專利名稱：使用來自體液的樣本檢測橫紋肌肉瘤的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用來自體液的樣本檢測橫紋肌肉瘤的方法。
背景技術(shù)：
本發(fā)明人等專心致力于使用血清中來自腫瘤的游離DNA的非侵襲性診斷技術(shù)的開發(fā)(非專利文獻1、2)。近年來,證明了不被翻譯為蛋白質(zhì)的叫做microRNA (miRNA)的非編碼RNA的存在，并報告其表達譜為組織或腫瘤特異性的(非專利文獻3、4)。在兒童癌癥中使用細胞株的研究中，有表達譜因腫瘤而異的報告(非專利文獻5)。另外，作為在兒童癌癥中最多的軟組織肉瘤的橫紋肌肉瘤中，明確了在肌肉中特異性表達的miRNA的表達上升(非專利文獻5、6)。另一方面，明確了血清中存在來自腫瘤的miRNA，這教導(dǎo)了在大腸癌、淋巴瘤、前列腺癌、肝癌等中miRNA作為生物標(biāo)記是有用(非專利文獻7 10)。

現(xiàn)有技術(shù)文獻非專利文獻非專利文獻I:Gotoh, et al.J Clin Oncol 23:5205-5210, 2005非專利文獻2:Yagyu, et al.Clin Cancer Res 14:7011-7019, 2008非專利文獻3:Calin GA, et al.Nat Rev Cancer;6:857-866, 2006非專利文獻4:Lu J, et al.Nature; 435:834-838，2005非專利文獻5:Wei JS, et al.Clin Cancer Res; 15:5560-5568，2009非專利文獻6:Subramanian S, et al.0ncogene; 27:2015-2026, 2008非專利文獻7:Ng EKO’et al.Gut; 58:1375-1381，2009非專利文獻8 =Mitchell PS, et al.PNAS; 105:10513-10518，2008非專利文獻9:Lawrie CH, et al.Br J Haematol; 141:672-675，2008非專利文獻10:Yamamoto Y, et al.Biomarkers; 14:529-538, 2009

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題本發(fā)明的目的在于提供容易地檢測出難以診斷的橫紋肌肉瘤的方法。解決問題的方法對于來自兒童腫瘤患者的體液的樣本，本發(fā)明的發(fā)明人等對作為在肌肉中特異性表達的miRNA群的hsa-miR-1、133a、133b、206進行定量，針對橫紋肌肉瘤的非侵襲性診斷是否能夠進行了研究。其結(jié)果，發(fā)現(xiàn)能夠通過這些miRNA來檢測出橫紋肌肉瘤。本發(fā)明提供以下的橫紋肌肉瘤的檢測方法。項目1.一種橫紋肌肉瘤的檢測方法，其特征在于，對于來自體液的樣本，評價選自hsa-miR-1、hsa_miR-133a、hsa_miR-133b 和 hsa-miR-206 中的至少 I 種 miRNA 的表達。項目2.項目I中記載的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其中，檢測的標(biāo)準(zhǔn)為:在來自體液的樣本中，選自 hsa-miR-1、hsa_miR-133a、hsa_miR-133b 和 hsa-miR-206 中的至少 I 種的表達量相比于健康人顯著亢進。項目3.項目1中記載的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其特征在于，評價選自hsa-miR-133a, hsa_miR-133b 和 hsa-miR-206 中的至少 I 種 miRNA 的表達。項目4.項目1中記載的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其特征在于，至少評價hsa-miR-206 的表達。項目5.項目1中記載的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其中，通過實時PCR(Real TimePCR )法進行檢測。項目6.項目1中記載的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其中，體液為血液，來自體液的樣本為血衆(zhòng)或血清。發(fā)明的效果橫紋肌肉瘤為難以診斷的腫瘤之一，但本發(fā)明使用以往一直認為不可能用于檢測的來自體液的樣 本就能夠檢測出橫紋肌肉瘤。就橫紋肌肉瘤而言，在化學(xué)療法、放射線療法之前將腫瘤完全切除對于預(yù)后的改善很重要，在術(shù)前進行臨時診斷以確定初次以完全切除為目標(biāo)的手術(shù)方案很重要的。本發(fā)明能夠更準(zhǔn)確且迅速地實現(xiàn)橫紋肌肉瘤的診斷，能夠期待提高橫紋肌肉瘤的治療效果。



圖1表示在橫紋肌肉瘤細胞株中,肌肉特異性microRNA的表達允進?？v軸是肌肉特異性miRNA和hsa-miR-16之比。RMS:橫紋肌肉瘤、NB:成神經(jīng)細胞瘤、EWS:尤文氏肉瘤、MRT:惡性橫紋肌樣腫瘤。圖2表示在橫紋肌肉瘤腫瘤樣本中，肌肉特異性microRNA的表達亢進。縱軸是肌肉特異性miRNA和hsa-miR-16之比。RMS:橫紋肌肉瘤、nonRMS:橫紋肌肉瘤以外的腫瘤。圖3 表不 hsa-miR-1、hsa-miR-206> hsa_miR-133a、hsa_miR-133b 的橫紋肌肉瘤細胞株的培養(yǎng)上清的表達量?？v軸是肌肉特異性miRNA和hsa-miR-16之比。RMS:橫紋肌肉瘤、NB:成神經(jīng)細胞瘤、EWS:尤文氏肉瘤、MRT:惡性橫紋肌樣腫瘤。圖4是健康人、癌癥患兒、橫紋肌肉瘤(RMS)患兒的血清hsa-miR-1的比較。縱軸是hsa-miR-l/hsa-miR-16比。RMS:橫紋肌肉瘤、nonRMS:橫紋肌肉瘤以外的腫瘤。圖5是健康人、癌癥患兒、橫紋肌肉瘤(RMS)患兒的血清hsa-miR-133a的比較?？v軸是hsa-miR-133a/hsa_miR-16比。RMS:橫紋肌肉瘤、nonRMS:橫紋肌肉瘤以外的腫瘤。圖6是健康人、癌癥患兒、橫紋肌肉瘤(RMS)患兒的血清hsa-miR-133b的比較?？v軸是hsa-miR-133b/hsa_miR-16比。RMS:橫紋肌肉瘤、nonRMS:橫紋肌肉瘤以外的腫瘤。圖7是健康人、癌癥患兒、橫紋肌肉瘤(RMS)患兒的血清hsa-miR-206的比較。縱軸是hsa-miR-206/hsa-miR_16比。RMS:橫紋肌肉瘤、nonRMS:橫紋肌肉瘤以外的腫瘤。圖8表示治療后的RMS患兒中肌肉特異性miRNA/hsa-miR-16比的降低?？v軸是肌肉特異性miRNA/hsa-miR-16比。圖9表示人血清中miRNA的穩(wěn)定性。在4°C保存下驗證了血清microRNA的穩(wěn)定性。就hsa-miR-16、hsa-miR-133b兩者而言，Ct值隨著保存期間的延長有漸增趨勢，在第30天上升了 3到4 (絕對量降低為1/16到1/8)。另一方面，對于hsa-miR-133b/has-miR-16沒有確認到大的變化。
圖10表示血清肌肉特異性miRNA對橫紋肌肉瘤病勢的反映。圖11表示在橫紋肌肉瘤患兒的血清以外的體液(腦脊液、胸腔積液)中也檢測到肌肉特異性miRNA。圖12表示體液中的肌肉特異性miRNA對橫紋肌肉瘤病勢的反映。
具體實施例方式本發(fā)明中作為檢測對象的hsa-miR-1、hsa_miR-133a、hsa_miR-133b 和hsa-miR-206的序列表示如下。另外，將因表達高、組織間的表達偏差少而能夠作為內(nèi)對照使用的hsa-miR-16的序列一并不于表I。表I
權(quán)利要求
1.一種橫紋肌肉瘤的檢測方法，該方法包括:對于來自體液的樣本，評價選自hsa-miR-1、hsa_miR-133a、hsa_miR-133b 和 hsa-miR-206 中的至少 I 種 miRNA 的表達。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其中，其檢測的標(biāo)準(zhǔn)為:與健康人相匕匕，來自體液的樣本中選自 hsa-miR-l、hsa_miR-133a、hsa_miR-133b 和 hsa-miR-206 中的至少I種的表達量明顯亢進。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其中，評價選自hsa-miR-133a、hsa-miR-133b 和 hsa-miR-206 中的至少 I 種 miRNA 的表達。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其中，至少評價hsa-miR-206的表達。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其中，通過實時PCR法進行檢測。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的橫紋肌肉瘤的檢測方法，其中，體液為血液，來自體液的樣本為血衆(zhòng)或 血清。
全文摘要
本發(fā)明提供一種橫紋肌肉瘤的檢測方法，其特征在于，對于來自體液的樣本，評價選自hsa-miR-1、hsa-miR-133a、hsa-miR-133b和hsa-miR-206中的至少1種miRNA的表達。
文檔編號C12Q1/68GK103108953SQ201180028448
公開日2013年5月15日 申請日期2011年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月8日
發(fā)明者細井創(chuàng), 宮地充 申請人:京都府公立大學(xué)法人, Lsip基金運營聯(lián)合公司