專利名稱：編碼來源于麻風(fēng)樹屬樹的ppat的多核苷酸及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及麻風(fēng)樹屬(Jatoopha)樹的新基因、即編碼磷酸泛酰巰基乙胺腺苷轉(zhuǎn)移酶(在下文中稱為“PPAT”)的多核苷酸及其應(yīng)用，特別是用于產(chǎn)生生長增強(qiáng)的脅迫抗性的麻風(fēng)樹屬樹的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
因?yàn)槁轱L(fēng)樹(Jatropha curcas)能夠產(chǎn)生不可食用的麻風(fēng)樹屬樹油，因此,它作為用于生產(chǎn)生物柴油燃料的生物資源引起了關(guān)注。此外，已知麻風(fēng)樹屬樹是甚至可以在水和無機(jī)養(yǎng)料方面不適合其他作物生長的地區(qū)栽培的植物，并且麻風(fēng)樹屬樹被認(rèn)為對有效利用半干旱地區(qū)以及綠化非常有益。另一方面，雖然麻風(fēng)樹屬植物生長在貧瘠之地，但因?yàn)樵撝参镆荒杲Y(jié)果一次并且果實(shí)的大小顯著小于手掌的大小，所以通過天然栽培獲得的油的生產(chǎn) 效率不高。為此理由，需要開發(fā)高生產(chǎn)力的麻風(fēng)樹屬樹。作為提高麻風(fēng)樹屬樹油生產(chǎn)效率的一種措施，轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹使得乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)能夠被過表達(dá)以增加種子的含油量的方法是已知的，例如在專利文獻(xiàn)I中所提議的。另一方面，從提高麻風(fēng)樹屬樹本身的生長的觀點(diǎn)來看，還可以想到的是賦予環(huán)境脅迫抗性以確保即使在缺水等的環(huán)境中也有聞生存能力?？梢韵氲降氖黔h(huán)境脅迫抗性的基因重組植物一這是其中的脅迫應(yīng)答性信號強(qiáng)度和機(jī)制被改變以便適應(yīng)或應(yīng)答環(huán)境脅迫例如干旱脅迫的植物，以及用來實(shí)現(xiàn)過量生產(chǎn)參與抗性的蛋白質(zhì)分子(環(huán)境脅迫應(yīng)答性蛋白質(zhì))的改進(jìn)的方法等。例如，關(guān)于在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中調(diào)控干旱脅迫抗性的機(jī)制，非專利文獻(xiàn)I報(bào)告了，NF-YA5轉(zhuǎn)錄因子是ABA-依賴性的并由干旱脅迫強(qiáng)誘導(dǎo)，而且過表達(dá)NF-YA5的轉(zhuǎn)化的擬南芥在對干旱脅迫的抗性上優(yōu)于野生型擬南芥。在此，脫落酸(ABA)是一種植物激素，其參與種子休眠、氣孔的打開/關(guān)閉和滲透壓脅迫抗性，并且已知ABA深入?yún)⑴c一組脅迫應(yīng)答性基因的表達(dá)。作為環(huán)境脅迫抗性的擬南芥的制備方法，專利文獻(xiàn)2提出了一種方法，所述方法利用了在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下的一組基因的激活功能，所述轉(zhuǎn)錄因子通過與由于環(huán)境脅迫引起表達(dá)的脅迫應(yīng)答性蛋白質(zhì)的編碼基因上游存在的順式元件結(jié)合而激活轉(zhuǎn)錄(脅迫應(yīng)答性轉(zhuǎn)錄因子)。具體地，專利文獻(xiàn)2公開了 SRK2C基因是誘導(dǎo)DREB/CBF表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子的新編碼基因，其中DREB/CBF是脅迫應(yīng)答性轉(zhuǎn)錄因子，并且專利文獻(xiàn)2還公開了轉(zhuǎn)化后過表達(dá)SRK2C的擬南芥與對照相比，即使在停止供水之后仍表現(xiàn)出占優(yōu)勢的高存活率。此外，非專利文獻(xiàn)2報(bào)告了，鑒定出NF-YB因子，并且用該因子轉(zhuǎn)化后的玉米在缺水條件下顯示出比野生型更高的生產(chǎn)率。此外，關(guān)于擬南芥，非專利文獻(xiàn)3報(bào)告了，在磷酸泛酰巰基乙胺腺苷轉(zhuǎn)移酶(PPAT)編碼基因被破壞的個體(ppat-l突變株)中，營養(yǎng)生長和種子產(chǎn)率顯著降低(圖2)，而相反，在過表達(dá)PPAT的個體(0E株)中，與野生型相比，獲得了鹽抗性和滲透壓抗性(利用甘露糖醇進(jìn)行測試)增強(qiáng)的效果，并且與野生型相比，促進(jìn)了生長(參見圖3和4)。本文中使用的PPAT也被縮寫為AtCoaD，是參與輔酶A的生物合成的酶。如圖I所示，輔酶A是從泛酸生物合成的，并且PPAT催化4’ -磷酸泛酰巰基乙胺與脫磷酸輔酶A之間的交換反應(yīng)。輔酶A由泛酸、腺苷二磷酸和2-硫氧基乙胺構(gòu)成，并由化學(xué)式C21H36P3N7O16S表示。它通過將各種化合物的?；c它的末端硫醇基以硫酯鍵連接來參與多種代謝反應(yīng)。代表性地，它是參與在原核和真核細(xì)胞中有共同功能的TCA循環(huán)的輔酶。引用列表專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特表2009-536029號公報(bào)
專利文獻(xiàn)2 :日本特開2005-253395號公報(bào)非專利文獻(xiàn)非專利文獻(xiàn)I :Wen-Xue Li等，“轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)擬南芥NFYA5轉(zhuǎn)錄因子以促進(jìn)干旱抗性(The Arabidopsis NFYA5 Transcription FactorIs RegulatedTranscriptionally and Posttranscriptionally to PromoteDrought Resistance)，，, ThePlant Cell, Vol. 20:2238-2251 (2008)非專利文獻(xiàn)2 =Donald E. Nelson等，“植物核因子Y (NF-Y) B亞單位賦予干旱抗性并導(dǎo)致玉米在水受限土地上的產(chǎn)率提高(Plantnuclear factor Y(NF-Y)B subunitsconfer drought tolerance and lead toimproved corn yields on water-limited acres)”，PNAS, vol. 104，No. 42，16450-16455 (2007)非專利文獻(xiàn)3:Rubio S.等，“輔酶A生物合成酶磷酸泛酰巰基乙胺腺苷轉(zhuǎn)移酶在植物生長、鹽/滲透壓脅迫抗性和種子脂質(zhì)儲存中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用(The coenzyme Abiosynthetic enzyme phosphopantetheineadenyIyItransferase plays a crucial rolein plant growth, salt/osmotic stressresistance, and seed lipid storage)，，，PlantPhysiol.，148:546-556(2008)

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題因?yàn)橹参镏嘘P(guān)于植物生長和環(huán)境脅迫的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的機(jī)制是復(fù)雜的，因此如上所述，已經(jīng)提出了各種轉(zhuǎn)化方法，用于產(chǎn)生在生產(chǎn)率和環(huán)境脅迫抗性方面優(yōu)異的植物。然而，就麻風(fēng)樹屬樹而言，尚沒有闡明與脅迫相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白和與抗性相關(guān)的功能蛋白等，并且沒有發(fā)現(xiàn)具有優(yōu)異的生存能力的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹的有關(guān)信息。本發(fā)明要實(shí)現(xiàn)的目標(biāo)是產(chǎn)生具有優(yōu)異的生存能力的脅迫抗性的麻風(fēng)樹屬樹，并且由此提供能夠轉(zhuǎn)化野生型麻風(fēng)樹屬樹以使其具有優(yōu)異的生存能力和脅迫抗性的基因等。問題的解決方案為了實(shí)現(xiàn)前述的目標(biāo)，作為用于轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹以使其具有優(yōu)異的生存能力和脅迫抗性的基因的考查結(jié)果，本發(fā)明的發(fā)明人成功地分離和鑒定了參與輔酶A的生物合成的酶之一，即編碼麻風(fēng)樹屬樹的磷酸泛酰巰基乙胺腺苷轉(zhuǎn)移酶(PPAT)的多核苷酸，并完成了本發(fā)明。本發(fā)明具體如下所述[I]分離的多核苷酸，其選自以下多核苷酸
(a)具有由SEQ ID NO:2表不的核苷酸序列的多核苷酸；和(b)具有的核苷酸序列與(a)的多核苷酸的核苷酸序列有90%或更高同源性的多核苷酸，其中由此編碼的多肽保持由(a)的多核苷酸編碼的多肽的脅迫抗性。[2]如[I]所述的多核苷酸，其具有由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列。[3]分離的PPAT多肽，其選自以下多肽(a)具有由SEQ ID NO: I表示的氨基酸序列的多肽；和(b)具有的氨基酸序列與(a)的多肽的氨基酸序列有90%或更高同源性的多肽，其中所述多肽保持(a)的多肽的脅迫抗性。[4]如[3]所述的PPAT多肽，其具有由SEQ ID NO: I表示的氨基酸序列。[5]編碼如[3]或[4]所述的多肽的多核苷酸。[6]麻風(fēng)樹屬植物的轉(zhuǎn)化載體，其中整合了如[I]、[2]或[5]所述的多核苷酸。[7]含有如[6]所述的載體的轉(zhuǎn)化體。[8]用如[6]所述的載體轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬植物，所述植物是與野生型相比能夠過表達(dá)PPAT多肽的脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹。[9]從如[8]所述的脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹收獲的種子。[10]通過擠壓如[9]所述的種子并對其純化來生產(chǎn)麻風(fēng)樹屬樹油的方法。[11]通過如[10]所述的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的麻風(fēng)樹屬樹油。發(fā)明的有益效果當(dāng)用本發(fā)明的多核苷酸轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹時，轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹允許表達(dá)本發(fā)明的來源于麻風(fēng)樹屬樹的PPAT多肽、或其等效多肽。這些多肽促進(jìn)了輔酶A的生物合成，并且增強(qiáng)了轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹的代謝功能和生存能力，并且能夠顯著提高例如脅迫抗性。


圖I顯示了植物(擬南芥)中始于泛酸的輔酶A生物合成途徑(轉(zhuǎn)載自Kupke T等，“植物中4-磷酸泛酰巰基乙胺和輔酶A的生物合成(4-Phosphopantetheine andCoenzyme A Biosynthesis in Plants)，，J. Biol. Chem.，278:38229-38237 (2003))。圖2是顯示實(shí)施例中JcPPAT cDNA凝膠電泳結(jié)果的照片。圖3顯示了麻風(fēng)樹屬樹基因組與通過PCR方法擴(kuò)增的JcPPAT基因之間的關(guān)系。圖4是pGWB 11質(zhì)粒的基因圖譜(參見Nakagawa等，“開發(fā)Gateway 二元載體系列pGWB,用于實(shí)現(xiàn)高效構(gòu)建供植物轉(zhuǎn)化用的融合基因(Development of Series of GatewayBinary Vectors, pGWBs, forRealizing Efficient Construction of Fusion Genes forPlantTransformation)，，，Journal of Bioscience and Bioengineering，Vol. 104 (2007)，No. 1，p. 38)。
具體實(shí)施例方式[JcPPAT多肽和編碼JcPPAT多肽的JcPPAT基因]本發(fā)明的分離的新麻風(fēng)樹屬樹基因是編碼麻風(fēng)樹屬樹的磷酸泛酰巰基乙胺腺苷轉(zhuǎn)移酶(PPAT)的多核苷酸。具體而言，本發(fā)明中包括(a)具有由SEQ ID N0:2表示的核苷酸序列的多核苷酸；和(b)具有的核苷酸序列與(a)的多核苷酸的核苷酸序列有90%或更高同源性的多核苷酸，其中由此編碼的多肽保持由(a)的多核苷酸編碼的多肽的脅迫抗性(在下文中，這些統(tǒng)稱為“JcPPAT基因”等)。(b)的多核苷酸的核苷酸序列與(a)的多核苷酸的核苷酸序列具有優(yōu)選95%或更高、更優(yōu)選98%或更高、并特別優(yōu)選99%或更高的同源性。本發(fā)明的PPAT多肽例如也包括(a)具有由SEQ ID NO: I表示的氨基酸序列的多肽；和(b)具有的氨基酸序列與(a)的多肽的氨基酸序列有90%或更高同源性的多肽，其中所述多肽保持(a)的多肽的脅迫抗性(在下文中，這些統(tǒng)稱為“JcPPAT”)。(b)的多肽與(a)的多肽的氨基酸序列具有優(yōu)選95%或更高、更優(yōu)選98%或更高、并特別優(yōu)選99%或更高的同源性。本發(fā)明的基因的核苷酸序列還包括編碼(a)和(b)的多肽的多核苷酸。作為本發(fā)明的JcPPAT基因，優(yōu)選列舉的是編碼由SEQ ID NO: I表示的氨基酸序列的基因，具有由SEQ ID NO:2表示的核苷酸序列的多核苷酸被優(yōu)選用于產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹，因?yàn)樗鼇碓从诼轱L(fēng)樹屬樹基因組。
雖然制備本發(fā)明的JcPPAT基因的方法沒有特別的限制，但是，例如，通過使用下列引物組(SEQ ID NO:3和4)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，與來源于麻風(fēng)樹屬樹的PPAT基因相對應(yīng)的SEQ ID NO: 2的DNA可以作為靶多核苷酸的PCR產(chǎn)物(編碼PPAT的cDNA)從麻風(fēng)樹屬樹mRNA中獲得。此外，可以根據(jù)常規(guī)方法來獲得JcPPAT基因，并且可以人工合成JcPPAT基因，例如，通過在SEQ ID NO:2等的DNA中取代、刪除或添加預(yù)定的堿基。[化學(xué)式I]正向引物5’ -AAAAAGCAGGCTCAAAAATGGCGTTATTAGACGAATCTATGGTTAAT-3，反向引物5’ -AGAAAGCTGGGTATGCTACTTCTTGTTTTTTCACCTTCTCGG-3 ’可以通過通常采用的方法來制備mRNA。例如，在研缽等中磨碎冷凍的植物之后，通過乙二醛法、硫氰酸胍-氯化銫法、氯化鋰-尿素法、蛋白酶K-脫氧核糖核酸酶法等可以從得到的磨碎物質(zhì)中提取和制備粗RNA組分。還可以使用可商購的試劑盒。用作材料的植物組織沒有特別的限制，并且可以使用在成熟過程中的種子或發(fā)芽種子、成熟葉子、及其他組織例如莖。在這些組織當(dāng)中，從發(fā)芽種子中能夠得到較大量的PPAT mRNA，在所述發(fā)芽種子中，通過種子儲存的脂質(zhì)代謝產(chǎn)生能量是活躍的。據(jù)推測，因?yàn)榉N子發(fā)芽時需要大量的能量，所以為了代謝儲存在種子中的脂質(zhì)，PPAT活性增強(qiáng)。還推測，因?yàn)闉榱诵罘e脂質(zhì)，PPAT活性增強(qiáng)，所以在成熟過程中的種子中能夠有效獲得PPAT mRNA。然而，當(dāng)組織如種子等中含有大量油時，優(yōu)選在純化磨碎的物質(zhì)之后再提取RNA?？梢酝ㄟ^常規(guī)已知的方法例如Maxim-Gilbert化學(xué)修飾法或使用M13噬菌體的雙脫氧核苷酸鏈終止法來對所獲得的PCR產(chǎn)物的核苷酸序列進(jìn)行測定和確認(rèn)。[產(chǎn)生脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹]通過將表達(dá)盒基因?qū)氲揭吧吐轱L(fēng)樹屬樹中，產(chǎn)生了本發(fā)明的脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹，所述表達(dá)盒具有與用于表達(dá)或表達(dá)調(diào)控的啟動子可操作連接的如上所述制備的JcPPAT基因。本發(fā)明所意指的麻風(fēng)樹屬物種沒有特別的限制，可以使用麻風(fēng)樹(Jatrophacurcas)、佛肚樹(Jatropha potagurica)、紅珊瑚(Jatrophamultif ida)、錦珊瑚(Jatrophaberlandieri)、琴葉珊瑚(Jatrophaintegerrima)等。這些物種當(dāng)中，從含油量大的觀點(diǎn)而言，優(yōu)選使用麻風(fēng)樹(Jatropha curcas )。
可以通過任何方法實(shí)現(xiàn)基因?qū)耄龇椒ò▽NA直接導(dǎo)入細(xì)胞的方法，例如原生質(zhì)體融合法、電穿孔法和基因鳥槍法；和利用根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或R. rhizogenes間接導(dǎo)入DNA的方法,并且利用土壤桿菌的方法是優(yōu)選的。在下面，描述了利用土壤桿菌的轉(zhuǎn)化方法。土壤桿菌是植物病原體并具有Ti質(zhì)粒，Ti質(zhì)粒在LB (左側(cè)邊界)和RB (右側(cè)邊界)之間夾有一個區(qū)(T-DNA (轉(zhuǎn)移DNA)區(qū))，該區(qū)能夠被切掉并插入到宿主基因組中。當(dāng)宿主植物感染了具有質(zhì)粒的土壤桿菌并且所述質(zhì)粒在這個T-DNA區(qū)中整合了待導(dǎo)入的基因、即JcPPAT cDNA時，所述T-DNA區(qū)被切掉并與vir區(qū)編碼的一組蛋白質(zhì)形成復(fù)合體并進(jìn)入植物細(xì)胞，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)插入到宿主基因組中。作為利用土壤桿菌的轉(zhuǎn)化方法，二元載體法是優(yōu)選的。二元載體法是通過將靶外源基因整合到具有T-DNA區(qū)邊界(LB和RB)的質(zhì)粒的T-DNA區(qū)中，將這樣的質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒的T-DNA缺陷質(zhì)粒(例如PAL4404)分別導(dǎo)入到土壤桿菌中，并用所述土壤桿菌感染植物，來將靶基因插入到植物基因組中的方法。 利用二元載體法產(chǎn)生轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹時使用的表達(dá)盒在T-DNA區(qū)中包含本發(fā)明的JcPPAT基因、用于表達(dá)所述核苷酸的啟動子、標(biāo)記基因和報(bào)告基因。作為啟動子，可以列舉出35S花椰菜花葉病毒啟動子、胭脂堿合酶(NOS)啟動子、及其他胚乳特異性啟動子例如β菜豆素(Pphaseolin)、蕓苔素(napin)和泛素。作為選擇標(biāo)記基因，使用賦予選擇劑例如抗生素或除草劑抗性的基因。其具體實(shí)例包括卡那霉素抗性基因、巴龍霉素B抗性基因、或針對除草劑例如草銨膦和草甘磷的抗性基因。還可用的是所表達(dá)的選擇標(biāo)記使得能夠目測識別轉(zhuǎn)化體的基因，所述選擇標(biāo)記例如為顯色蛋白或熒光蛋白如熒光素酶或綠色熒光蛋白(GFP);或表達(dá)各種顯色底物已知的β葡萄糖醛酸酶或GUS的基因。這樣的選擇標(biāo)記還可以被用作報(bào)告基因。如有必要，可以進(jìn)一步包含增強(qiáng)子、終止子、標(biāo)簽等。增強(qiáng)子用于提高靶基因的表達(dá)效率，例如，可以列舉出包含CaMV 35S啟動子中的上游序列的增強(qiáng)子區(qū)。終止子可以是能夠終止由啟動子轉(zhuǎn)錄的基因轉(zhuǎn)錄的任何序列，例如，可以列舉出胭脂堿合酶(NOS)基因的終止子、和章魚堿合酶(OCS)以及CaMV 35S RNA基因的終止子。作為通過二元載體法轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹中使用的二元載體，可以使用在T-DNA區(qū)中包含前述表達(dá)盒的那些二元載體，具體地是那些通過將前述的表達(dá)盒整合到可商購載體例如ρΒΙ系列、ρΡΖΡ系列、pSMA系列和pGWB系列中而制備的二元載體。特別是，優(yōu)選適用于Gateway (注冊商標(biāo))克隆系統(tǒng)的植物轉(zhuǎn)化用二元載體,可以列舉出的這樣的載體是pGWB系列載體。在這些PGWB系列載體中，利用花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子作為啟動子；潮霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因作為選擇標(biāo)記基因；β -葡萄糖醛酸酶(GUS)、綠色熒光蛋白(GFP)、熒光素酶(LUC)、黃色熒光蛋白(YFP)或青色熒光蛋白(CFP)作為報(bào)告子；以及6xHis、FLAG、3xHA、4xMyc、GST或T7-表位作為標(biāo)簽，將靶基因與報(bào)告基因可操作地連接起來。此外，在N末端和C末端上都有編碼報(bào)告子和允許融合的標(biāo)簽的序列。Gateway (注冊商標(biāo))克隆系統(tǒng)通過利用Gateway (注冊商標(biāo))信號(att)促進(jìn)了表達(dá)載體的構(gòu)建。在這種方法中，通過具有attPl和attP2序列的供體載體與各端添加了attBl和attB2序列的靶基因之間的反應(yīng)(BP反應(yīng))，產(chǎn)生了在其中整合了靶基因的入門載體(各端具有attLl和attL2序列)，然后通過這種入門載體與在其中整合了表達(dá)時需要的啟動子的目的載體(添加了 attRl和attR2序列)之間的重組反應(yīng)(LR反應(yīng))，產(chǎn)生了在其中插入了靶基因的載體(表達(dá)載體)。因此，首先讓克隆的JcPPAT cDNA與供體載體進(jìn)行BP反應(yīng)，以制備具有被整合在所述供體載體中的克隆的JcPPAT cDNA的入門載體，然后通過入門載體與目的載體(pGWB)之間的LR反應(yīng)，可以產(chǎn)生在其中整合了靶DNA (JcPPAT基因)的表達(dá)載體。利用Gateway (注冊商標(biāo))二元載體(pGWB)構(gòu)建植物轉(zhuǎn)化用表達(dá)盒的詳細(xì)說明參見Nakagawa等，“開發(fā)Gateway 二元載體系列pGWB,用于實(shí)現(xiàn)高效構(gòu)建供植物轉(zhuǎn)化用的融合基因(Development ofSeries of Gateway Binary Vectors, pGWBs, for RealizingEfficientConstruction of Fusion Genes for Plant Transformation)，，，JournalofBioscience and Bioengineering, Vol. 104, No. I, 34-41(2007)。如上所述產(chǎn)生的表達(dá)載體(植物轉(zhuǎn)化載體)可以在大腸桿菌(Escherichia coli)中進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增的轉(zhuǎn)化載體可以通過電穿孔法等導(dǎo)入到土壤桿菌中。以這種方式導(dǎo)入了表達(dá)載體的土壤桿菌被用于轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹。通過具有植物轉(zhuǎn)化載體的土壤桿菌的感染而將JcPPAT基因?qū)氲铰轱L(fēng)樹屬樹中，這可以通過利用已知的方法例如葉盤法來實(shí)現(xiàn)。具體地說，制備在MS培養(yǎng)基中懸浮了土壤桿菌的感染用菌液，并將所述菌液與作為宿主的麻風(fēng)樹屬樹的一部分(優(yōu)選為子葉的切塊，在下文中稱為“麻風(fēng)樹屬樹葉塊”)共培養(yǎng)約3天。在共培養(yǎng)之前，將麻風(fēng)樹屬樹的葉塊在MS培養(yǎng)基中浸泡約2天，并優(yōu)選進(jìn)行超聲處理。以這種方式可以提高導(dǎo)入效率。還優(yōu)選向其中已經(jīng)加入了砂子的土壤桿菌懸液施加振動的Sandvortex法，因?yàn)樵摲椒ㄌ岣吡送寥罈U菌的可感染性。作為共培養(yǎng)培養(yǎng)基，使用摻入了植物激素例如3-吲哚丁酸(IBA)或6-芐氨基嘌呤(BA)的MS培養(yǎng)基等。在共培養(yǎng)之后，洗滌麻風(fēng)樹屬樹葉塊，并將其轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基(含有與轉(zhuǎn)化載體的表達(dá)盒中使用的選擇標(biāo)記基因相對應(yīng)的抗生素)中并孵育，然后切下葉塊中形成的愈傷組織，并將其轉(zhuǎn)移到選擇培養(yǎng)基中，進(jìn)行進(jìn)一步篩選轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹(重組細(xì)胞)。作為選擇培養(yǎng)基，優(yōu)選使用的是通過向含有作為植物激素的IBA或BA等的預(yù)培養(yǎng)用培養(yǎng)基(MS培養(yǎng)基等)中添加選擇用物質(zhì)、即抗生素(卡那霉素，潮霉素)而制備的選擇培養(yǎng)基。接下來，將選定的愈傷組織轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)基例如誘導(dǎo)生根(RI)培養(yǎng)基或MS培養(yǎng)基中，并讓其生根并再分化成植物苗。通過適當(dāng)設(shè)定培養(yǎng)基中包括植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)例如植物生長素和細(xì)胞分裂素以及碳源在內(nèi)的各種成分的種類和數(shù)量以及光和溫度等，可以實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)再分化。[轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹]因?yàn)楸景l(fā)明的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹與野生型相比具有更大量的編碼PPAT的JcPPAT基因，所述PPAT是參與輔酶A的合成反應(yīng)的酶之一，而輔酶A參與細(xì)胞中的各種代謝反應(yīng)，所以據(jù)推測，與野生型相比，在轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹中，PPAT可能被過表達(dá)，并且輔酶A的合成被促進(jìn)。正如前面提到的非專利文獻(xiàn)3所公開的，據(jù)報(bào)告，在擬南芥中，過表達(dá)PPAT的個體(OE)與野生型相比顯示出輔酶A濃度增加，并且獲得了鹽抗性和滲透壓抗性(利用甘露糖醇進(jìn)行測試)增強(qiáng)的效果，并提高了植物生長(圖2至4)。類似地，在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹中，通過PPAT的過表達(dá)，增加了輔酶A的濃度，因此可以預(yù)期的是增強(qiáng)和促進(jìn)鹽、滲透壓和干旱脅迫抗性和生長的效果。進(jìn)而，可以預(yù)期到種子產(chǎn)率的增加。此外，在非專利文獻(xiàn)3中報(bào)告了，在過表達(dá)PPAT的植株中，種子的含油量增加了30%到50%，并且還觀察到脂肪酸組成的變化。因此在本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹中，還可預(yù)期到種子的含油量增加，并且得到脂肪酸組成不同于野生型的果實(shí)。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物不僅包括受到了轉(zhuǎn)化處理的“Tl代”，而且包括后代植物，包括從這種植物的種子得到的子代“T2代”，和通過由藥物選擇或由Southern法的分析等被證明是轉(zhuǎn)化體的“T2代”植物自花授粉獲得的下一代(T3代)。[麻風(fēng)樹屬樹油的生產(chǎn)]可以按照常規(guī)方法從本發(fā)明的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹收獲的種子中生產(chǎn)麻風(fēng)樹屬樹油。例如，通過擠壓種子獲得原料油并將原料油通過過濾器過濾，可以生產(chǎn)能夠用作生物柴油的麻風(fēng)樹屬樹油。當(dāng)計(jì)劃將麻風(fēng)樹屬樹油進(jìn)一步純化時，例如，可通過蒸餾進(jìn)行純化，并 且可通過日本特開2010-209177號公報(bào)記載的方法去除佛波酯。實(shí)施例通過實(shí)施例來描述用于執(zhí)行本發(fā)明的實(shí)施方式。以下實(shí)施例不限制本發(fā)明的范圍。[分離和鑒定麻風(fēng)樹屬樹中的PPAT編碼DNA](I)麻風(fēng)樹屬樹中的PPAT編碼DNA根據(jù)Kazusa DNA研究所和大阪大學(xué)在住友電氣工業(yè)株式會社資助下進(jìn)行的麻風(fēng)樹屬樹基因組計(jì)劃中繪制的麻風(fēng)樹屬樹基因組信息(鄰接圖譜)，通過TBLASTN檢索搜索了與擬南芥PPAT (At2gl8250)顯示出同源性的基因。至于擬南芥的PPAT基因信息，參考在擬南芥信息資源(TAIR)中的基因登錄信息(http://arabidopsis. org/servlets/TairObject type=locus&name=AT2G18250)。結(jié)果,據(jù)推測,在麻風(fēng)樹屬樹的基因組DNA序列上存在編碼PPAT的基因序列的一個克隆(Contig 948. 1，Contig 6725. I)。(2)制備麻風(fēng)樹屬樹的總RNA使用從日光種苗株式會社購買的泰國種系麻風(fēng)樹屬樹(麻風(fēng)樹)的發(fā)芽4天的種子。用70%乙醇和次氯酸鈉將去殼麻風(fēng)樹屬樹種子的表面滅菌之后，所述種子被放在1/2MS培養(yǎng)基上，并以16小時/8小時的明/暗周期在30°C培養(yǎng)4天，使之發(fā)芽。利用Concert 植物RNA試劑(Invitrogen)從一粒發(fā)芽種子(約Ig)制備含有總RNA的樣品。由于制備的樣品含有大量的油脂含量，因此，通過RNeasy微型柱(QIAGEN)去除這些物質(zhì)來純化RNA樣品，并獲得總RNA。同樣利用Concert 植物RNA試劑(Invitrogen)從由前面提到的麻風(fēng)樹屬樹種子長成的成熟葉子(Ig)制備含有總RNA的樣品。(3)克隆和擴(kuò)增麻風(fēng)樹屬樹PPAT cDNA使用在⑵中分別從發(fā)芽種子和成熟葉子制備的總RNA作為模板，利用逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)(Promega),通過AMV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行cDNA的合成。使用所述系統(tǒng)附帶的Oligo (dT) 15作為引物。為了擴(kuò)增據(jù)推測存在于基因組DNA序列上的編碼PPAT的候選基因，利用上面制備的麻風(fēng)樹屬樹cDNA作為模板和下列引物組(SEQ IDNO:3和4)進(jìn)行PCR反應(yīng)，以擴(kuò)增靶JcPPAT cDNA。[化學(xué)式2]正向引物5，-AAAAAGCAGGCTCAAAAATGGCGTTATTAGACGAATCTATGGTTAAT-3，反向引物5’ -AGAAAGCTGGGTATGCTACTTCTTGTTTTTTCACCTTCTCGG-3 ’具體地說，向下面顯示的PCR反應(yīng)液中加入I μ L在(I)中制備的麻風(fēng)樹屬樹cDNA溶液，使總量為20 μ L，并在下列條件下進(jìn)行PCR反應(yīng)。將反應(yīng)液在94° C保持2分鐘之后，將[94° C，15秒一55° C，30秒一68° C，3分鐘]的循環(huán)重復(fù)40次，然后將反應(yīng)冷卻到4° C。用于PCR的反應(yīng)液如下。
權(quán)利要求
1.分離的多核苷酸，其選自以下多核苷酸 (a)具有由SEQID NO:2表示的核苷酸序列的多核苷酸；和 (b)具有與(a)的多核苷酸的核苷酸序列有90%或更高同源性的核苷酸序列的多核苷酸，其中由此編碼的多肽保持由(a)的多核苷酸編碼的多肽的脅迫抗性。
2.權(quán)利要求I的多核苷酸，其具有由SEQID NO:2表示的核苷酸序列。
3.分離的PPAT多肽，其選自以下多肽 (a)具有由SEQID NO: I表示的氨基酸序列的多肽；和 (b)具有與(a)的多肽的氨基酸序列有90%或更高同源性的氨基酸序列的多肽，其中所述多肽保持(a)的多肽的脅迫抗性。
4.權(quán)利要求3的PPAT多肽，其具有由SEQID NO: I表示的氨基酸序列。
5.編碼權(quán)利要求3或4的多肽的多核苷酸。
6.麻風(fēng)樹屬植物的轉(zhuǎn)化載體，其中整合了權(quán)利要求1、2或5的多核苷酸。
7.含有權(quán)利要求6的載體的轉(zhuǎn)化體。
8.用權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬植物，所述植物是與野生型相比能夠過表達(dá)PPAT多肽的脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹。
9.從權(quán)利要求8的脅迫抗性的轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹收獲的種子。
10.通過擠壓權(quán)利要求9的種子并對其純化來生產(chǎn)麻風(fēng)樹屬樹油的方法。
11.通過權(quán)利要求10的生產(chǎn)方法生產(chǎn)的麻風(fēng)樹屬樹油。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了來源于麻風(fēng)樹屬樹的SEQ ID NO:1的PPAT多肽和SEQ ID NO:2的PPAT多核苷酸等。通過用這種PPAT多核苷酸轉(zhuǎn)化麻風(fēng)樹屬樹，與野生型相比，可以過表達(dá)PPAT多肽，并且這種多肽能夠促進(jìn)輔酶A的生物合成、增強(qiáng)該轉(zhuǎn)化的麻風(fēng)樹屬樹的代謝功能和生存能力、并顯著提高例如脅迫抗性。
文檔編號C12N15/09GK102933709SQ20118002839
公開日2013年2月13日 申請日期2011年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月8日
發(fā)明者福井希一, 喬伊斯·卡塔格納, 和田直樹, 小日向務(wù), 湯鹽泰久, 池口直樹, 田畑哲之 申請人:住友電氣工業(yè)株式會社, 國立大學(xué)法人大阪大學(xué)