專利名稱：β-內(nèi)酰胺酶抗藥性的質(zhì)譜測(cè)量的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及產(chǎn)生β -內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌的抗藥性的確定，包括〃超廣譜β -內(nèi)酰胺酶 〃 (ESBL)?，F(xiàn)有技術(shù)
我們可以快速輕松地對(duì)許多微生物類型，特別是細(xì)菌和單細(xì)胞真菌，進(jìn)行質(zhì)譜鑒定將少量微生物從普通方法培養(yǎng)的菌落或從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中的菌落轉(zhuǎn)移到質(zhì)譜樣品載板， 并在載板中與含有基質(zhì)的溶液混合，然后在基質(zhì)輔助激光解吸電離后進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)量。如果在微生物中的蛋白質(zhì)有足夠的濃度，則質(zhì)譜圖可顯示特征蛋白質(zhì)的質(zhì)量和強(qiáng)度。該質(zhì)譜圖每次可顯示微生物中大約40至80種蛋白質(zhì)的峰值，可通過(guò)利用質(zhì)譜庫(kù)中成千上萬(wàn)的參照質(zhì)譜進(jìn)行相似性分析來(lái)確定其身份。這里〃鑒定〃 一詞表示分類學(xué)鑒定，例如，科、屬和種的確定。許多地方正在進(jìn)行研究，以便對(duì)具有成千上萬(wàn)微生物的參照質(zhì)譜庫(kù)進(jìn)行整理，這些是可靠的且經(jīng)過(guò)法律批準(zhǔn)的醫(yī)用質(zhì)譜(所謂的〃已驗(yàn)證〃的質(zhì)譜庫(kù))。
在許多研究中以及微生物實(shí)驗(yàn)室的日常工作中，這種鑒定微生物的方法已被證明非常成功。這種方法十分快速，成本低，而且誤差率極低，遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)微生物鑒定方法。
這些方法的特殊版本不僅可以用于鑒定微生物種類，而且還經(jīng)常用于鑒定亞種， 有時(shí)甚至用于鑒定株系，如果它們與常見(jiàn)且可質(zhì)譜檢測(cè)的蛋白質(zhì)在質(zhì)量和強(qiáng)度方面存在不同。關(guān)于更多詳細(xì)描述，請(qǐng)參閱專利申請(qǐng)例如DE 10 2009 032 649 Al (T. Maier和 M-Kostrzewa, 2009，US2011/0012016 Al;GB 2 471 746 Α)，其不僅提供了該方法的詳細(xì)說(shuō)明，而且還提供了更好的品種搜索方法。
微生物的鑒定對(duì)于傳染病特別是敗血癥非常關(guān)鍵。重要的一點(diǎn)是其能夠非常快速的鑒定病原體的種類，以便立即采取正確的治療措施。質(zhì)譜鑒定已在這些方面接受了試驗(yàn)和驗(yàn)證，目前正在逐漸獲得臨床和微生物實(shí)驗(yàn)室的認(rèn)可。
然而，在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域不僅需要快速鑒定，而且還需要檢測(cè)出對(duì)常用抗生素的抗藥性。 在不知道抗藥性的情況下將無(wú)法快速控制疾病。因此，不僅有必要進(jìn)行快速鑒定，而且還有必要快速確定并辨別微生物物種的抗藥性。人們已經(jīng)知道一些微生物物種對(duì)特定抗生素幾乎具有完全的抗藥性，因此在精確鑒定后才確定抗藥性毫無(wú)意義。然而，大多數(shù)情況下，物種會(huì)有無(wú)抗藥性的株系，還會(huì)有輕微抗藥性，特別是高抗藥性的株系，抗藥性會(huì)隨著抗生素種類的不同而不同。因此，確定抗藥性的類型和強(qiáng)度非常重要。
似乎顯而易見(jiàn)的是，質(zhì)譜儀不僅可用于分類學(xué)鑒定，而且還可用于確定微生物對(duì)特定抗生素的抗藥性，特別是細(xì)菌的抗藥性。但是，已證明這一任務(wù)非常艱巨。盡管抗藥性必須通過(guò)新蛋白質(zhì)或改性蛋白質(zhì)的存在來(lái)表示，但迄今為止還未證明可在質(zhì)譜儀測(cè)量的蛋白質(zhì)表達(dá)譜中直接進(jìn)行鑒定。畢竟，在微生物的成百上千或甚至成千上萬(wàn)的蛋白質(zhì)中， 質(zhì)譜圖內(nèi)僅能測(cè)量40至80種蛋白質(zhì)。因此必須間接地確定抗藥性。這種抗藥性確定的首次嘗試在文件 DE 10 2006 021 493 Β4(V. Govorun 和 J. Franzen;GB 2 438 066 B;US 2008/0009029 Al)中介紹；但是這種方法迄今為止還未得到認(rèn)可。該方法主要基于在加入抗生素后因細(xì)胞死亡而引起的蛋白質(zhì)表達(dá)譜的變化，亦或基于與抗藥性參照微生物的比較而確定的繁殖停止。
抗生素抗藥性一詞歸類了微生物種的特征(這里主要是細(xì)菌)，即減弱或完全中和抗生素活性物質(zhì)的作用。抗藥性現(xiàn)在很普遍，在美國(guó)，醫(yī)院內(nèi)獲得的大約70%的傳染性細(xì)菌都至少對(duì)一種抗生素具有抗藥性?；颊呓?jīng)常會(huì)傳染那些對(duì)若干種抗生素具有抗藥性的細(xì)菌株系(多抗藥性)。所謂的問(wèn)題細(xì)菌是指抗甲氧西林性金黃色葡萄球菌(MRSA)、假單胞菌屬、 帶有超廣譜β -內(nèi)酰胺酶(ESBL)抗藥性的大腸桿菌及結(jié)核分枝桿菌。由CDC(美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心)所做的評(píng)估認(rèn)為2004年在醫(yī)院有兩百萬(wàn)傳染病例，大約有九萬(wàn)人死亡，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于因交通事故或家庭或工業(yè)事故而導(dǎo)致的死亡人數(shù)。
日常使用的抗生素一詞通常表示用于治療細(xì)菌傳染性疾病的藥劑或藥物產(chǎn)品?？股卦卺t(yī)學(xué)界取得的巨大成功首先是青霉素。雖然青霉素取得了成功，但也首次出現(xiàn)了抗藥性，這促使研究人員去尋找和發(fā)現(xiàn)更多的抗生素鏈霉素、氯霉素、金霉素、四環(huán)素及許多其他抗生素?，F(xiàn)在已知的大部分抗生素都源自于自然物質(zhì)。通俗的講，青霉素現(xiàn)在是抗生素的代名詞。
青霉素是β -內(nèi)酰胺類抗生素。這些β -內(nèi)酰胺與青霉素結(jié)合蛋白(PBP)結(jié)合， 即負(fù)責(zé)形成加固細(xì)胞壁的肽鍵的肽聚糖轉(zhuǎn)肽酶。在β-內(nèi)酰胺和PBP間的結(jié)合導(dǎo)致PBP失效。隨著細(xì)菌的生長(zhǎng)，有效PBP的數(shù)量不足會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞壁損害，細(xì)胞膜會(huì)因此失去對(duì)滲透性的控制而無(wú)法調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)的濃度。短時(shí)間后細(xì)菌就會(huì)死亡。在極端條件下，可在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)觀察到完全〃破裂〃的細(xì)菌細(xì)胞。這是β-內(nèi)酰胺的殺菌方式。
自從首次使用青霉素后，細(xì)菌已逐漸發(fā)展出不同類型的抗藥性。細(xì)菌對(duì)β-內(nèi)酰胺產(chǎn)生抗藥性的一種重要類型是形成酶(β -內(nèi)酰胺酶)，這種酶通過(guò)水解，以催化的方式破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)，并因此致使β-內(nèi)酰胺失效?，F(xiàn)在已知的β-內(nèi)酰胺酶有340多種，由多種類型的細(xì)菌形成?？筛鶕?jù)細(xì)菌的總體結(jié)構(gòu)或作用方式將它們分成不同類別。通過(guò)突變最初產(chǎn)生的酶合成遺傳信息由染色體或質(zhì)粒繼承。質(zhì)粒信息可通過(guò)各種途徑在細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移，甚至可通過(guò)接觸在不同物種的細(xì)菌之間轉(zhuǎn)移("水平轉(zhuǎn)移")。根據(jù)β-內(nèi)酰胺酶的作用，可對(duì)青霉素酶和頭孢菌素酶進(jìn)行區(qū)別，但還有更多的類別。這 些酶的催化作用意味著少量的β_內(nèi)酰胺酶就足夠破壞大量的β_內(nèi)酰胺類抗生素。
現(xiàn)在存在大量β -內(nèi)酰胺類抗生素的衍生物，在它們中有若干種青霉素(芐青霉素、口服青霉素、氨基青霉素、異惡唑青霉素、?；被嗝顾?、頭孢菌素、單環(huán)β_內(nèi)酰胺類和碳青霉烯類。這些衍生物通常具有較大的化學(xué)基團(tuán)，以便對(duì)β_內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生空間位阻作用。反過(guò)來(lái)，超廣譜β -內(nèi)酰胺酶(ESBL)可分裂多種含有β -內(nèi)酰胺的抗生素。ESBL 最初由β-內(nèi)酰胺酶上的點(diǎn)突變形成。ESBL的基因位于可從細(xì)菌到細(xì)菌水平轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒上。
ESBL攜帶細(xì)菌對(duì)青霉素、頭孢菌素(1-4代)及單環(huán)β-內(nèi)酰胺類有抗藥性。攜帶 ESBL基因的主要是大腸桿菌和克雷伯氏菌(革蘭氏陰性菌)，但是微生物學(xué)家們焦慮地觀察到這些ESBL抗藥性的快速蔓延。除抗藥性金黃色葡萄球菌(MRSA)外，超廣譜β -內(nèi)酰胺酶(ESBL)是傳染研究中最令人擔(dān)心的菌類之一。
β -內(nèi)酰胺酶抑制劑是對(duì)抗β -內(nèi)酰胺酶的一種手段，與β -內(nèi)酰胺類一起使用以減弱存在于細(xì)菌中的β-內(nèi)酰胺酶的作用。已確立的組合是克拉維酸+氨基青霉素、舒巴坦+氨芐青霉素、他唑巴坦+哌拉西林。不是所有的組合都有最佳的作用。這些手段僅可在仔細(xì)鑒定細(xì)菌并謹(jǐn)慎確定其抗藥性后使用，因?yàn)檫@些手段也可能非常快速的失效。
在二十世紀(jì)的70年代和80年代，在抗生素領(lǐng)域進(jìn)行了很多科研活動(dòng)?，F(xiàn)在對(duì)新抗生素的研發(fā)已經(jīng)大大的減少了，盡管抗生素是世界上最常用的處方藥之一，占有13%的市場(chǎng)份額，它們是我們使用藥品的最大類別?，F(xiàn)在已知的抗生素物質(zhì)大概有8，000種，卻僅僅大約有80種用于治療，這主要是由于副作用和審批成本。根據(jù)德國(guó)聯(lián)邦藥品和醫(yī)療器械研究所(BfArM)的統(tǒng)計(jì)，2005年在德國(guó)總共有2，775種抗生素獲得批準(zhǔn)，但是僅僅涵蓋了大約80種抗生素物質(zhì)。
隨著時(shí)間的推移，微生物種對(duì)諸如殺細(xì)菌劑或殺真菌劑等抗生素產(chǎn)生抗藥性這一問(wèn)題會(huì)變得越來(lái)越緊迫。一方面，微生物種對(duì)不同類型的抗生素產(chǎn)生抗藥性的速度正在增加；而另一方面，正在研發(fā)的新的醫(yī)用抗生素越來(lái)越少。由于沒(méi)有作用，許多新抗生素不得不在投入市場(chǎng)一段時(shí)間后退出市場(chǎng)，對(duì)醫(yī)藥公司來(lái)說(shuō)，研發(fā)新的抗生素越來(lái)越困難，而投資這一領(lǐng)域的利潤(rùn)也越來(lái)越少。根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)，在1990到2005年間僅正式推出了 3種新的抗生素活性物質(zhì)，與之對(duì)比，1940到1950年間推出了 10種新的抗生素活性物質(zhì)， 1971到1980年間為5種新的抗生素活性物質(zhì)。
抗藥性快速增加的原因多種多樣不負(fù)責(zé)任濫用抗生素，甚至沒(méi)必要時(shí)也使用抗生素；在傳染媒介完全被破壞之前不負(fù)責(zé)任地中斷殺菌劑治療；在農(nóng)業(yè)和動(dòng)物飼養(yǎng)中不負(fù)責(zé)任地、經(jīng)常為純粹預(yù)防而使用抗生素。與非抗藥性物種相比，所有這些做法都促進(jìn)了抗藥微生物物種的選擇和傳播。
作為治療傳染病的新希望而聞名于上個(gè)世紀(jì)中葉的抗生素，現(xiàn)在正在快速地失去它的療效。避免這一趨勢(shì)的唯一希望就是有針對(duì)性地使用治療手段，而且治療必須全部完成，這需要快速鑒定傳染病原體和快速鑒定其對(duì)不同類型抗生素的特定抗藥性。
發(fā)明目的
發(fā)明目的是提供一種方法，即可以快速簡(jiǎn)單地通過(guò)質(zhì)譜測(cè)量來(lái)確定微生物、特別是細(xì)菌對(duì)不同類型的β-內(nèi)酰胺類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶抗藥性。發(fā)明概要
本發(fā)明提供了一種方法，即可非常方便快速地使用質(zhì)譜儀測(cè)量微生物由于β -內(nèi)酰胺酶而具有的抗藥性。該方法可在微生物與相應(yīng)的底物(β -內(nèi)酰胺類抗生素或定制 β-內(nèi)酰胺類衍生物)混合幾小時(shí)后，通過(guò)直接質(zhì)譜測(cè)量β_內(nèi)酰胺酶在底物上的水解破壞來(lái)確定其細(xì)菌的抗藥性。細(xì)菌在底物上產(chǎn)生的β_內(nèi)酰胺酶的催化作用導(dǎo)致β_內(nèi)酰胺環(huán)水解分裂開。底物量減少，取而代之的是出現(xiàn)水解的分裂產(chǎn)物，其質(zhì)量比抗生素多出18個(gè)原子質(zhì)量單位。
酶的分裂反應(yīng)非常迅速，但前提是其不會(huì)受到底物逐漸減少的影響，則每個(gè)分子反應(yīng)時(shí)間大約是I到100毫秒，不同的β-內(nèi)酰胺酶的特征差異也有所不同。測(cè)量反應(yīng)速度可提供關(guān)于β-內(nèi)酰胺酶類型和強(qiáng)度的初始信息。
原則上可使用任何質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)量，但是最好使用進(jìn)行細(xì)菌鑒定的同樣的基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。由于用于在幾百個(gè)原子質(zhì)量單位的較低質(zhì)量范圍內(nèi)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行電離的MALDI過(guò)程(基質(zhì)輔助激光解吸的電離)將會(huì)產(chǎn)生非常強(qiáng)的化學(xué)背景，因此最好使用位于低背景區(qū)域的底物。這可通過(guò)生成分子量在700到1，200原子質(zhì)量單位的定制底物來(lái)實(shí)現(xiàn)。還有利的是，增加底物的質(zhì)子親和力以增加電離程度。不僅如此， 如果能夠使用較高濃度的底物以增加靈敏度，效果會(huì)更好。為了使高濃度的高殺菌作用不會(huì)立即殺死細(xì)菌，可定制底物使得其抗生素作用(MIC值)相對(duì)較小。MIC是在相應(yīng)抗生素存在下通過(guò)β -內(nèi)酰胺酶抑制劑抑菌的"最低抑制濃度"，可作為測(cè)量抗藥性強(qiáng)度和抗生素強(qiáng)度的衡量指標(biāo)使用。
例如，較好的底物實(shí)例是通過(guò)共價(jià)鍵的方式將6-His標(biāo)簽與β-內(nèi)酰胺結(jié)合。 6-His標(biāo)簽由六個(gè)組氨酸組成，將分子量增加了大約800原子質(zhì)量單位，提高了質(zhì)子親和力，并且還可從反應(yīng)液體中提取純形式的底物及其分解產(chǎn)物。例如，這種提取可借助使用市售的磁珠進(jìn)行。在磁珠上有加載鎳離子的螯合物，其可通過(guò)可逆的方式結(jié)合6-His標(biāo)簽。 然后就可準(zhǔn)備MALDI樣品。該樣品的基質(zhì)包含經(jīng)過(guò)高度富集且提純的剩余底物及其分解產(chǎn)物，因此可實(shí)現(xiàn)非常靈敏的測(cè)量。
特別是，可通過(guò)引入若干種不同類型底物來(lái)測(cè)定特定的多抗藥性，但是不同底物的定制方式以及它們的引入濃度都必須確保其分解方式可用來(lái)鑒定細(xì)菌的類別以及 β-內(nèi)酰胺酶的作用強(qiáng)度。例如，底物可模仿與不同類別抗生素的β-內(nèi)酰胺環(huán)的接觸。


圖1中頂部的質(zhì)譜圖顯示了原子質(zhì)量單位為349. 41摩爾質(zhì)量的混合氨芐青霉素對(duì)于無(wú)抗藥性的DH5a株系大腸桿菌懸浮液的作用。氨芐青霉素(這里質(zhì)量為350原子質(zhì)量單位)和氨芐青霉素鈉鹽(質(zhì)量為372原子質(zhì)量單位)均未發(fā)生分解。相對(duì)而言，底部的質(zhì)譜圖顯示了 ESBL抗藥性株系大腸桿菌對(duì)氨芐青霉素及其鈉鹽的作用二者均被分解，分解產(chǎn)物的質(zhì)量分別為368和390原子質(zhì)量單位。
優(yōu)選的實(shí)施方式
本發(fā)明可提供了一種根據(jù)微生物(特別是細(xì)菌)產(chǎn)生β -內(nèi)酰胺酶來(lái)快速方便確定微生物抗藥性的方法。
該方法主要是向細(xì)菌懸浮液中加入一種或多種合適的底物。底物可以是β -內(nèi)酰胺類抗生素或更適宜的定制β-內(nèi)酰胺類衍生物。如果細(xì)菌具有β-內(nèi)酰胺酶抗藥性，則在合適的培養(yǎng)條件下經(jīng)過(guò)數(shù)分鐘至數(shù)小時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶會(huì)通過(guò)水解破壞β-內(nèi)酰胺環(huán)分解至少一種底物。β-內(nèi)酰胺酶對(duì)底物的水解可直接進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)量。底物量減少，取而代之的是水解的分裂產(chǎn)物，其質(zhì)量比抗生素多出18個(gè)原子質(zhì)量單位。
在圖1中，在兩個(gè)質(zhì)譜圖中使用β_內(nèi)酰胺類抗生素氨芐青霉素時(shí)，顯示僅在具有抗藥性時(shí)發(fā)生的這種水解。上部的質(zhì)譜圖顯示了原子質(zhì)量單位為349. 41摩爾質(zhì)量的氨芐青霉素與DH5a株系大腸桿菌懸浮液混合的結(jié)果。該株系沒(méi)有抗藥性。因此，可以看到氨芐青霉素(這里質(zhì)量為350原子質(zhì)量單位)和氨芐青霉素鈉鹽(質(zhì)量為372原子質(zhì)量單位)均未發(fā)生分解。相對(duì)而言，底部的質(zhì)譜圖顯示了 ESBL抗藥性株系大腸桿菌對(duì)氨芐青霉素及其鈉鹽的作用二者均被分解，分解產(chǎn)物的質(zhì)量分別為368和390原子質(zhì)量單位。
氨芐青霉素是一種半合成產(chǎn)品，抗菌活性藥物來(lái)自β_內(nèi)酰胺類抗生素(青霉素) 的基團(tuán)。因?yàn)槠淇梢种聘锾m氏陽(yáng)性病原體和一些革蘭氏陰性桿菌，因此作為廣譜抗生素而為人們所熟知。從化學(xué)角度上講，氨芐青霉素是一種氨基青霉素。
與所有β -內(nèi)酰胺類抗生素一樣，氨芐青霉素的殺菌(殺死細(xì)菌)作用是對(duì)以多種形式存在于不同細(xì)菌中的D丙氨酸轉(zhuǎn)肽酶的抑制作用。這種酶是細(xì)菌生長(zhǎng)和分裂階段形成新的堅(jiān)固細(xì)胞壁的必須物質(zhì)。這些轉(zhuǎn)肽酶也叫做青霉素結(jié)合蛋白(PBP)。抑制作用以附著形式進(jìn)行，β-內(nèi)酰胺環(huán)為附著基序。附著可阻止新的堅(jiān)固細(xì)胞壁的合成。細(xì)胞因此無(wú)法分裂，但最初仍能存活直至其生長(zhǎng)導(dǎo)致足夠多的細(xì)胞壁損壞從而導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。然而人體細(xì)胞的分裂和生長(zhǎng)卻不會(huì)受到阻礙，因?yàn)槿梭w細(xì)胞只有細(xì)胞膜，沒(méi)有細(xì)胞壁，因此沒(méi)有相應(yīng)的轉(zhuǎn)肽酶。
如圖1的示例中，將10微升濃度10毫克/毫升的氨芐青霉素水溶液加入到 Eppendorf試管內(nèi)。從細(xì)菌中選取三組菌落來(lái)進(jìn)行試驗(yàn)，然后將這些菌落放置于10微升的氨芐青霉素溶液中進(jìn)行重新懸浮處理。然后將容器在攪拌作用下置于37° C下培養(yǎng)3小時(shí)。在完成培養(yǎng)后，將其以13000轉(zhuǎn)/分的速度離心分離2分鐘，以便將細(xì)胞分離出來(lái)。剩余的氨芐青霉素和水解反應(yīng)產(chǎn)物現(xiàn)在處于上清液中。
原則上可使用任何質(zhì)譜儀進(jìn)行測(cè)量，但是最好使用進(jìn)行細(xì)菌鑒定的同樣的MALDI 飛行時(shí)間質(zhì)譜儀。為此，從該上清液中取1. 5微升置于質(zhì)譜樣品載板上。樣品干燥以后，將樣品包涂I微升基質(zhì)溶液。使用的基質(zhì)是α-氰-4-羥基肉桂酸(HCCA)，其與水混合，濃度為10暈克/暈升,其中含50%乙腈和2. 5%三氟乙酸。樣品再次干燥后,可米用普通的方法使用MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜儀取得制劑的質(zhì)譜。
作為該示例底物的氨芐青霉素的濃度非常高，要高出治療所需濃度的1000多倍。 事實(shí)是這個(gè)數(shù)量下的氨芐青霉素也被分解，顯示了超廣譜β_內(nèi)酰胺酶(ESBL)的非凡作用。很難想象細(xì)菌可在這種高濃度下長(zhǎng)時(shí)間存活，然而，在其壽命期間釋放的少量β-內(nèi)酰胺酶就足可以催化分裂大量的底物。選擇高濃度是因?yàn)榭梢郧宄乜吹礁哂诖速|(zhì)量范圍內(nèi)的高化學(xué)背景的信號(hào)。如果使用質(zhì)量范圍大約在800到1000的原子質(zhì)量單位的底物，則可以使用減少100倍的濃度，這可通過(guò)帶有較高分子量的定制底物來(lái)實(shí)現(xiàn)。
這也有利于增加底物的質(zhì)子親和力，以便增加電離率。帶有低質(zhì)量的β-內(nèi)酰胺類沒(méi)有高質(zhì)子親和力，因此僅有一小部分·的β-內(nèi)酰胺類在電離過(guò)程中發(fā)生電離。例如，可通過(guò)插入帶有高質(zhì)子親和力胺基酸將靈敏度進(jìn)一步增加10倍。
不僅如此，使用較高濃度的底物還往往有利于進(jìn)一步增加靈敏度。但是為了避免那些帶有較弱β_內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌被高殺菌效果立即殺死，可這樣定制底物，使其抗生素作用(MIC值)相對(duì)較小。抗生素的作用通常隨著分子尺寸的增加而降低，因?yàn)檫@些大分子滲入細(xì)胞壁孔隙而進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)的過(guò)程被大大阻礙。
此外，以這種方法定制底物還有利于完全地、方便地從上清液中提取底物。為此， 準(zhǔn)備的底物可帶有錨定基團(tuán)，這樣可使用經(jīng)固定的配體(partner)來(lái)提取底物。生物素基團(tuán)對(duì)底物的吸附是本文描述的第一個(gè)實(shí)例。然后可通過(guò)固定在壁上的鏈霉抗生物素蛋白從上清液中提取底物和分解產(chǎn)物。由于生物素和鏈霉抗生物素蛋白之間的結(jié)合可逆，因此，底物和分解產(chǎn)物可在使用已知方法進(jìn)行濃縮后被進(jìn)一步處理和測(cè)量?？稍谑忻嫔腺I到內(nèi)壁上涂有鏈霉抗生物素蛋白的合適容器，與涂覆如磁珠等微粒子一樣。
例如，較好的可提取底物實(shí)施方式是通過(guò)共價(jià)鍵的方式將6-His標(biāo)簽與β -內(nèi)酰胺結(jié)合。每個(gè)6-His標(biāo)簽由六個(gè)組氨酸組成，將分子量增加了大約800原子質(zhì)量單位，提高了質(zhì)子親和力，并且提供一種從反應(yīng)液體中提取純凈的底物及其分解產(chǎn)物的簡(jiǎn)單過(guò)程。例如，該提取可通過(guò)磁珠執(zhí)行。可在市面上買到涂有螯合物的磁珠。這些螯合物可加載鎳離子。鎳離子以可逆方式與6-His標(biāo)簽結(jié)合。這便于采用已知的方法準(zhǔn)備MALDI樣品，該樣品僅包含嵌入基質(zhì)晶體中的純凈的剩余底物及其分解產(chǎn)物，因此測(cè)量的靈敏度將很高。
β -內(nèi)酰胺酶的分裂反應(yīng)非常迅速，但前提是其不會(huì)受到底物逐漸減少的影響，則每個(gè)分子反應(yīng)時(shí)間大約是I到100毫秒。可測(cè)量不同β -內(nèi)酰胺酶的反應(yīng)速度的特征差異， 并提供關(guān)于存在的β-內(nèi)酰胺酶的強(qiáng)度信息，因此還可指示β-內(nèi)酰胺酶的類型。最有利的情形是反應(yīng)速度可在單一質(zhì)譜圖中測(cè)量。例如，如果在半小時(shí)后準(zhǔn)時(shí)停止培養(yǎng)，如果該方法已經(jīng)過(guò)相應(yīng)的校準(zhǔn)，則剩余底物和分解產(chǎn)物的比率可用于表示反應(yīng)速度。
另一個(gè)較好的實(shí)施方式是在一個(gè)多抗藥性的測(cè)定中使用若干種不同的定制底物。 例如，底物可攜帶妨礙β -內(nèi)酰胺酶攻擊的不同類型的立體位阻，如同存在于不同的抗生素中一樣。從分解方式和分解速度就可得出β-內(nèi)酰胺酶的類型和不同類型抗生素的效果。通過(guò)使用合適的底物和選擇正確的濃度，便有可能確定β -內(nèi)酰胺酶的有效程度。圖1是兩種底物(氨芐青霉素及其鈉鹽)同時(shí)分解的簡(jiǎn)單示例，盡管此例中沒(méi)有使用可抑制分解的帶有不同抗藥性的特制底物。
特別是，微生物抗藥性的測(cè)量也可用于從血液或血液培養(yǎng)液中獲得的純凈微生物，如 DE 10 2009 033 368 Al (Τ. Maier; WO 2011/006911Α3)中所述。
除了在MALDI飛行時(shí)間質(zhì)譜儀內(nèi)使用基質(zhì)輔助激光解吸(MALDI)進(jìn)行電離對(duì)底物分解進(jìn)行分析，當(dāng)然還可以使用其他類型的電離，如電噴霧電離(ESI)，及其他類型的質(zhì)譜， 如正交離子注入時(shí)間飛行質(zhì)譜(OTOF)、離子回旋共振質(zhì)譜(ICR-MS)、Kingdon靜電質(zhì)譜或， 或者尤其是低成本的離子阱質(zhì)譜。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉所有這些質(zhì)譜儀和電離方法，因此我們?cè)谶@里不再進(jìn)行闡述。
用于測(cè)量底物分解和分解產(chǎn)物增加的一個(gè)特別合適的選擇就是三重四極桿質(zhì)譜儀，該質(zhì)譜儀主要用于對(duì)底物和分解產(chǎn)物進(jìn)行比較測(cè)量。這種三重四極桿質(zhì)譜儀可達(dá)到非常高的靈敏度，所以很小量的底物就足以使用這種方法的測(cè)量。
為了簡(jiǎn)化抗藥性的確定，可采用消毒用品包(packs of consumables)(試劑盒)的形式提供所需的材料中的一些或是全部。特別是，用品包可包含精確量的定制底物，如有需要，還包含相應(yīng)的基質(zhì)。它們還可含有在質(zhì)譜測(cè)量后丟棄的一次性MALDI樣品載板。用品包可進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。
可對(duì)質(zhì)譜圖進(jìn)行直觀評(píng)估，還可以通過(guò)合適的計(jì)算機(jī)程序進(jìn)行評(píng)估。特別是，還可研發(fā)并使用可評(píng)估多抗藥性測(cè)定的程序。這些程序可根據(jù)分解方式立即確定微生物β_內(nèi)酰胺酶抗藥性的類型和強(qiáng)度，并提供建議性治療方案。
權(quán)利要求
1.基于通過(guò)微生物生成β-內(nèi)酰胺酶，確定微生物β-內(nèi)酰胺抗藥性的方法，其中通過(guò)獲得剩余底物和分解產(chǎn)物的質(zhì)譜對(duì)微生物β-內(nèi)酰胺酶對(duì)底物的酶促分解進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中底物分子包含內(nèi)酰胺環(huán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中底物為β-內(nèi)酰胺類抗生素或內(nèi)酰胺類衍生物。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中底物分子量為700到1200原子質(zhì)量單位。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中底物僅具有微弱的抗菌效果。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中底物分子具有可用于從溶液中提取底物的錨定基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中錨定基團(tuán)為生物素基團(tuán)或6-His標(biāo)簽。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中同時(shí)測(cè)量幾種類型底物的分解。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中定制不同類型的底物，從而它們的分解方式使得能夠鑒定內(nèi)酰胺酶的不同類別。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中關(guān)于β-內(nèi)酰胺環(huán)的底物模擬不同抗生素的立體形態(tài)。
11.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)量底物分解的反應(yīng)速度。
12.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中微生物已從血液或血液培養(yǎng)物中獲取。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中對(duì)剩余底物及其分解產(chǎn)物的量進(jìn)行質(zhì)譜測(cè)量，采用基質(zhì)輔助激光解析的電離。
14.基于微生物產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶來(lái)確定微生物內(nèi)酰胺抗藥性的方法，其包括以下步驟(a)將微生物添加到至少一種能被內(nèi)酰胺酶分解的底物的溶液中，(b)在特定溫度下對(duì)該溶液進(jìn)行特定時(shí)間的溫育，(C)將帶有剩余底物及其分解產(chǎn)物的溶液與微生物分離，和(d)獲得溶液的質(zhì)譜圖。
15.用于基于微生物產(chǎn)生β_內(nèi)酰胺酶而質(zhì)譜確定微生物β_內(nèi)酰胺酶抗藥性的用品包(試劑盒)，其中用品包提供可被微生物內(nèi)酰胺酶酶促分解的底物。
16.用于評(píng)估用根據(jù)權(quán)利要求1的方法獲得的質(zhì)譜圖的程序。
全文摘要
本發(fā)明涉及對(duì)微生物種產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶抗藥性的確定，特別是"超廣譜β-內(nèi)酰胺酶"(ESBL)。本發(fā)明可提供一種簡(jiǎn)單快速測(cè)量微生物抗藥性的方法，即測(cè)量微生物產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶對(duì)β-內(nèi)酰胺類抗生素的催化作用，這種催化作用是β-內(nèi)酰胺環(huán)的水解分裂。該方法可在適合的底物(β-內(nèi)酰胺類抗生素或定制β-內(nèi)酰胺類衍生物)加入微生物懸浮液幾小時(shí)后，通過(guò)直接質(zhì)譜測(cè)量β-內(nèi)酰胺酶在底物上的水解破壞來(lái)確定細(xì)菌的抗藥性。
文檔編號(hào)C12Q1/34GK103003699SQ201180028415
公開日2013年3月27日 申請(qǐng)日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月11日
發(fā)明者M·科斯特采瓦, K·米歇爾曼, K·施帕比爾 申請(qǐng)人:布魯克-道爾頓有限公司