的靶細(xì)菌。在另外的實施方案中，使用hmw細(xì)菌素來處理受細(xì)菌感染或沾染的食品、 植物或植物的收獲部分，或用來處理如在醫(yī)院或商業(yè)環(huán)境中的靶細(xì)菌的環(huán)境事件。
如本文所描述，抗菌的R-型細(xì)菌素可用于抑制特定細(xì)菌的生長、存活或復(fù)制。細(xì)菌可能是病原性的或?qū)Νh(huán)境有害的菌株，或可以預(yù)防性的方式處理。病原性微生物通常引起疾病，有時僅在特定的情況下。
艱難梭菌素的制備和用途
艱難梭菌素是大約一千萬道爾頓的顆粒，因此可以通過差速離心、差速過濾、水兩相分離、聚乙二醇(PEG)沉淀和/或離子交換色譜法來分離并純化，以產(chǎn)生生物制藥等級的口服抗菌劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)R-型細(xì)菌素對凍融穩(wěn)定并且可以進(jìn)行噴霧干燥以產(chǎn)生穩(wěn)定的制劑。
在本發(fā)明的一些實施方案中，提供生產(chǎn)R-型hmw細(xì)菌素的方法。所述方法包括將含有編碼可操作地連接至對誘導(dǎo)劑敏感的可誘導(dǎo)的啟動子上的R-型hmw細(xì)菌素的核酸序列的生產(chǎn)細(xì)胞暴露于引起R-型細(xì)菌素表達(dá)的濃度的誘導(dǎo)劑，以及純化表達(dá)的R-型細(xì)菌素。 在一方面，R-型高分子量(hmw)細(xì)菌素含有選自由SEQ ID NO :2_23或SEQ ID NO 49以及 62-80組成的組的一種或多種多肽。核酸分子與生產(chǎn)細(xì)胞的天然核酸是異源的并且可能包含在生產(chǎn)細(xì)胞的染色體中或可能包含在游離表達(dá)載體中。
如果被靶向，將使用強(qiáng)抗菌劑_艱難梭菌素將艱難梭菌從人或其它動物的較低GI 道去除或去定植，以便預(yù)防CDAD。用廣譜抗生素治療的人或動物如果已經(jīng)被艱難梭菌定植， 那么它們有潛在地發(fā)展致命CDAD的高風(fēng)險。去定植是艱難梭菌素的特別有吸引力的功用， 因為它們空出健康的GI微生物區(qū)。另外，艱難梭菌素可被直接或經(jīng)由施用的能產(chǎn)生艱難梭菌素的生產(chǎn)細(xì)胞或解毒的艱難梭菌細(xì)菌的孢子間接施用，以降低急性CDAD中的病原體負(fù)載和/或降低通過其它形態(tài)成功治療之后CDAD的高發(fā)生率或重現(xiàn)或復(fù)發(fā)。
施用方式
R-型細(xì)菌素被4. O或更低的pH-正常運作的進(jìn)食胃和上十二指腸的酸度滅活。然而，艱難梭菌素必須經(jīng)過上GI道以到達(dá)主要定植下GI道的靶細(xì)菌病原體。因此，艱難梭菌素可以通過一種或數(shù)種這樣的已知方法來配制，即保護(hù)脆弱的試劑免于上GI道的酸和蛋白酶的損害并且將這種試劑以活性狀態(tài)遞送至遠(yuǎn)側(cè)的上GI道或下GI道。此外，可以用抗組胺藥(如西咪替丁)或質(zhì)子泵抑制劑來治療動物，以在口服施用R-型細(xì)菌素之前預(yù)防胃酸化。因此，向胃正常的人或動物或其酸化已被藥學(xué)上預(yù)防的那些人或動物口服施用適當(dāng)配制的艱難梭菌素、能夠產(chǎn)生艱難梭菌素的生產(chǎn)細(xì)胞，或產(chǎn)艱難梭菌素的解毒的艱難梭菌細(xì)菌的孢子，將能夠遞送至腸的定植部分并且從而保證功效。基于腸通過時間，每次向去定植的無癥狀人或動物直接或間接口服施用艱難梭菌素的頻率可以是每6小時、每12小時、 每18小時、每24小時、每周，或每月一次。還可以將艱難梭菌素施用于患有CDAD，或最近 CDAD被“治愈”的患者，頻率相同或更大。特別是對于活性CDAD的管理，可將艱難梭菌素配制用于直接或間接經(jīng)直腸通過栓劑、灌腸劑或結(jié)腸灌注來施用。
本公開內(nèi)容的工程化艱難梭菌素可施用于任何患有、確診患有，或疑似患有對艱難梭菌素易感的細(xì)菌引起的感染或沾染的受試者。這樣的受試者的非限制性實例包括動物 (哺乳動物、爬行類動物、兩棲動物、鳥類，以及魚類)物種以及昆蟲、植物和真菌。哺乳動物物種代表性和非限制性的實例包括人；非人的靈長類動物；農(nóng)業(yè)相關(guān)的物種如牛、豬、山羊和綿羊；嚙齒動物，如小鼠和大鼠；用于陪伴、展覽或表演的哺乳動物，如犬、貓、豚鼠、兔和馬；以及用于工作的哺乳動物，如犬和馬。代表性和非限制性的鳥類物種包括雞、鴨、鵝，以及用于陪伴或顯示的鳥，如鸚鵡和長尾小鸚鵡。用本公開內(nèi)容的艱難梭菌素治療的動物受試者還可以是四足、兩足、水生動物、脊椎動物或無脊椎動物(包括昆蟲)。
在一些實施方案中，將治療的受試者是還未達(dá)到成熟的人類小孩或其它動物幼仔。因此本公開內(nèi)容包括兒科病狀(包括對本公開內(nèi)容的艱難梭菌素易感的細(xì)菌或其它微生物感染)的治療。
本公開內(nèi)容還提供治療或預(yù)防如由人受試者或非人動物的微生物菌群中存在的細(xì)菌的不希望的生長導(dǎo)致的機(jī)會性感染。機(jī)會性感染可能是因為受試者的免疫抑制狀態(tài)， 或是因為抗生素治療改變了泌尿生殖(GU)道或胃腸(GI)道的共生菌群。因此本公開內(nèi)容還提供對免疫抑制的受試者和暴露于其它藥學(xué)試劑的受試者的治療或預(yù)防。具有抗菌活性的艱難梭菌素可以和其它抗菌或抗微生物劑(如作為非限制性實例的抗生素或抗真菌劑) 組合使用。“抗微生物劑”是可以用于抑制單細(xì)胞有機(jī)體的生長，或?qū)⑵錃⑺赖脑噭┗蚧衔??？刮⑸飫┌股?、化療劑、抗體(有或沒有補(bǔ)體)、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)的化學(xué)抑制劑、或細(xì)胞壁的綜合體或功能物。
在一些實施方案中，艱難梭菌素、能夠產(chǎn)生艱難梭菌素的生產(chǎn)細(xì)胞，或解毒的艱難梭菌細(xì)菌的孢子用“藥學(xué)上可接受的”賦形劑、腸溶包衣或載體來配制。這樣的組分適合用于人、動物，和/或植物，而不造成過度的不良副作用。不良副作用的非限制性實例包括毒性、刺激，和/或變態(tài)反應(yīng)。賦形劑或載體通常與合理的效益/風(fēng)險比率相當(dāng)。非限制性藥學(xué)上合適的載體包括無菌水性或非水性溶液、懸浮液，以及乳劑。實例包括但不限于標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)賦形劑，如磷酸鹽緩沖鹽溶液、水、乳劑(如油/水乳劑)，以及各種類型的潤濕劑。非水性溶劑的實例是丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)，以及可注射的有機(jī)酯(如油酸乙酯)。水性載體包括水、醇/水溶液、乳劑或懸浮液，其包括鹽水和緩沖介質(zhì)。腸胃外媒介物包括氯化鈉溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化鈉、乳酸林格氏或不揮發(fā)性油。靜脈內(nèi)媒介物包括流體和營養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑(如基于林格氏右旋糖的那些)等。
本文公開的另外的制劑和藥學(xué)組合物包含對細(xì)菌病原體特異的分離的艱難梭菌素；二、三、五、十或二十個或更多個的靶向相同的細(xì)菌病原體的不同艱難梭菌素、能夠產(chǎn)生艱難梭菌素的生產(chǎn)細(xì)胞或解毒的艱難梭菌細(xì)菌的孢子的混合物；以及二、三、五、十或二十個或更多個的靶向不同的細(xì)菌病原體或相同細(xì)菌病原體的不同菌株不同艱難梭菌素、能夠產(chǎn)生艱難梭菌素的生產(chǎn)細(xì)胞或解毒的艱難梭菌細(xì)菌的孢子的混合物。
任選地，包含本公開內(nèi)容的艱難梭菌素或生產(chǎn)細(xì)胞的組合物還可使用本領(lǐng)域熟知的方法來噴霧干燥或凍干。隨后的復(fù)溶和使用可如本領(lǐng)域所已知的那樣實行。
艱難梭菌素通常以“安全并有效的”量或濃度使用，這指代足以產(chǎn)生所希望的治療反應(yīng)且沒有如以上所述的那些過度的不良副作用的量。艱難梭菌素還可以“治療上有效的”量或濃度使用，這指代有效生成所希望的治療反應(yīng)的量，如但不限于，有效減緩細(xì)菌細(xì)胞分裂的速率，或引起細(xì)菌細(xì)胞分裂的中斷，或引起死亡或細(xì)菌種群增長速率降低的量。安全并有效的量或治療上或預(yù)防上有效量因各種因素而變化，但可以由熟練的從業(yè)者容易地確定而無需過多的實驗。因素的非限制性實例包括所治療的具體條件、受試者的身體狀況、所治療的受試者的類型、治療的持續(xù)時間、并行療法的性質(zhì)(如有的話)，以及所采用的特定的制劑。
現(xiàn)在已經(jīng)一般性地描述了本發(fā)明的主題，通過參考以下實例對其將更容易理解， 所述實例以說明的方式提供，并且不旨在限制本公開內(nèi)容，除非指明。實施例
I.艱難梭菌素的殺菌活性的測定.
將艱難梭菌培養(yǎng)物在具有10% CO2UO% H2,80% N2的氣氛的Forma Scientific 環(huán)境室中嚴(yán)格的厭氧條件下培養(yǎng)。所有介質(zhì)、緩沖劑以及平板在使用之前在此氣氛下還原至少24小時。將培養(yǎng)物在艱難梭菌選擇性瓊脂平板(BD Diagnostics, BBL Cat. 222228) 上劃線，并且在37°C下孵育兩天。然后將這些平板作為備料在環(huán)境溫度下厭氧地儲存。
為了誘導(dǎo)艱難梭菌素，將艱難梭菌細(xì)菌在37°C下使用布魯氏菌介質(zhì)(Difco)在液體培養(yǎng)物中培養(yǎng)，不搖動。在大約O. 2的OD6tltl下，將絲裂霉素C添加至3 μ g/ml的最終濃縮物中。然后將培養(yǎng)物孵育3-16小時。通過目視培養(yǎng)物的清除來檢測細(xì)菌裂解。
將培養(yǎng)物從厭氧室中去除，并且通過5，OOOx g下的離心作用將細(xì)胞碎片去除。然后使上清液通過O. 2μπι的乙酸纖維素注射器式過濾器。將濾液在90，OOOx g下離心2小時以使艱難梭菌素顆粒成為沉淀。將沉淀以1/50初始培養(yǎng)物體積再懸浮于IOmM Tris pH 7. 5、50mM NaCl的3 %甘露醇中。
在37°C下，使靶菌株在布魯氏菌肉湯中過夜生長。將100 μ I的培養(yǎng)物體積添加至 5ml的調(diào)和的、還原的布魯氏囷的瓊脂覆層(O. 5%瓊脂)，倒在布魯氏囷的瓊脂板(I. 5%瓊脂)上并使其凝固。將5μ I的艱難梭菌素制品的樣品點滴在平板上并使其風(fēng)干(約30分鐘)。然后在37°C下將平板厭氧地孵育過夜。通過清除，或在將樣品涂覆于菌苔的位置或點無細(xì)菌生長來確定殺菌活性。
2. Cdl6艱難梭菌素基因座的克隆.
通過對基因組DNA的454儀器序列分析獲得艱難梭菌菌株Cdl6的基因組序列草圖。通過與菌株Cd630對比(參見上文)鑒別整個difl6基因座或簇(SEQ ID NO 1)0
制備主鏈BAC載體.起始載體是pETcocol (Novagen)。用具有BbsI端點的引物 AV1419(SEQ ID NO 24)和AV1420(SEQ ID NO 25)將其修飾以去除兩個XhoI位點。要做到這一點，將pETcocol DNA的特定區(qū)域用這些引物擴(kuò)增，并且隨后用BbsI切割PCR產(chǎn)物并連接回先前用XhoI切割過的較大pETcocol載體片段中。此連接破壞了 pETcocol的兩個 XhoI位點。然后通過類似的策略將后面的質(zhì)粒進(jìn)一步修飾以使用引物AV1416 (SEQ ID NO: 26)和AV1245(SEQ ID NO 27)破壞EcoRI位點。生成的載體稱為SW251。
制備pUC19載體以接納艱難梭菌素簇片段.通過用EcoRI和HindIII酶切并連接在寡 AV1372(SEQ ID NO :28)、AV1373 (SEQ IDNO :29)、AV1374 (SEQ ID NO :30)，以及 AV1375(SEQ ID NO 31)中修飾pUC19 (新英格蘭生物試驗室)的多聚接頭。這將多聚接頭17改變成 Notl-Nhel-KpnI-XhoI-EcoRV-BstBI-BbsI-EcoRI-NsiI-SphI-BamHI-AscI。稱其為 SW232。
將艱難梭菌素簇克隆至SW232中.通過來自Cdl6DNA的PCR將艱難梭菌素簇-SEQ ID NOl的三個片段單獨擴(kuò)增。將5’片段(SEQID NO 32)用分別具有Notl和Xhol端點的引物 1368 (SEQ ID NO 35)和 1289 (SEQ ID NO 36)擴(kuò)增。中間片段(SEQ ID NO 33)用分別具有Xhol 和 EcoRl 端點的引物AV1288(SEQ ID NO 37)和 AV1366(SEQ ID NO :38)擴(kuò)增。 3，片段(SEQ ID NO 34)用分別具有 EcoRI 和 BamHl 端點的引物 AV1367 (SEQ ID NO 39) 和AV1300(SEQ ID NO 40)擴(kuò)增。將這三個PCR片段單獨地克隆至SW232中，并且對于5’、 中間，以及3，部分分別稱為Sff24K SW242，以及SW243。
將艱難梭菌素簇克隆至BAC SW251中.將各自已經(jīng)被(通過在大腸桿菌中克隆) 擴(kuò)展并純化的艱難梭菌素簇的三個片段(在SW241、SW242，以及SW243中)從SW241、SW242， 以及SW243載體中切離。將SW241用NotI和XhoI酶切、SW242用XhoI和EcoRI酶切，并且SW243用EcoRI和AscI酶切。(注意此AscI位點是以上描述的修飾的SW232多聚接頭的一部分。)
將這三個片段組裝到首先用NotI和AscI酶切的SW251中。生成的質(zhì)粒稱為DG461 并且含有整個dif 16簇。它在大腸桿菌中被擴(kuò)增。
制成艱難梭菌素整合載體用于枯草芽孢桿菌中的表達(dá).使用枯草芽孢桿菌整合載體-pDRlll，它包括側(cè)接克隆/啟動子區(qū)域的amyE基因和耐奇放線菌素的基因的部分。
通過用HindIII和SphI酶切載體并連接在寡DGl (SEQ ID NO 41)和DG2 (SEQ ID NO 42)中來修飾pDRlll多聚接頭。這將NotI和AscI位點添加至pDRlll。然后將含有具有修飾的多聚接頭的整個amyE前和后區(qū)的區(qū)域使用都具有BsaI端點的引物DG9 (SEQ ID NO 43)和DGlO (SEQ ID NO 44)擴(kuò)增。將此片段連接至SW251的NotI和AscI位點(導(dǎo)致這兩個位點的毀壞)并且產(chǎn)生DG487。注意，存在通過pDRlll衍生的插入片段的修飾多聚接頭引入DG487中的新的NotI和AscI位點。
DG487在大腸桿菌中表達(dá)之后，然后將含有來自DG461的艱難梭菌素簇的NotI/ AscI片段切離并克隆至DG487的Notl/AscI位點中。這個新構(gòu)建體稱為DG488并且是用于將整個艱難梭菌素基因簇引入枯草芽孢桿菌中的載體(下文)。
3.艱難梭菌素基因簇在枯草芽孢桿菌中的表達(dá).
天然的艱難梭菌素生產(chǎn)者是艱難梭菌，一種專性厭氧菌。如果暴露于即使是微量的氧，艱難梭菌快速形成孢子并死亡。從艱難梭菌中生成即使微量的艱難梭菌素的能力也是困難且費力的，當(dāng)然在所要求的嚴(yán)格的厭氧條件下產(chǎn)生有用于預(yù)防或治療應(yīng)用的數(shù)量的艱難梭菌素是不實際的。因此，將來自艱難梭菌的整個艱難梭菌素基因簇首先鑒別然后通過分子克隆分離并將簇引入好氧革蘭氏陽性菌-枯草芽孢桿菌中，以進(jìn)一步工程化并生產(chǎn)。
枯草芽孢桿菌整合載體-DG488如實施例2所述來制造并且含有整個22，827堿基艱難梭菌素基因座(SEQ ID NO 1)0使用此載體將艱難梭菌素基因座重組入枯草芽孢桿菌基因組中。
受體枯草芽孢桿菌菌株是BDR123，它具有插入在amyE基因中的氯霉素抗性標(biāo)記。 當(dāng)用DG488轉(zhuǎn)移此菌株時，在載體和基因組amyE序列內(nèi)的前和后amyE序列之間發(fā)生重組。這導(dǎo)致包括艱難梭菌素基因座和奇放線菌素抗性基因的DG488的前和后amyE區(qū)域之間的所有序列插入BDR123基因組中。成功的重組體對奇放線菌素具有抗性但對氯霉素變得敏感，這是因為重組事件導(dǎo)致基因組標(biāo)記缺失。此枯草芽孢桿菌菌株稱為BDR123-488。
由于整個艱難梭菌素基因座插入DG488載體中(實施例2)，所以它也整體插入 BDR123-488中。此插入的艱難梭菌素基因座包括梭菌中的正常表達(dá)所需的所有調(diào)節(jié)基因， 并且結(jié)構(gòu)艱難梭菌素顆?；蚴苓@些基因和/或調(diào)節(jié)元素的控制。因為芽孢桿菌屬和梭菌屬是相關(guān)細(xì)菌，預(yù)計這些艱難梭菌素調(diào)節(jié)元素會在芽孢桿菌屬背景中起作用，并且如在其天然狀態(tài)中那樣通過RecA-介導(dǎo)的機(jī)制被DNA損傷誘導(dǎo)。實際情況正是如此，并且艱難梭菌素顆粒產(chǎn)生在BDR123-488中通過與DNA損傷劑絲裂霉素C相接觸被誘導(dǎo)，并且殺死菌株 Cdl9099(圖 7)。
相對于結(jié)構(gòu)基因，艱難梭菌素調(diào)節(jié)基因(0RF 1359、1360、1361)位于基因座的5’ 區(qū)。還存在調(diào)節(jié)基因(0RF 1377 (SEQ ID NO :20)、1378 (SEQ ID NO 21)以及 1379(SEQ ID NO :23))，其相對于結(jié)構(gòu)基因位于下游-3’。為了消除這些后面的調(diào)節(jié)基因，DG491從DG488 中以單一的三元連接生成。一個PCR片段通過使用引物DG13 (SEQ ID NO 45)和DG14(SEQ ID NO :46)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增從DG488制成，其它 的通過使用引物DG15(SEQ ID NO :47)和 DG16 (SEQ ID NO 48)進(jìn)行的PCR擴(kuò)增制成。兩種PCR片段均用AscI和SphI酶切。然后用 SphI酶切DG488，并且將兩種酶切的PCR片段連接至來自SphI-酶切的DG488的大載體片段中以產(chǎn)生DG491。將DG491轉(zhuǎn)移至BDR123(K)R123-491)中以生成重組的枯草芽孢桿菌，所述枯草芽孢桿菌含有缺乏 orfsl377(SEQ ID NO :20)、1378 (SEQ ID NO 21)以及 1379 (SEQ ID NO 23)的艱難梭菌素基因簇。當(dāng)暴露于絲裂霉素C時，缺乏這些ORF的修飾的艱難梭菌素基因簇如BDR123-488中的野生型艱難梭菌素簇那樣表達(dá)活性艱難梭菌素(圖7)。
4.來自多種艱難梭菌素的確定殺菌譜的序列的表征.
Cdl6艱難梭菌素基因座(SEQ ID NO :1)與Cd630，以及其它已被測序的Cd菌株 (QCD-66c26 ;QCD_23m63 ;QCD_32g58 ;QCD_63q42)和Cd4(SEQ ID NO 61)的基因座的對比顯示，所有的開放閱讀框(SEQ ID N0:1和61)共有89%-100%的氨基酸序列一致性(有一個例外)。例外是ORF 1374。
此例外的序列在所有測序的艱難梭菌素中是可變的并且盡管尺寸相似，共有的序列一致性僅有30%。艱難梭菌素簇中的ORF 1374的部分與受體結(jié)合域的相符。測定被分離的活性艱難梭菌素的ORF 1374的序列，并且發(fā)現(xiàn)他們在序列(SEQ ID NO 17,49-53)中也高度可變。這些序列的對比在圖8中示出。再者，分離的艱難梭菌素的殺菌譜(圖2)反映了 ORF 1374氨基酸序列的相似性或相異性(圖8)。例如，dif 16 (SEQ IDNO 17)和dif 126 (SEQ ID NO 52)的ORF 1374序列相差僅I個氨基酸，并且它們的殺菌譜幾乎一致。而 dif 16 (SEQ ID NO 17)和 dif 108 (SEQ IDNO :50)的 ORF 1374 序列相差 188 個氨基酸，并且它們的殺菌譜非常不同，少有重疊。為此，并且因為ORF 1374是基因簇中僅有的可變蛋白質(zhì)，推斷0RF1374是靶識別決定子并且是每個特定的艱難梭菌素的獨特殺菌譜的原因。
5.枯草芽孢桿菌中Dif4的克隆和表達(dá).
通過與用于艱難梭菌素16的那些方法類似的方法從Cd4克隆艱難梭菌素4基因座。然而，由于dif4基因簇-SEQ ID NO :61中EcoRI位點的缺乏，需要一些修飾。使用寡 DG211-SEQ ID NO 57和DG212—SEQ ID NO 58將質(zhì)粒SW251 (參見以上實施例2)修飾成在多聚接頭中具有XhoI位點，以分別引入NotI和AscI位點。這產(chǎn)生載體DG577。
來自Cd4DNA的艱難梭菌素基因簇在三個片段中得到擴(kuò)增。首先使用引物 DG210(SEQ ID NO 59)和 AV1288(SEQ ID NO 37)以引入 XhoI 和 NcoI 位點。其次使用引物 DG209(SEQ ID NO 60) DG15 (SEQ ID NO 47)以引入 NcoI 和 AscI 位點。這兩個被克隆至預(yù)先用XhoI/AscI切割的DG577中以產(chǎn)生DG578。第三個片段使用AV1368(SEQ ID NO: 35)和AV1289(SEQ ID NO 36)來擴(kuò)增以引入XhoI和NotI位點，并且克隆至預(yù)先用XhoI和 NotI切割的DG578中以產(chǎn)生DG579。含有dif4簇(SEQ ID NO 61)的此后者構(gòu)建體是用于 dif 16的DG491的等效物，即它缺少orfl377、orfl378和orfl379_這些對艱難梭菌素不必要的結(jié)構(gòu)基因的假定調(diào)節(jié)序列下游。用于將dif4簇引入枯草芽孢桿菌的整合載體是通過從DG579提取NotIAscI片段并將其克隆至DG487中來制成的(參見以上實施例2)。這個構(gòu)建體的質(zhì)粒是DG580。
為了在枯草芽孢桿菌中表達(dá)dif4，將含有dif4基因座沒有orf 1377-1379 (SEQ ID N061)的DG580重組至枯草芽孢桿菌基因組中。受體枯草芽孢桿菌菌株是BDR123，它具有插入在amyE基因中的氯霉素抗性標(biāo)記。當(dāng)用DG580轉(zhuǎn)移此菌株時，在載體和基因組amyE 序列內(nèi)的前和后amyE序列之間發(fā)生重組。這導(dǎo)致包括艱難梭菌素基因座和奇放線菌素抗性基因的DG580的前和后amyE區(qū)域之間的所有序列插入BDR123基因組中。成功的重組體對奇放線菌素具有抗性但對氯霉素變得敏感，這是因為重組事件導(dǎo)致基因組標(biāo)記缺失。此枯草芽孢桿菌菌株稱為BDR123-580。
此整合的dif4基因座包括艱難梭菌中的正常艱難梭菌素表達(dá)所要求的所有調(diào)節(jié)基因，并且如預(yù)期且如先前針對枯草芽孢桿菌中的dif 16所示，通過與絲裂霉素C相接觸在BDR123-580中誘導(dǎo)dif4顆粒產(chǎn)生(圖9)。因此，所呈現(xiàn)的實施例提供對于dif4和difl6 兩者的基因座的克隆及其各自在枯草芽孢桿菌(非病原性厭氧生產(chǎn)細(xì)菌的一種例子)中的表達(dá)。
6. Orf 1374決定艱難梭菌素的殺菌譜.
Orf 1374編碼大的預(yù)計的多肽( 200kDa)，質(zhì)譜法顯示它是純化的艱難梭菌素結(jié)構(gòu)的一部分。當(dāng)對比艱難梭菌素16和艱難梭菌素4的基因簇時，大多數(shù)基因產(chǎn)物，特別是預(yù)計為結(jié)構(gòu)組分的那些，在氨基酸水平上幾乎一致。這兩個簇之間的主要氨基酸序列差異是orfl374。為此原因以及以下討論的其它原因，推測此基因產(chǎn)物賦予艱難梭菌素的靶特異性。為了對此進(jìn)行測試，將dif 4的Orf 1374 ( S卩，編碼SEQ IDNO 49的序列)在DG580中用來自Cdl6的Orf 1374(8卩，編碼SEQ ID N0:17的序列)替代以產(chǎn)生DG587。如以上針對 difl6和dif4所提供，將DG587整合至枯草芽孢桿菌BDR123的基因組中以制成BDR123-587 重組體。
將生成的BDR123-587暴露于絲裂霉素，并且處理裂解物以便制備艱難梭菌素。生成的艱難梭菌素顆粒具有針對艱難梭菌菌株19145 (其對艱難梭菌素16敏感)的殺菌活性，并且失去殺死菌株19137 (其對dif4敏感)的能力(圖9)。
進(jìn)一步改善此實驗。構(gòu)造DG587使Orf 1373成為Cd4和Cdl6的嵌合體。這樣制成構(gòu)建體以使DG587的Orf 1373修復(fù)至與原始Cd41373_SEQ ID NO :78具有100%同一性， 從而產(chǎn)生是僅Orf 1374-SEQ IDNO :17的純替代物的構(gòu)建體。此構(gòu)建體稱為DG603。將此構(gòu)建體整合至枯草芽孢桿菌BDR123基因組中并且如以上所描述用絲裂霉素C誘導(dǎo)。生成的艱難梭菌素顆粒具有針對菌株19099和19145的殺菌活性，并且失去殺死19137的能力。 因此，艱難梭菌素的殺菌譜由orf 1374編碼的蛋白質(zhì)決定，并且改變的orf 1374改變艱難梭菌素的殺菌譜，如本文所證明。
7.沒有PBSX (當(dāng)RecA被激活時其不裂解)的生產(chǎn)細(xì)胞.
PBSX原噬菌體在野生型枯草芽孢桿菌中是普遍存在的。當(dāng)誘導(dǎo)時原噬菌體是有缺陷的，因為它具有發(fā)育不良的頭部結(jié)構(gòu)并且僅含有小的、隨機(jī)的DNA片段。它受RecA的控制，因此它被DNA損傷劑，如絲裂霉素C以及其它形式的對細(xì)菌的嚴(yán)重應(yīng)激誘導(dǎo)。當(dāng)被誘導(dǎo)時，它引起細(xì)菌裂解并且釋放PBSX顆粒。為了避免培養(yǎng)基沾染PBSX顆粒以及消除枯草芽孢桿菌生產(chǎn)細(xì)菌的裂解，當(dāng)通過修飾recA或dinR/lexA活性來調(diào)節(jié)艱難梭菌素表達(dá)時，將 PBSX基因簇從枯草芽孢桿菌BDRll細(xì)菌中消除。
PBSX敲除通過以下Liu等中列出的步驟來進(jìn)行。簡單來說，使用Liu論文中使用的引物和重疊延伸PCR技術(shù)，在芽孢桿菌阿拉伯糖啟動子-PaMA-neoK下將親本菌株BDRll 的araR基因刪除并用新霉素/卡那霉素抗性基因替代，以制成菌株BDG2。araR基因的此缺失通過PCR并且通過賦予針對卡那霉素的抗性來確認(rèn)。
接下來，制造DNA構(gòu)建體以自身刪除PBSX基因座。為了制成此構(gòu)建體，通過重疊延伸PCR法將以下五種PCR產(chǎn)物疊接至一個大的產(chǎn)物中l(wèi)kb的xylB基因的序列5’，其擴(kuò)增自BDRll ；lkb的xylA基因的序列3’，其擴(kuò)增自BDRll ;氯霉素抗性基因cat，其擴(kuò)增自 PJW034 ;araR，其擴(kuò)增自BDRll ;最后，Ikb的含有xylB基因的序列，其擴(kuò)增自BDRll0將重疊延伸PCR產(chǎn)物克隆至pUC19的XmaI和SpeI位點中。然后用SacH將此構(gòu)建體線性化并且轉(zhuǎn)移至菌株BDG2細(xì)菌中，它被涂覆在補(bǔ)充有5 μ g氯霉素/ml的LB瓊脂平板上。從此平板上采集菌落并將它們修補(bǔ)在補(bǔ)充有5 μ g氯霉素/ml或20 μ g卡那霉素/ml的LB瓊脂平板上。將對氯霉素抗性并對卡那霉素敏感的菌株在LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)4小時，不進(jìn)行抗生選擇，然后涂覆在補(bǔ)充有20 μ g卡那霉素/ml的LB瓊脂平板上。針對PBSX基因的存在，通過菌落PCR測試在這些平板上培養(yǎng)的菌落。PBSX基因簇的缺失通過在菌株BDG 9中測序在wt 菌株BD123中跨距PBSX基因位點的PCR產(chǎn)物來確認(rèn)。進(jìn)一步的分析顯示與枯草芽孢桿菌菌株BD123或BDG2不同，BDG9在3 μ g絲裂霉素C/ml的存在下不裂解或產(chǎn)生PBSX顆粒。
將PBSX缺失菌株-BDG9用質(zhì)粒DG580轉(zhuǎn)移，以產(chǎn)生BDG27。Cd4艱難梭菌素簇的整合通過奇放線菌素抗性來確認(rèn)。如以上所述培養(yǎng)并用絲裂霉素C誘導(dǎo)BDG27。16個小時之后，收獲并用BugBuster(Novagen)裂解細(xì)胞以破開所述細(xì)胞，這是因為沒有PBSX，我們預(yù)計艱難梭菌素會在細(xì)胞內(nèi)積聚。用BugBuster裂解細(xì)胞之后，通過離心作用去除碎片，并且測試上清液針對菌株19137的殺菌活性。BDG27產(chǎn)生的艱難梭菌素對Cdl9137顯現(xiàn)出活性，但對Cd 19099沒有活性，因此證明艱難梭菌素4在此非裂解的、PBSX缺失的菌株中產(chǎn)生。
與“包括”、“含有”或“特征在于”互換使用的術(shù)語“包含”是包括性或開放式的語言并且不排除額外的、未列舉的元素或方法步驟。短語“由...組成”排除了在權(quán)利要求中未指明的任何元素、步驟、或成分。短語“基本上由...組成”將權(quán)利要求的范圍限定為指明的材料或步驟以及實質(zhì)上并不影響所要求保護(hù)的發(fā)明的基本的和新穎的特征的那些材料或步驟。本公開內(nèi)容涵蓋本發(fā)明組合物的實施方案以及對應(yīng)這些短語各個范圍的方法。 因此，包含所列舉的元素或步驟的組合物或方法涵蓋其中所述組合物或方法基本上由或由這些元素或步驟組成的具體實施方案。
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現(xiàn)在已經(jīng)充分描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)理解，本發(fā)明可以在大范圍的等效參數(shù)、濃度和條件下進(jìn)行，而不會偏離本發(fā)明的精神和范圍，并且無需過多的實驗。
盡管已經(jīng)連同其特定的實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)理解本發(fā)明能夠進(jìn)一步修改。本申請旨在覆蓋大體上符合本發(fā)明的原則并且包括屬于本發(fā)明涉及的本領(lǐng)域內(nèi)已知或習(xí)慣做法以及可應(yīng)用于上文中陳述的必要特征的本公開內(nèi)容的這類變更的本發(fā)明的任何變化、使用或改編。
盡管已經(jīng)參考以上實施例對本發(fā)明進(jìn)行了描述，應(yīng)理解修改和變化涵蓋在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明僅受以下權(quán)利要求書限制。
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權(quán)利要求
1.一種編碼R-型高分子量(hmw)細(xì)菌素的分離的核酸分子，其中所述核酸分子來自艱難梭菌的菌株的基因組，并且其中所述R-型hmw細(xì)菌素包含多肽，所述多肽與選自由SEQID NO :4-16、18、19，以及66-80組成的組的多肽具有至少80%同一性，并且所述R-型hmw細(xì)菌素具有與艱難梭菌的至少一種其它菌株的受體結(jié)合的受體結(jié)合域(RBD)，并且具有針對艱難梭菌的至少一種其它菌株的殺菌活性。
2.如權(quán)利要求I所述的核酸分子，其中所述核酸分子來自選自由以下各項組成的組的艱難梭菌菌株的基因組Cd4、Cdl6、Cdl9108、Cdl9123、Cdl9126、Cdl9145，以及 ATCC 登記號43593。
3.如權(quán)利要求I所述的核酸分子，其中所述R-型hmw細(xì)菌素包含SEQID NO: 16或78的所述多肽。
4.如權(quán)利要求I所述的核酸分子，其中所述RBD包含與選自由SEQIDNO :17以及49-53組成的組的多肽具有至少80%同一性，或與含有選自由SEQ ID NO 54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域的多肽具有至少80%同一性的多肽。
5.如權(quán)利要求4所述的核酸分子，其中所述受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域包含SEQID NO:54,55或56的氨基酸殘基51到羧基末端殘基。
6.如權(quán)利要求I所述的核酸分子，其中所述R-型hmw細(xì)菌素包含SEQID NO 4-16U8以及19的所述多肽；或SEQ ID NO :66-80的所述多肽。
7.如權(quán)利要求I所述的核酸分子，其中所述R-型hmw細(xì)菌素包含SEQID NO: 16或78的所述多肽，其中所述核酸分子進(jìn)一步包含編碼R-型hmw細(xì)菌素、感染艱難梭菌的噬菌體，或其修飾形式的受體結(jié)合域(RBD)的異源序列，并且其中所述修飾形式具有不同于未修飾的RBD的殺菌譜。
8.如權(quán)利要求7所述的分離的核酸分子，其中所述RBD是選自由SEQID NO 17以及49-53組成的組的天然RBD的修飾形式或選自由SEQ ID NO 54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域，其中所述修飾形式與所述天然RBD具有至少80%同一性。
9.如權(quán)利要求2所述的核酸分子，其中所述菌株是Cdl6并且所述核酸分子包含SEQIDNO :1，或者所述菌株是Cd4并且所述核酸分子包含SEQ ID NO:61。
10.一種由權(quán)利要求I至9中的任一項所述的核酸分子編碼的分離R-型hmw細(xì)菌素。
11.一種包含如權(quán)利要求I至9中的任一項所述的核酸分子的表達(dá)盒。
12.如權(quán)利要求11所述的表達(dá)盒，其中所述核酸分子被可操作地連接至異源啟動子。
13.如權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒，其中所述啟動子是可誘導(dǎo)的或可阻抑的。
14.如權(quán)利要求13所述的表達(dá)盒，其中所述啟動子通過小分子誘導(dǎo)劑或去阻抑物來誘導(dǎo)。
15.如權(quán)利要求12所述的表達(dá)盒，其進(jìn)一步包含recA基因，所述recA基因編碼組成性活性RecA蛋白并且受響應(yīng)于小分子誘導(dǎo)劑或去阻抑物的異源啟動子的控制。
16.一種生產(chǎn)細(xì)胞，其包含如權(quán)利要求11至15中的任一項所述的表達(dá)盒。
17.—種生產(chǎn)細(xì)胞，其在它的染色體內(nèi)包含如權(quán)利要求I至9中的任一項所述的核酸分子。
18.如權(quán)利要求16或權(quán)利要求17所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述細(xì)胞是非病原性的且非專性的厭氧菌。
19.如權(quán)利要求18所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述非病原性的且非專性的厭氧菌是來自選自由芽孢桿菌屬、乳桿菌屬以及李斯特菌屬組成的組的細(xì)菌屬的物種。
20.如權(quán)利要求19所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述物種是枯草芽孢桿菌。
21.如權(quán)利要求20所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述枯草芽孢桿菌缺乏PBSX基因簇。
22.—種具有殺菌活性的分離的R-型高分子量(hmw)細(xì)菌素，其中所述R-型hmw細(xì)菌素包含梭菌屬的細(xì)菌的第一物種的第一菌株的基板附著區(qū)(BPAR)，以及來自所述第一物種的第二菌株，或所述梭菌屬或感染梭菌種的噬菌體的第二物種的受體結(jié)合域(RBD)，其中所述細(xì)菌素具有針對艱難梭菌的至少一種菌株的殺菌活性。
23.如權(quán)利要求22所述的R-型hmw細(xì)菌素，其中所述BPAR來自艱難梭菌的第一菌株并且所述RBD來自艱難梭菌的第二菌株或來自感染艱難梭菌的噬菌體。
24.如權(quán)利要求22所述的分離的R-型hmw細(xì)菌素，其中所述BPAR與含有SEQIDNO16或78的50個或更多個連續(xù)氨基酸或含有SEQID NO 54-56的50個或更多個連續(xù)氨基酸的多肽具有至少80%同一性。
25.如權(quán)利要求22所述的R-型hmw細(xì)菌素，其中所述RBD與選自由SEQID NO : 17以及49-53組成的組的多肽具有至少80%同一性，或與包含選自由SEQ ID NO 54-56組成的組的多肽的受體結(jié)合域(RBD)區(qū)域的多肽具有至少80%同一性。
26.—種產(chǎn)生R-型hmw細(xì)菌素的方法，其包括 將包含可操作地連接至可誘導(dǎo)的啟動子的如權(quán)利要求I至9中的任一項所述的核酸分子的生產(chǎn)細(xì)胞暴露于有效誘導(dǎo)R-型hmw細(xì)菌素表達(dá)的濃度的誘導(dǎo)劑，以及 純化所述表達(dá)的R-型細(xì)菌素。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，其中編碼所述R-型細(xì)菌素的所述核酸分子與所述生產(chǎn)細(xì)胞的基因組是異源的，并且其中所述核酸分子包含在所述生產(chǎn)細(xì)胞的染色體中，或包含在所述生產(chǎn)細(xì)胞內(nèi)的染色體外表達(dá)載體中。
28.如權(quán)利要求26或權(quán)利要求27所述的方法，其中所述生產(chǎn)細(xì)胞是非病原性的且非專性的厭氧菌。
29.如權(quán)利要求28所述的方法，其中所述非病原性的且非專性的厭氧菌是來自選自由芽孢桿菌屬、乳桿菌屬以及李斯特菌屬組成的組的細(xì)菌屬的物種。
30.如權(quán)利要求29所述的方法，其中所述物種是枯草芽孢桿菌。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中所述枯草芽孢桿菌當(dāng)被誘導(dǎo)以產(chǎn)生所述R-型細(xì)菌素時不裂解。
32.如權(quán)利要求31所述的生產(chǎn)細(xì)胞，其中所述枯草芽孢桿菌缺乏PBSX基因簇。
33.一種殺死艱難梭菌的方法，其包括使所述病原菌與權(quán)利要求10或權(quán)利要求22所述的R-型細(xì)菌素相接觸，借此所述R-型細(xì)菌素結(jié)合并殺死所述病原菌。
34.如權(quán)利要求33所述的方法，其中所述艱難梭菌是在動物中并且將殺菌量的所述R-型細(xì)菌素施用于所述動物。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其中所述動物是哺乳動物。
36.如權(quán)利要求35所述的方法，其中所述哺乳動物是人。
37.一種治療動物中艱難梭菌感染的方法，其包括向有需要的動物施用一定量的如權(quán)利要求16至21中的任一項所述的生產(chǎn)細(xì)胞以產(chǎn)生殺菌量的所述細(xì)菌素，從而治療所述感染。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中編碼所述細(xì)菌素的所述核酸分子受Iac啟動子的控制。
全文摘要
本公開內(nèi)容涉及編碼R-型高分子量細(xì)菌素的整簇基因的發(fā)現(xiàn)和分離，所述R-型高分子量細(xì)菌素特異性殺死艱難梭菌細(xì)菌-危險的人病原體。還公開了在無害生產(chǎn)細(xì)胞中生產(chǎn)R-型細(xì)菌素的方法，與艱難梭菌不同，所述無害生產(chǎn)細(xì)胞在氧的存在下不死亡。還公開了確定R-型細(xì)菌素的殺菌譜的分離基因簇的特異性基因，以及這樣的證明可以通過工程化艱難梭菌素遺傳基因座的orf1374來改變艱難梭菌素的殺菌譜。本發(fā)明提供一種強(qiáng)殺菌劑和制成它的方法，以便選擇性地殺死胃腸道環(huán)境中的艱難梭菌細(xì)菌，在胃腸道環(huán)境中它們對受感染的人或家畜造成巨大的傷害甚至死亡。
文檔編號C12N15/09GK102947329SQ201180028983
公開日2013年2月27日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年5月27日
發(fā)明者D·M·肖爾, D·M·格布哈特, S·R·威廉姆斯, G·R·戈沃尼, D·W·馬汀 申請人:阿維德百奧提克斯股份有限公司