專利名稱：靶核酸的自折疊擴(kuò)增的制作方法
靶核酸的自折疊擴(kuò)增
1.發(fā)明領(lǐng)域本申請(qǐng)涉及一種用于選擇性擴(kuò)增ー個(gè)或多個(gè)靶多核苷酸序列(通常在較長的多核苷酸模板內(nèi))的試劑盒和方法以及由該方法所獲得的擴(kuò)增反應(yīng)混合物。具體地講，所述試劑盒包含用于引發(fā)引物延伸(超過靶序列的長度)以形成單鏈DNA產(chǎn)物的復(fù)合引物(composite primer),和任選地,用于確定產(chǎn)生引物延伸的單鏈DNA產(chǎn)物的3’末端(defined 3’ end)序列區(qū)域的工具(means)。所述復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分和與革巴序列3’末端部分互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分。所述用于確定產(chǎn)生單鏈DNA產(chǎn)物的3’末端序列區(qū)域的工具可以是通過限制酶(或其它酶)切割或阻斷緊鄰靶序列的5’末端上游多核苷酸模片K區(qū)域(immediately upstream of the 5’ end of the target sequence),或者是阻斷緊鄰靶序列的5’末端上游進(jìn)行雜交的核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸(blockingoligonucleotide)或模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(template switching oligonucleotide, TSO))。 單鏈DNA產(chǎn)物的3’末端部分與同一單鏈DNA產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列通過自折疊(self-folding)雜交，形成柄- -環(huán)結(jié)構(gòu)(handle-stem-loop structure),該結(jié)構(gòu)包含(i) 一包含啟動(dòng)子部分的5’單鏈柄；(ii) 一包含彼此雜交形成互補(bǔ)的單鏈DNA產(chǎn)物的3’末端部分的雙鏈莖；和任選地，(iii) 一介于該雜交序列之間的序列的單鏈環(huán)。柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以5’單鏈柄為模板被進(jìn)ー步延伸以形成雙鏈啟動(dòng)子，該雙鏈啟動(dòng)子進(jìn)而引發(fā)靶序列的轉(zhuǎn)錄。所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含擴(kuò)增的核糖核苷酸靶序列、復(fù)合弓I物和自折疊單鏈DNA產(chǎn)物。2.
背景技術(shù)：
核酸擴(kuò)增技術(shù)可通過少量核苷酸進(jìn)行多拷貝擴(kuò)増。擴(kuò)增技術(shù)已廣泛應(yīng)用于，包括例如診斷、藥物開發(fā)、法醫(yī)調(diào)查、環(huán)境分析和食品檢驗(yàn)中。有許多熟知的用于體外擴(kuò)增核酸序列的方法，包括例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、復(fù)制酶介導(dǎo)的擴(kuò)增、鏈-置換擴(kuò)增(SDA)、“滾環(huán)(rolling circle) ”型擴(kuò)增和各種基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)方法。這些方法使用不同的技術(shù)產(chǎn)生擴(kuò)增的序列，這些擴(kuò)增的序列可通過多種方法來檢測(cè)。PCR擴(kuò)增使用DNA聚合酶、寡核苷酸引物和熱循環(huán)來合成雙鏈DNA(dsDNA)或由cDNA形成的dsDNA的多拷貝(參見例如Mullis等人的美國專利第4，683，195,4, 683，202和4，800，159號(hào))。LCR擴(kuò)增使用過量的與鄰接(contiguous)祀序列雜交并連接形成與原始祀互補(bǔ)的融合探針的單鏈探針的兩個(gè)互補(bǔ)對(duì)，其在雜交、連接和變性的多個(gè)循環(huán)中融合探針可作為模板進(jìn)行進(jìn)一歩融合(參見例如Backman等人的美國專利第5，516，663號(hào)和EP 0320308B1)。復(fù)制酶介導(dǎo)的擴(kuò)增使用與被分析序列相連的自復(fù)制RNA序列和復(fù)制酶(例如Q β -復(fù)制酶)，來合成對(duì)所選復(fù)制酶有特異性的自復(fù)制序列(例如QP病毒序列)的多拷貝(參見例如Kramer等人的美國專利第4，786，600號(hào))。擴(kuò)增的序列可作為被分析序列的替代或報(bào)道分子被檢測(cè)出。SDA擴(kuò)增使用含有限制性內(nèi)切核酸酶的識(shí)別位點(diǎn)的引物，使得該內(nèi)切核酸酶在包括靶序列的化學(xué)修飾dsDNA鏈上打開缺ロ，然后進(jìn)行一系列引物延伸和鏈置換步驟(參見例如Walker等人的美國專利第5，422，252A號(hào)和Nadeau等人的美國專利第5，547，861號(hào))?！皾L環(huán)”型擴(kuò)增通過環(huán)狀或連環(huán)的(concatenated)核酸結(jié)構(gòu)為模板，復(fù)制形成多個(gè)單鏈拷貝(參見例如Kool的美國專利第5，714，320號(hào)和Ste_er等人的美國專利第5，834，252號(hào))。TMA擴(kuò)增是指通過從核酸模板產(chǎn)生多個(gè)轉(zhuǎn)錄物來擴(kuò)增序列的方法。這樣的方法一般使用ー種或多種寡核苷酸(其中ー種提供啟動(dòng)子序列)和具有RNA聚合酶和DNA聚合酶活性的酶以靶序列附近形成功能性啟動(dòng)子序列，然后從啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄靶序列(參見例如Kacian等人的美國專利第5，399，491和5，554，516號(hào)、Burg等人的美國專利第5，437，990號(hào)、Gingeras等人的WO88/010315,Malek等人的美國專利第5，130, 238號(hào)、Urdea等人的美國專利第4，868，105和5，124，246號(hào)和Becker等人的US 2006-0046265A1)。核酸擴(kuò)增方法可擴(kuò)增特定的靶序列(例如基因序列)、一組可作為標(biāo)簽或報(bào)道序列相關(guān)的靶序列或替代(surrogate)序列，，替代被分析序列進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。如果在反應(yīng)期間的某個(gè)點(diǎn)上存在有被分析靶序列，那么替代序列是唯一被擴(kuò)增的。以上所述的技術(shù)經(jīng)常需要使用兩種或更多種引物進(jìn)行靶擴(kuò)增。需要對(duì)每個(gè)靶的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化。這是既昂貴又耗時(shí)的，常常富有挑戰(zhàn)性和困難的過程，尤其是在為了擴(kuò)增兩種或更多種不同的靶序列的多重測(cè)定中，其中引物對(duì)的交叉反應(yīng)對(duì)于測(cè)定的可靠性來說可能是ー個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。設(shè)計(jì)和優(yōu)化兩種引物用于小靶標(biāo)(例如微小RNA，僅含有18-25個(gè)核苷酸)的擴(kuò)增也是極其困難的(如果不是不可能的話)。本發(fā)明描述了使用一種復(fù)合引物的擴(kuò)增方法，從而克服了上述困難。·3.發(fā)明概述本發(fā)明的第一個(gè)方面涉及選擇性擴(kuò)增和任選檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)靶多核苷酸序列(可與“靶序列”互換使用)的方法。在有些實(shí)施方案中，靶序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)。具體地講，該方法可用于轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)系統(tǒng)中ー個(gè)或多個(gè)靶序列的選擇性擴(kuò)增和任選檢測(cè)。更具體地講，該方法使用復(fù)合引物來引發(fā)引物延伸(超過靶序列的長度)以產(chǎn)生單鏈DNA產(chǎn)物，并且在靶序列存在于較長的多核苷酸模板內(nèi)的情況下，該方法可在引物延伸的單鏈DNA產(chǎn)物中產(chǎn)生確定的3’末端的工具。所述復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分和與靶序列3’末端部分互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分。在引物延伸的單鏈DNA產(chǎn)物中產(chǎn)生確定的3’末端的工具通過確定靶序列的5’末端來工作在一個(gè)實(shí)施方案中，使用酶(例如限制酶)對(duì)緊接靶序列的5’末端上游進(jìn)行切割或產(chǎn)生切ロ ；在另ー個(gè)實(shí)施方案中，使用核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸或模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO))對(duì)緊接靶序列的5’末端上游進(jìn)行雜交。單鏈DNA產(chǎn)物的3’末端部分與同一單鏈DNA產(chǎn)物中的互補(bǔ)序列通過自折疊雜交，形成柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含(i) 一包含啟動(dòng)子部分的5’單鏈柄，；(ii) 一包含彼此互補(bǔ)雜交的單鏈DNA產(chǎn)物的3’末端部分的雙鏈莖，；和任選地，(iii) 一包含介于雜交序列之間的序列的單鏈環(huán)，。柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以5’單鏈柄為模板被進(jìn)ー步延伸以形成雙鏈啟動(dòng)子，該雙鏈啟動(dòng)子進(jìn)而弓I發(fā)靶序列的轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方案中，靶序列的5’末端對(duì)應(yīng)于沒有與啟動(dòng)子部分或靶-識(shí)別部分重疊的復(fù)合引物部分。在某些其它的實(shí)施方案中，靶序列的5’末端與復(fù)合引物部分(例如靶-識(shí)別部分)互補(bǔ)并且不與啟動(dòng)子部分重疊。在某些其它的實(shí)施方案中，靶序列的5’末端與靶序列部分互補(bǔ)，該靶序列部分不與復(fù)合引物的靶-識(shí)別部分互補(bǔ)。在靶序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)的那些實(shí)施方案的有ー些中，例如，通過使用與預(yù)計(jì)緊接靶序列5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交的模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)，在引物延伸期間引入靶序列的5’末端。典型地，本發(fā)明的方法涉及至少ー個(gè)靶多核苷酸序列(T)的選擇性擴(kuò)增，所述方法包括以下步驟(a)靶多核苷酸序列與第一復(fù)合引物雜交，所述第一復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分(P)和與靶多核苷酸序列3’末端部分互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分；(b)確定靶多核苷酸序列的5’末端部分；(c)延伸第一復(fù)合引物的3’末端并產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第一單鏈DNA模板，所述第一單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)的第一對(duì)自折疊區(qū)段(self-folding segment),其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第一單鏈DNA模板的5’末端，而所述自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第一單鏈DNA模板的3’末端；(d)第一單鏈DNA模板自折疊并形成第一柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄和含彼此雜交的第一對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖；(e)延伸第一柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和(f)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)，其包含靶多核苷酸序列⑴。在有些實(shí)施方案中，該對(duì)自折疊區(qū)段是彼此分隔開的。在有些實(shí)施方案中，該對(duì)自折疊區(qū)段是彼此相鄰或靠近的。在有些實(shí)施方案中，所述柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)還包含單鏈環(huán)，該單鏈環(huán)包含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列。在介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列中的堿基數(shù)目可以為介于O和1000之間、優(yōu)選介于O和200之間和更優(yōu)選介于5和100之間的任何地方(anywhere)。在有些實(shí)施方案中，所述單鏈RNA產(chǎn)物在其3’末端包含啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)。在某些方法中，所述靶多核苷酸序列是RNA，和步驟(C)包括延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第一 RNA/DNA雜交體并去除第一 RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生第一單鏈DNA模板。在某些方法中，所述靶多核苷酸序列是DNA，和所述方法包括在步驟(a)之前的一個(gè)變性步驟，和步驟(c)包括延伸復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第一 DNA/DNA雜交體和使第一DNA/DNA雜交體變性以產(chǎn)生第一單鏈DNA模板。在某些實(shí)施方案中，所述靶多核苷酸序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和步驟(b)包括通過酶切緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域來確定靶多核苷酸序列的5’末端。在某些實(shí)施方案中，所述靶多核苷酸序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和步驟(b)包括通過核苷酸序列例如阻遏寡核苷酸或模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端。在ー個(gè)具體 的實(shí)施方案中，步驟(b)包括通過阻遏寡核苷酸與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端，其中在步驟(c)中，所述阻遏寡核苷酸阻斷復(fù)合引物的延伸。在另ー個(gè)具體實(shí)施方案中，步驟(b)包括通過TSO與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端，和其中步驟(C)包括延伸復(fù)合引物的3’末端至所述TSO部分。優(yōu)選地，所述阻遏寡核苷酸或TSO是長度為6-100個(gè)堿基。用于該方法的阻遏寡核苷酸和TSO可以是本領(lǐng)域眾所周知的那些。例如，為了增強(qiáng)雜交親和カ，所述阻遏寡核苷酸或TSO可包含修飾堿基，例如鎖(locked)核酸(LNA)、2’ -O-甲基(2’ -OMe)堿基等。在涉及使用阻遏寡核苷酸的那些實(shí)施方案的有ー些中，第一復(fù)合引物還包含，在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分之間，對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列形成所述第一對(duì)自折疊區(qū)段，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟(g)單鏈RNA產(chǎn)物與第一復(fù)合引物(_)雜交并延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體；(h)去除第二 RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生第一單鏈DNA模板；和 繼續(xù)步驟(d)、(e)和(f)ο在涉及使用阻遏寡核苷酸的那些實(shí)施方案的有ー些中，第一復(fù)合引物的3’靶-識(shí)別部分包含對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列形成所述第一對(duì)自折疊區(qū)段，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟(g)單鏈RNA產(chǎn)物與第一復(fù)合引物雜交并延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二RNA/DNA雜交體；(h)去除第二 RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板，所述第二單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)的第ニ對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端；(i)第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄和含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖；(j)延伸第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和(k)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物。在涉及使用阻遏寡核苷酸的那些實(shí)施方案的有ー些中，第一對(duì)自折疊區(qū)段包含對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段及其位于靶多核苷酸序列獨(dú)立部分的互補(bǔ)序列，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟(g)單鏈RNA產(chǎn)物與第一復(fù)合弓I物雜交并延伸第一復(fù)合弓I物的3’末端以產(chǎn)生第二RNA/DNA雜交體；(h)去除第二 RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板，所述第二單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)的第ニ對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端；(i)第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄和含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖；(j)延伸第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和
(k)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物。在涉及使用TSO的那些實(shí)施方案的有ー些中，第一復(fù)合引物還包含，從5’到3’端，并在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分之間，在靶多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中不存在的通用部分(U)，和模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)包含，從5’到3’端，通用部分(U)和與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域互補(bǔ)的部分，其中所述第一對(duì)自折疊區(qū)段包含通用部分(U)及其互補(bǔ)序列，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟(g)單鏈RNA產(chǎn)物與第一復(fù)合引物或第二復(fù)合引物雜交并延伸第二復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體，其中所述第二復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分(P)和通用部分⑶；(h)去除第二 RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生第一單鏈DNA模板；和
繼續(xù)步驟(d)、(e)和(f)?；蛘?，在步驟(g)中可以使用包含5’啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)的第二復(fù)合引物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二復(fù)合引物從5’到3’端由啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)組成，或者更優(yōu)選基本上由啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)組成。上述方法中的任何ー個(gè)，或者単獨(dú)或者以不同組合，可用于選擇性擴(kuò)增多個(gè)靶多核苷酸序列，和優(yōu)選同時(shí)選擇性擴(kuò)增多個(gè)靶多核苷酸序列。例如，該方法可通過不同第一復(fù)合引物選擇性擴(kuò)增各靶多核苷酸序列，其中每個(gè)第一復(fù)合引物處于5’到3’且在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分之間還包含在靶多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中不存在的通用部分(U)，和對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列形成所述第一對(duì)自折疊區(qū)段，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟(g)單鏈RNA產(chǎn)物與第一復(fù)合引物或第二復(fù)合引物雜交并延伸第二復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體，其中所述第二復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分(P)和通用部分⑶；(h)去除第二 RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)、通用部分(U)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板，所述第二單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)和分隔開的第二對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端；(i)第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖和含介于第二對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)；(j)延伸第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和(k)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物?；蛘?，在步驟(g)中可以使用包含5’啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)的第二復(fù)合引物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，第二復(fù)合引物從5’到3’端由啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)組成，或者更優(yōu)選基本上由啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)組成。任選地，以上描述的方法還可以包括檢測(cè)步驟，該檢測(cè)步驟包括用于檢測(cè)單鏈RNA產(chǎn)物的工具。在ー個(gè)方面，檢測(cè)工具選自雜交保護(hù)測(cè)定(ΗΡΑ)、分子信標(biāo)、TaqMan探針、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)探針、誘導(dǎo)型FRET(iFRET)探針、小溝結(jié)合物(MGB)探針、分子火矩(torch)和雜交轉(zhuǎn)換(switch)探針。優(yōu)選地，所述檢測(cè)工具包含與靶多核苷酸序列部分互補(bǔ)的序列，且所述序列在復(fù)合引物或其互補(bǔ)序列中不存在。在某些實(shí)施方案中，靶多核苷酸序列是正義鏈(或加(+)_鏈)，而復(fù)合引物是負(fù)義鏈(或減(-)_鏈)，因此單鏈RNA產(chǎn)物是正義(+)的。在某些其它的實(shí)施方案中，靶多核苷酸序列是負(fù)義(_)的，而復(fù)合引物是正義(+)的，因此單鏈RNA產(chǎn)物是負(fù)義(-)的。本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及用于ー個(gè)或多個(gè)靶多核苷酸序列(可與“靶序列”互換使用)的選擇性擴(kuò)增和任選檢測(cè)的試劑盒。在有些實(shí)施方案中，所述靶序列不是在較長的多核苷酸序列(例如下文定義的微小RNA、siRNA、rasiRNA、piRNA、tnc RNA和smRNA)內(nèi)。在這些情況下，對(duì)于姆一個(gè)祀序列，試劑盒包含至少ー種復(fù)合引物，該復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分和與靶序列3’末端部分互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分。復(fù)合引物是用于引發(fā)引物延伸(超過靶序列的長度)以產(chǎn)生單鏈 DNA產(chǎn)物。在有些實(shí)施方案中，所述靶序列是在較長的多核苷酸序列內(nèi)。在這些情況下，對(duì)于每ー個(gè)靶序列，試劑盒包含至少ー種復(fù)合引物，該復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分和與靶序列3’末端部分互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分；和用于確定靶序列5’末端部分的工具；和任選檢測(cè)工具。所述工具為可引物延伸形成單鏈DNA產(chǎn)物的確定的3’末端。在某些實(shí)施方案中，所述復(fù)合引物、任選的確定工具和任選的檢測(cè)工具被置于試劑盒的同一容器裝置中。在某些實(shí)施方案中，所述復(fù)合引物、任選的確定工具和任選的檢測(cè)工具被置于試劑盒的獨(dú)立容器裝置中。任選地，本發(fā)明的試劑盒還包含說明手冊(cè)，該手冊(cè)記載了例如各容器裝置內(nèi)的成分、ー個(gè)或多個(gè)容器裝置的使用順序等內(nèi)容。本發(fā)明的第三個(gè)方面涉及組合物，其包含ー個(gè)或多個(gè)靶序列、一種或多種復(fù)合引物和一種或多種擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物(包括但不限于擴(kuò)增的核糖核苷酸靶序列和自折疊單鏈DNA產(chǎn)物)。所述自折疊單鏈DNA產(chǎn)物包括柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)和莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。所述柄-莖-環(huán)包含(i)包含啟動(dòng)子部分的5’單鏈柄(P) ；(ii)雙鏈莖，包含至少ー對(duì)彼此雜交的自折疊區(qū)段，其中自折疊區(qū)段中的一個(gè)是靶多核苷酸序列的5’末端部分或其互補(bǔ)序列；和任選地，
(iii)包含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)，。所述莖-環(huán)結(jié)構(gòu)與柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)不相同，因?yàn)?’單鏈柄在引物延伸之后已變成了雙鏈。3. I縮寫和術(shù)語除非另外有解釋，否則本文所用的所有科技術(shù)語都具有與本公開所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。盡管與本文所述相類似或等同的方法和材料都可以用于本公開的實(shí)施或檢驗(yàn)，但是下文還是描述了合適的方法和材料。本文描述的材料、方法和實(shí)施例僅僅是說明性的，而不是限制性的。術(shù)語“3’ ” 一般指一條多核苷酸或寡核苷酸中的ー個(gè)區(qū)域或位置是在同一條多核苷酸或寡核苷酸中的另ー個(gè)區(qū)域或位置的3’(下游)。術(shù)語“5’ ” 一般指一條多核苷酸或寡核苷酸中的ー個(gè)區(qū)域或位置是在同一條多核苷酸或寡核苷酸中的另ー個(gè)區(qū)域或位置的5’(上游)。術(shù)語“3’末端部分”和“3’末端區(qū)域” 一般指位于多核苷酸或寡核苷酸靠近3’末端的多核苷酸或寡核苷酸部分或區(qū)域，并且可以包括或者可以不包括與同一多核苷酸或寡核苷酸的3’最末端核苷酸(3’ most nucleotide)相連的3’最末端核苷酸(ー個(gè)或多個(gè))或部分。3’末端部分或區(qū)域可包含優(yōu)選約I至約20個(gè)、更優(yōu)選約3至約18個(gè)、甚至更優(yōu)選約5至約15個(gè)核苷酸。術(shù)語“5’末端部分”和“5’末端區(qū)域” 一般指位于多核苷酸或寡核苷酸5’末端的多核苷酸或寡核苷酸部分或區(qū)域，并且可以包括或者可以不包括與同一多核苷酸或寡核苷酸的5’最末端核苷酸相連的5’最末端核苷酸(ー個(gè)或多個(gè))或部分。5’末端部分或區(qū)域可包含優(yōu)選約I至約20個(gè)、更優(yōu)選約3至約18個(gè)、甚至更優(yōu)選約5至約15個(gè)核苷酸。允許某一事件(例如雜交、鏈延伸等)發(fā)生的條件或“適合”某一事件(例如雜交、鏈延伸等)發(fā)生的條件，或“合適的”條件是不阻止這類事件發(fā)生的條件。因此，這些條件容許、增強(qiáng)、有利于和/或有助于該事件。本領(lǐng)域已知的和本文描述的這類條件取決于例如核苷酸序列的性質(zhì)、溫度和緩沖液條件。這些條件也取決于什么事件是所需要的，例如是雜交、切割、鏈延伸還是轉(zhuǎn)錄。
術(shù)語“擴(kuò)增”一般指產(chǎn)生多拷貝的所需序列的過程?！岸嗫截悺币庵钢辽?個(gè)拷貝。“拷貝”不一定指與模板序列的完美序列互補(bǔ)性或同一性。例如，拷貝可包括核苷酸類似物，例如脫氧肌苷、故意的序列改變(例如通過引物引入的序列改變包含可與模板雜交但不互補(bǔ)的序列)，和/或在擴(kuò)增期間發(fā)生的序列錯(cuò)誤。在本文中可互換使用的術(shù)語“阻遏寡核苷酸(blocking oligonucleotide) ”、“阻遏序列(blocking sequence) ”、“阻斷序列(blocker sequence) ” 或“阻遏物(blocker)”，是一般以高親和力與模板核酸在位置5’到終止位點(diǎn)結(jié)合并且使得通過DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)的相對(duì)于包含靶序列的模板的DNA復(fù)制停止的多核苷酸或寡核苷酸。它的3’末端可以或不可以被DNA聚合酶阻斷延伸。阻遏寡核苷酸一般是本領(lǐng)域已知的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在與模板雜交的區(qū)域中，阻遏寡核苷酸包含修飾，其中，在一組給定的條件下，與沒有修飾的阻遏物相比，阻遏物能更牢固地與該區(qū)域結(jié)合。合適修飾的實(shí)例包括但不限于鎖核酸(LNA)、2’-0_甲基(2’-0Me)堿基等，以及在例如Kurn的美國專利第7，294，461號(hào)中描述的那些。術(shù)語“檢測(cè)”包括任何檢測(cè)方式，包括直接和間接檢測(cè)。例如，“可檢測(cè)較少的”產(chǎn)物可直接或間接觀察到，并且該術(shù)語表示任何減少(包括無產(chǎn)物)。同樣地，“可檢測(cè)較多的”產(chǎn)物意指任何増加，無論是直接還是間接觀察到的。本文所用的“確定靶多核苷酸序列的5’末端部分”是指定位或產(chǎn)生靶多核苷酸序列的5’末端用于指導(dǎo)引物延伸過程的終止或模板轉(zhuǎn)換(相對(duì)于靶多核苷酸序列)。用于確定靶多核苷酸序列的5’末端部分的工具包括但不限于緊接靶序列5’末端上游的模板中的區(qū)域進(jìn)行切割或產(chǎn)生切ロ的酶(例如限制酶)，和與緊接靶序列5’末端上游的模板中的區(qū)域雜交的核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸或模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO))。在某些實(shí)施方案中，短的靶序列不是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，因此，沒有主動(dòng)步驟參與確定短的靶序列的5’末端部分，因?yàn)?’末端部分是短的靶序列的天然5’末端部分，且不需要分離(例如通過酶作用進(jìn)行切割、裂解或產(chǎn)生切ロ)或產(chǎn)生(例如在引物延伸過程之前通過阻遏寡核苷酸或TSO雜交)。短的RNA靶的實(shí)例包括但不限于微小RNA(miRNA: Lee等人，1993，Cell75:843-854 ；Reinhart 等人，2000, Nature 403:901-906)、小干擾 RNA (siRNA:HamiIton等人，1999，Science 286:950-952 ;Hammond 等人，Nature 404:293-296)、重復(fù)相關(guān)小干擾 RNA (rasiRNA:Reinhart 和 Barrel, 2002，Science 297:183 ；Volpe 等人，2002，Science 297:1833-1837)和 PIWI-相互作用的 RNA(piRNA:Grivna 等人，2006，Genes Dev. 20:1709-1714)，如描述于Chiang等人的 US 2009-0220969A1 ;和極小的非編碼(tiny non-coding) RNA (tnc RNA)和小調(diào)節(jié)RNA (smRNA),如描述于Wang等人的US2009-0325813A1。術(shù)語“寡核苷酸” 一般指短的，一般為單鏈的，一般為合成的多核苷酸，一般而言(但是不一定)是長度小于約200個(gè)核苷酸。在本發(fā)明中，寡核苷酸包括例如復(fù)合引物、阻遏寡核苷酸和TS0。術(shù)語“寡核苷酸”和“多核苷酸”并不是相互排斥的。下面對(duì)多核苷酸的描述等于和完全適用于寡核苷酸。多核苷酸或寡核苷酸的在本文中可互換使用的“部分”或“區(qū)域”，是2個(gè)或更多個(gè)堿基的連續(xù)(contiguous)序列。在其它的實(shí)施方案中，部分或區(qū)域是3、5、10、15、20、25個(gè)連續(xù)核苷酸中的至少大約任何ー個(gè)。術(shù)語“啟動(dòng)子序列”一般指以雙鏈形式能夠介導(dǎo)RNA轉(zhuǎn)錄的單鏈DNA序列區(qū)域。在某些情形下，“啟動(dòng)子序列”和“啟動(dòng)子”可互換使用。啟動(dòng)子序列的實(shí)例包括但不限于可被T7、T3、SP6、Ml3 RNA聚合酶等識(shí)別的序列?！し崔D(zhuǎn)錄酶，也稱為依賴RNA的DNA聚合酶，是ー種將單鏈RNA轉(zhuǎn)錄成雙鏈DNA的DNA聚合酶。反轉(zhuǎn)錄酶的實(shí)例包括但不限于MMLV反轉(zhuǎn)錄酶、AMV反轉(zhuǎn)錄酶等。在本文中可互換使用的“靶多核苷酸序列”或“靶序列”，是需要擴(kuò)增的目標(biāo)多核苷酸序列。靶序列可以是已知的或未知的，當(dāng)提到其實(shí)際序列吋。一般而言，在本文中可互換使用的“多核苷酸模板”或“模板”，是含有靶序列的多核苷酸。在有些情況下，術(shù)語“靶序列”、“模板”、“多核苷酸模板”、“靶核酸”、“靶多核苷酸”及其各種變體在本文中都可互換使用。術(shù)語“模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(templateswitch oligonucleotide, TSO) ”一般指包含與模板在引物延伸的位置5’到終止位點(diǎn)進(jìn)行雜交的部分(或區(qū)域)并能夠在引物的延伸過程中通過DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)模板轉(zhuǎn)換的多核苷酸或寡核苷酸。一般而言，TSO是本領(lǐng)域已知的?！澳０遛D(zhuǎn)換”是指模板核酸中的變化，在單輪引物延伸的過程當(dāng)中，一般從靶核酸變成TSO的未雜交部分。TSO的實(shí)例包括但不限于Kurn等人的WO 00/070095中描述的那些。在本文中可互換使用的術(shù)語“終止多核苷酸序列”和“終止序列”，是指使得通過DNA聚合酶實(shí)現(xiàn)的相對(duì)于包含靶序列的模板的DNA復(fù)制停止的多核苷酸序列。終止序列包含一般與模板在位置5’到終止點(diǎn)(位點(diǎn))進(jìn)行雜交的部分(或區(qū)域)。本文提供了合適終止多核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸和TS0)的多個(gè)實(shí)例。在本文中可互換使用的術(shù)語“終止位點(diǎn)”和“終止點(diǎn)”，是指在聚合(一般是引物延伸)或模板轉(zhuǎn)換的終止之前通過DNA聚合酶最后復(fù)制的模板的位點(diǎn)、點(diǎn)或區(qū)域。例如，對(duì)于TS0,它是在模板從模板多核苷酸轉(zhuǎn)換成TSO的未雜交部分之前,與引物延伸產(chǎn)物3，末端互補(bǔ)的靶序列中的位置或區(qū)域。本文所用的術(shù)語“變化”意指在某個(gè)方面變得不相同，例如被改變，例如増加或減少?？蓹z測(cè)變化是可以被檢測(cè)出來的變化，例如信號(hào)(例如熒光)的強(qiáng)度、頻率或存在中的變化。在具體的實(shí)例中，可檢測(cè)變化是熒光強(qiáng)度的降低。本文所用的術(shù)語“互補(bǔ)”意指ー個(gè)核酸分子的堿基與另ー個(gè)核酸分子的堿基形成氫鍵時(shí)發(fā)生的結(jié)合。在正常情況下，堿基腺嘌呤(A)與胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)互補(bǔ)，而胞嘧啶(C)與鳥嘌呤(G)互補(bǔ)。例如，一條單鏈(SS)DNA分子的序列5’ ATCG 3’可與另ー條ssDNA的3’ TAGC 5’鍵合形成雙鏈(ds)DNA。在這個(gè)例子中，序列5’ ATCG 3’是3’ TAGC5’的反向互補(bǔ)序列。核酸分子可以彼此互補(bǔ)，甚至在沒有各分子的所有堿基完全形成氫鍵的情況下。例如，與互補(bǔ)核酸序列雜交可以發(fā)生在不同嚴(yán)格性的條件下，在此條件下，互補(bǔ)序列將在有些而不是所有的核苷酸位置結(jié)合。本文所用的術(shù)語“熒光團(tuán)(fluOTophore) ”意指因暴露于光的特定波長而激發(fā)時(shí)發(fā)出光(發(fā)突光)的化合物，例如在光的不同波長時(shí)。不例性的突光團(tuán)包括但不限于6_羧基熒光素；5-羧基熒光素(5-FAM) ;ニ吡咯甲烷ニ氟化硼(BODIPY) ；N, N，N’，N’ -四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA);卩丫唆、芪(stilbene)、-6-羧基-熒光素(HEX)、TET (四甲基熒光素)、6_羧基-X-羅丹明(ROX)、得克薩斯紅(Texas Red)、2’，7’ -ニ甲氧基-4’，5’ -ニ氯_6_羧基熒光素(JOE)、Cy3、Cy5、VIC. RTM. (Applied Biosystems)、LC Red 640,LC Red 705,Yakimayellow及其衍生物。術(shù)語“熒光團(tuán)”也包括有發(fā)光分子，發(fā)光分子是不需要暴露于光的特定波長才發(fā)出熒光的化合物；發(fā)光分子天然發(fā)出熒光。因此，發(fā)光信號(hào)的使用可以消除對(duì)電磁 輻射的外部來源(例如激光)的需求。本文所用的短語“[核酸分子的]雜交”意指當(dāng)兩個(gè)互補(bǔ)核酸分子彼此經(jīng)歷適量的氫鍵鍵合時(shí)發(fā)生的結(jié)合。雜交的嚴(yán)格性可以根據(jù)圍繞核酸分子的環(huán)境條件、雜交方法的性質(zhì)及所用核酸分子的組成和長度而變化。有關(guān)需要達(dá)到嚴(yán)格性特定程度的雜交條件的計(jì)算在以下文獻(xiàn)中有論述Sambrook等人，Molecular Cloning:A LaboratoryManual (Cold Spring Haroor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,N. Y. , 2001)；和 Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes Part I, Chapter 2(Elsevier, N. Y.，1993) 0Tm是核酸給定鏈的50%與其互補(bǔ)鏈雜交的溫度。本文所用的術(shù)語“嚴(yán)格條件”包括僅在雜交核酸分子和靶序列間小于25%錯(cuò)配的情形下才發(fā)生雜交的條件?！爸械葒?yán)格”的條件是在具有大于25%序列錯(cuò)配的核酸分子將不雜交下的條件?！爸虚g(medium)嚴(yán)格性”的條件是在具有大于15%錯(cuò)配的核酸分子將不雜交下的條件；“高嚴(yán)格性”的條件是在具有大于10%錯(cuò)配的核酸分子將不雜交下的條件；和“非常高嚴(yán)格性”的條件是在具有大于5%錯(cuò)配的核酸分子將不雜交下的條件。中等嚴(yán)格雜交條件包括在例如約42° C，在含有25mM KPO4(pH7. 4)、5XSSC、5XDenhart氏溶液、50 μ g/mL變性的超聲處理的鮭魚精DNA、50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖和l-15ng/mL探針(約5X107Cpm/l·! g)的雜交液中進(jìn)行雜交的條件，盡管洗滌是在約50° C用含有2XSSC和O. 1%十二烷基硫酸鈉的洗滌溶液進(jìn)行。高嚴(yán)格雜交條件包括在例如約42° C，在含有25mM KP04(pH7. 4)、5XSSC、5XDenhart氏溶液、50 μ g/mL變性的超聲處理的鮭魚精DNA、50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖和l-15ng/mL探針(約SXlOYpm/yg)的雜交液中進(jìn)行雜交的條件，盡管洗滌是在約65° C用含有O. 2XSSC和O. 1%十二烷基硫酸鈉的洗滌溶液進(jìn)行。本文描述的互補(bǔ)核酸序列可以在嚴(yán)格、中等嚴(yán)格和/或高嚴(yán)格條件下進(jìn)行雜交。本文所用的術(shù)語“分離的[生物成分]”意指已基本上從其它生物成分中分離、產(chǎn)生或純化的生物成分(例如核酸分子)。已經(jīng)“分離”的核酸分子包括通過標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的核酸分子，以及化學(xué)合成的那些?！胺蛛x的”不需要絕對(duì)的純度，并且可包括至少50%分離的，例如至少75%、80%、90%、95%、98%、99%或甚至100%分離的核酸分子。本文所用的術(shù)語“標(biāo)記物”意指能夠檢測(cè)、例如通過分光光度測(cè)定法、流式細(xì)胞術(shù)或顯微鏡術(shù)檢測(cè)的物質(zhì)(agent)。例如，標(biāo)記物可以與核苷酸相連，從而容許核苷酸的檢測(cè)，例如核苷酸是其中一部分的核酸分子的檢測(cè)。標(biāo)記物的實(shí)例包括但不限于放射性同位素、酶底物、輔因子、配體、化學(xué)發(fā)光劑、熒光團(tuán)、半抗原、酶及其組合。適用于不同目的的用于標(biāo)記的方法和標(biāo)記物選擇的指導(dǎo)在例如Sambrook等人(Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989)和 Ausubel 等人(In Current Protocols inMolecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1998)中有論述。本文所用的術(shù)語“核酸分子”或“多核苷酸序列”意指脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合體，其可包括以類似于天然存在的核苷酸的方式與核酸分子雜交的天然核苷酸的類似物。在ー個(gè)具體實(shí)例中，核酸分子或多核苷酸序列是單鏈(Ss) DNA或RNA分子，例如引物。在另ー個(gè)具體實(shí)例中，核酸分子或多核苷酸序列是雙鏈(ds) DNA,例如靶多核苷酸序列。DNA 的主要核苷酸是脫氧腺苷5’ -三磷酸(dATP或A)、脫氧鳥苷5’ -三磷酸(dGTP或G)、脫氧胞苷5’ -三磷酸(dCTP或C)和脫氧胸苷5’ -三磷酸(dTTP或T)。RNA的主要核苷酸是腺苷5’ -三磷酸(ATP或A)、鳥苷5’ -三磷酸(GTP或G)、胞苷5’ -三磷酸(CTP或C)和尿苷5’-三磷酸(UTP或U)。核苷酸包括含有修飾堿基、修飾糖部分和修飾磷酸主鏈的那些核苷酸，例如描述于Nazarenko等人的美國專利第5，866, 336號(hào)中的那些。可用于在任何位置在其結(jié)構(gòu)上修飾核苷酸的修飾堿基部分實(shí)例包括但不限于5_氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黃嘌呤、黃嘌呤、こ?；奏ぁ?-(羧基羥基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、ニ氫尿嘧啶、β -D-半乳糖基Q核苷、肌苷、Ν-6-異戊烯基腺嘌呤、I-甲基鳥嘌呤、I-甲基肌苷、2，2-ニ甲基鳥嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鳥嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、Ν6-腺嘌呤、7-甲基鳥嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β -D-甘露糖基Q核苷、5’ -甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-Ν6-異戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧基こ酸、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、2_硫代胞嘧啶、5-甲基_2_硫代尿嘧啶、2_硫代尿嘧啶、4_硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧基こ酸甲酷、尿嘧啶-S-氧基こ酸、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶和2，6- ニ氨基嘌呤。本文所用的術(shù)語“引物”意指短的單鏈多核苷酸，一般具有游離3’-OH基團(tuán)，當(dāng)與其互補(bǔ)IE核酸雜交時(shí)，允許通過聚合酶例如反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行鏈延伸。屬于(bracketing)擴(kuò)增子的引物對(duì)可用于例如通過TMA、PCR或其它核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用一種復(fù)合引物，所述復(fù)合引物包含(i)5’啟動(dòng)子部分，和(ii)3’靶-識(shí)別部分，其與靶多核苷酸序列3’末端部分互補(bǔ)，并且長度不超過30、40、50、60、70或80個(gè)，優(yōu)選不超過60個(gè)堿基。本文所用的短語“定量[核酸分子]”意指測(cè)定或測(cè)量存在的核酸分子的數(shù)量(例如相對(duì)數(shù)量)，例如樣品中存在的核酸分子數(shù)目。在具體的實(shí)例中，它是測(cè)定樣品中存在的核酸分子的相對(duì)量或?qū)嶋H數(shù)目。本文所用的術(shù)語“熒光的猝滅”意指熒光的減少。例如，當(dāng)猝滅劑分子(例如鳥苷)以足夠接近熒光團(tuán)存在時(shí)，就發(fā)生序列上熒光團(tuán)的熒光被猝滅，在互補(bǔ)鏈合成期間，它減少報(bào)道分子的熒光信號(hào)。本文所用的術(shù)語“實(shí)時(shí)TMA”意指用于檢測(cè)和測(cè)量在TMA過程中產(chǎn)生的產(chǎn)物的方法，該產(chǎn)物是與TMA開始前靶核酸量成比例。所獲得的信息(例如擴(kuò)增曲線)可用于定量測(cè)定靶核酸的起始數(shù)量。本文所用的術(shù)語“重組[核酸分子]”是具有不是天然存在的序列或通過兩種別的不同序列區(qū)段的人工組合產(chǎn)生的序列的核酸分子。這種人工組合可以例如通過化學(xué)合成或通過核酸分子的分離區(qū)段的人工操作，例如通過遺傳工程技術(shù)來完成。本文所用的術(shù)語“樣品”意指生物樣品，例如含有核酸分子(例如基因組DNA、cDNA、RNA、mRNA、rRNA或其組合)的樣品。樣品可以得自受治療者的細(xì)胞，例如外周血、尿液、唾液、組織活檢樣品、手術(shù)樣本、細(xì)針穿刺抽吸物、羊膜腔穿刺術(shù)樣品和尸檢材料中存在的細(xì)胞。本文所用的術(shù)語“靶-識(shí)別部分”意指例如在嚴(yán)格、中等嚴(yán)格或高嚴(yán)格條件下可與 靶核酸基本上雜交的核苷酸序列。在具體的實(shí)例中，這樣的靶-識(shí)別部分是長至少5、10、
15、20、30、40或更多個(gè)核苷酸。優(yōu)選，靶-識(shí)別部分是長約15-35個(gè)核苷酸。本文所用的術(shù)語“信號(hào)”意指指示物，例如可從所得信息獲知的可檢測(cè)物理數(shù)量。在一個(gè)實(shí)例中，標(biāo)記物發(fā)出能夠檢測(cè)的信號(hào)，例如熒光信號(hào)。本文所用的術(shù)語“[核酸分子]的合成”意指從其組分零件構(gòu)建核酸分子，例如通過復(fù)制核酸分子或多核苷酸序列。實(shí)例包括但不限于使用反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行DNA合成和依賴RNA的DNA合成。本文所用的術(shù)語“靶[核酸分子]”意指其檢測(cè)、定量、定性檢測(cè)或其組合是預(yù)計(jì)的核酸分子。該核酸分子不需要呈純化形式。各種其它核酸分子也可以與靶核酸分子一起存在。例如，靶核酸分子可以是細(xì)胞中的特定核酸分子(其可包括宿主RNA (例如mRNA)和DNA (例如基因組DNA或cDNA)以及其它核酸分子例如病毒、細(xì)菌或真菌的核酸分子)，其擴(kuò)增是可預(yù)計(jì)的。靶核酸分子的純化或分離，如果需要，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法進(jìn)行，例如通過使用市售的純化試劑盒等來進(jìn)行。 本文所用的術(shù)語“上游”和“下游”是DNA或RNA中的相對(duì)位置。DNA或RNA的每一條鏈都具有5’末端和3’末端，所以根據(jù)脫氧核糖環(huán)上的碳予以命名。相對(duì)于鏈上的位置，下游是朝向鏈的3’ -末端的區(qū)域，而上游是朝向鏈的5’末端的區(qū)域。由于DNA鏈按相反的方向排列，因此一條鏈的下游就是另一條鏈的上游。4.附圖簡(jiǎn)述圖I.使用本發(fā)明的復(fù)合引物、阻遏寡核苷酸和檢測(cè)工具(detection means)的單個(gè)短的RNA靶多核苷酸序列擴(kuò)增和檢測(cè)。圖2.使用本發(fā)明的復(fù)合引物、阻遏寡核苷酸和檢測(cè)工具的單個(gè)RNA靶多核苷酸序列擴(kuò)增和檢測(cè)。圖3.使用本發(fā)明的復(fù)合引物和阻遏寡核苷酸的單個(gè)RNA靶多核苷酸序列擴(kuò)增。圖4.使用本發(fā)明的復(fù)合引物和阻遏寡核苷酸的單個(gè)RNA靶多核苷酸序列擴(kuò)增。圖5.使用本發(fā)明的復(fù)合引物、阻遏序列、包含通用序列的啟動(dòng)子引物和檢測(cè)工具的單個(gè)RNA靶多核苷酸序列擴(kuò)增和檢測(cè)。圖6.使用本發(fā)明的復(fù)合引物和模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)的單個(gè)RNA靶多核苷酸序列擴(kuò)增。圖7.使用本發(fā)明的復(fù)合引物、阻遏序列和檢測(cè)工具的單個(gè)DNA靶多核苷酸序列擴(kuò)增和檢測(cè)。圖8.使用本發(fā)明方法進(jìn)行多個(gè)RNA靶多核苷酸序列擴(kuò)增和檢測(cè)的復(fù)合引物、阻遏序列、RNA/DNA雜交體和檢測(cè)工具的通用序列格式(formula)。圖9.無靶(陰性對(duì)照)或Ipg的HCV RNA用本發(fā)明的復(fù)合引物擴(kuò)增的擴(kuò)增原始曲線。

圖10. HCV RNA用具有不同長度折疊序列的復(fù)合引物擴(kuò)增的擴(kuò)增原始曲線。圖11.無靶(陰性對(duì)照)或IOpgUpg或O. Ipg的HCV RNA用本發(fā)明的復(fù)合引物 擴(kuò)增的擴(kuò)增原始曲線。5.發(fā)明詳述下面第5. I小節(jié)詳細(xì)描述了本發(fā)明的復(fù)合引物和方法。下面第5. 2小節(jié)詳細(xì)描述了包含本發(fā)明的復(fù)合引物和擴(kuò)增產(chǎn)物的組合物和試劑盒。5. I本發(fā)明的復(fù)合引物和方法轉(zhuǎn)錄-介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)是使用兩種酶(即RNA聚合酶和反轉(zhuǎn)錄酶)和兩種引物來驅(qū)動(dòng)反應(yīng)的RNA轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增系統(tǒng)。其中一種引物含有RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列。在第一個(gè)步驟中，啟動(dòng)子-引物與靶RNA在確定的位點(diǎn)雜交。反轉(zhuǎn)錄酶(RT)通過從啟動(dòng)子-引物的3’末端延伸產(chǎn)生具有與靶RNA互補(bǔ)的序列的單鏈DNA模板。所得RNA/DNA雜交體中的RNA被反轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降解。然后，第二引物與單鏈DNA模板結(jié)合。通過反轉(zhuǎn)錄酶從第二引物的末端合成了一條新的DNA鏈，從而產(chǎn)生雙鏈DNA分子。RNA聚合酶識(shí)別雙鏈DNA分子中的啟動(dòng)子序列并起始轉(zhuǎn)錄。新合成的RNA擴(kuò)增子中的每ー個(gè)都重新進(jìn)入TMA過程并充當(dāng)新ー輪復(fù)制的模板，導(dǎo)致RNA擴(kuò)增子的指數(shù)擴(kuò)充。由于每ー個(gè)雙鏈DNA分子都可以產(chǎn)生100-1000拷貝的RNA擴(kuò)增子，因此該擴(kuò)充可導(dǎo)致在I小時(shí)以內(nèi)產(chǎn)生100億個(gè)擴(kuò)增子。TMA是等溫的；整個(gè)反應(yīng)都在水浴或加熱塊中在相同的溫度下進(jìn)行。這與需要熱循環(huán)儀器快速改變溫度以驅(qū)動(dòng)反應(yīng)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)等其它擴(kuò)增反應(yīng)相漢。如上所論述的，常規(guī)的TMA需要使用引物對(duì)，其中第一啟動(dòng)子-引物包含與靶核酸區(qū)雜交的靶-識(shí)別部分，而第二非啟動(dòng)子引物包含不與啟動(dòng)子-引物所雜交的靶核酸區(qū)重疊并在其上游的靶核酸區(qū)。因此，TMA通常在引物設(shè)計(jì)和優(yōu)化時(shí)需要使用至少兩種靶特異性序列。當(dāng)擴(kuò)增和檢測(cè)包括超過ー個(gè)靶核酸時(shí)，對(duì)于每個(gè)靶，需要對(duì)每種引物和探針進(jìn)行設(shè)計(jì)和優(yōu)化。這些是既昂貴又耗時(shí)的，常常富有挑戰(zhàn)性和困難的過程。當(dāng)具體靶的有用序列有限時(shí)，設(shè)計(jì)兩種序列特異性引物是很困難的。相反，本發(fā)明只需要使用ー種引物，由于種種理由，這是有優(yōu)勢(shì)的。首先，ー種序列特異性引物的需求有利于引物的設(shè)計(jì)，尤其是在具體靶的有用序列有限的情況下。此外，當(dāng)擴(kuò)增過程僅使用ー種引物時(shí)，計(jì)劃外的擴(kuò)增產(chǎn)物幾乎很少形成。另外，由于每個(gè)靶僅需要一種引物，反應(yīng)系統(tǒng)的優(yōu)化要容易得多，尤其是在多重?cái)U(kuò)增和檢測(cè)吋。有時(shí)，在靶序列的某些區(qū)域內(nèi)存在ニ級(jí)結(jié)構(gòu)，使得這樣的區(qū)域在引物設(shè)計(jì)中是不需要使用的。例如，在TMA系統(tǒng)中，將需要輔助寡核苷酸來打開這些ニ級(jí)結(jié)構(gòu)以便提高擴(kuò)增效率。然而，這些區(qū)域可包括在本發(fā)明的復(fù)合引物中，因?yàn)楗思?jí)結(jié)構(gòu)可用于促進(jìn)自折疊柄-莖-環(huán)產(chǎn)物的形成。本 發(fā)明在擴(kuò)增過程中使用ー種引物，即復(fù)合引物。該復(fù)合引物包含(i)5’啟動(dòng)子部分(P)和(ii)與靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分，靶多核苷酸序列(T)有時(shí)是在較長的多核苷酸模板內(nèi)。在第一個(gè)步驟中，該復(fù)合引物與靶多核苷酸序列雜交。在同時(shí)或緊接其后，對(duì)靶多核苷酸序列的5’末端進(jìn)行確定。如果靶多核苷酸序列是如上所述的短靶序列，那么靶多核苷酸序列的5’末端就是天然的5’末端。如果靶多核苷酸序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，那么或者使用酶在多核苷酸模板區(qū)切割、產(chǎn)生切ロ或裂解，或者通過使核苷酸序列(例如阻遏寡核苷酸或模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO))與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端。然后，反轉(zhuǎn)錄酶(RT)通過從復(fù)合引物的3’末端延伸產(chǎn)生具有其序列與靶多核苷酸序列互補(bǔ)的單鏈DNA模板。所得RNA/DNA雜交體中的RNA被反轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降解。剩余的單鏈DNA模板包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)。具體地說，單鏈DNA包含彼此互補(bǔ)和有時(shí)彼此分隔開的ー對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在單鏈DNA模板的5’末端，而自折疊區(qū)段中的ー個(gè)是在單鏈DNA模板的3’末端。單鏈DNA模板自折疊并形成柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的該對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖、和含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。然后，反轉(zhuǎn)錄酶延伸柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端，產(chǎn)生具有啟動(dòng)子序列的雙鏈柄。RNA聚合酶識(shí)別該啟動(dòng)子序列并起始轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物，包含靶多核苷酸序列(T)和有時(shí)在3’末端也包含啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)。新合成的單鏈RNA產(chǎn)物(也稱為“RNA擴(kuò)增子”)中的每ー個(gè)重新進(jìn)入TMA過程并充當(dāng)新ー輪復(fù)制的模板。具體地說，同一種復(fù)合引物(或有時(shí)是其較短的形式，優(yōu)選包括在靶多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中不存在的通用序列)與單鏈RNA產(chǎn)物雜交。然后，反轉(zhuǎn)錄酶通過從復(fù)合引物的3’末端延伸來產(chǎn)生單鏈RNA產(chǎn)物的單鏈DNA模板。所得RNA/DNA雜交體中的RNA被反轉(zhuǎn)錄酶的RNA酶H活性降解。剰余的單鏈DNA模板包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)，并同樣包含彼此互補(bǔ)和分隔開的該對(duì)自折疊區(qū)段。一旦單鏈DNA模板自折疊并形成柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，反轉(zhuǎn)錄酶就延伸柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端，產(chǎn)生具有被RNA聚合酶識(shí)別以起始轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列的雙鏈柄，從而產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA。如圖1-7所示，在TMA系統(tǒng)中，一種復(fù)合引物就足以滿足靶多核苷酸序列(圖1_6中的RNA和圖7中的DNA)的擴(kuò)增。在某些實(shí)施方案中，所述方法用于不在較長的多核苷酸模板內(nèi)的短的祀多核苷酸序列的擴(kuò)增(見圖I)。圖I中舉例說明的方法使用復(fù)合引物，其包含(i)5’啟動(dòng)子部分(P)，(ii)與靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分(Be)，和(iii)在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分(Be)之間，對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列(Ac)形成ー對(duì)自折疊區(qū)段，在第一個(gè)步驟(I)中，靶多核苷酸序列⑴與復(fù)合引物㈠雜交，且靶多核苷酸序列的5’末端㈧是靶多核苷酸序列的天然5’末端。然后，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第一 RNA/DNA雜交體。在第二個(gè)步驟(2)中，RNA部分被去除以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的單鏈DNA模板(_)，所述單鏈DNA模板也包含該對(duì)自折疊區(qū)段(即A和Ac)，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在單鏈DNA模板的5’末端，而自折疊區(qū)段中的ー個(gè)(即Ac)是在單鏈DNA模板的3’末端。在第三個(gè)步驟(3)中，單鏈DNA模板自折疊并形成柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的該對(duì)自折疊區(qū)段(即A和Ac)的雙鏈莖、和含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第四個(gè)步驟(4)中，柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。在第五個(gè)步驟(5)中，轉(zhuǎn)錄從雙鏈啟動(dòng)子開始以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)，其中啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)是在單鏈RNA產(chǎn)物的3’末端。在第六步驟￠)中，單鏈RNA產(chǎn)物與復(fù)合引物雜交。在第七個(gè)步驟(7)中，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體。在第八個(gè)步驟⑶中，從第二 RNA/DNA雜交體中去除RNA部分以產(chǎn)生單鏈DNA模板。繼續(xù)進(jìn)行步驟(3)、(4)和(5)以便指數(shù)產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物。單鏈RNA產(chǎn)物可以使用例如包含與靶多核苷酸序列部分互補(bǔ)的序列的分子信標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，其中所述序列在復(fù)合引物或靶多核苷酸序列的5’末端部分或它們的相應(yīng)互補(bǔ)序列中不存在。在某些實(shí)施方案中，所述方法包括使用阻遏寡核苷酸(“阻遏物”)來確定靶多核 苷酸序列的5’末端。圖2-4說明使用本發(fā)明的復(fù)合引物和阻遏寡核苷酸進(jìn)行的單個(gè)RNA靶多核苷酸序列的擴(kuò)增和檢測(cè)。圖2中舉例說明的方法使用復(fù)合引物，其包含(i)5’啟動(dòng)子部分(P)，(ii)與靶多核苷酸序列⑴的3’末端部分⑶互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和(iii)在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分(Be)之間，對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列(Ac)形成ー對(duì)自折疊區(qū)段。在第一個(gè)步驟(I)中，靶多核苷酸序列(+)與復(fù)合引物(-)雜交，且通過阻遏寡核苷酸(“阻遏物”)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端(A)上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第一 RNA/DNA雜交體。在第二個(gè)步驟(2)中，RNA部分被去除以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的單鏈DNA模板(_)，所述單鏈DNA模板也包含該對(duì)自折疊區(qū)段(即A和Ac)，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在單鏈DNA模板的5’末端，而所述自折疊區(qū)段中的ー個(gè)(即Ac)是在單鏈DNA模板的3’末端。在第三個(gè)步驟(3)中，單鏈DNA模板自折疊并形成柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的該對(duì)自折疊區(qū)段(即A和Ac)的雙鏈莖、和含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第四個(gè)步驟(4)中，柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。在第五個(gè)步驟(5)中，從雙鏈啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)，其中啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)是在單鏈RNA產(chǎn)物的3’末端。在第六步驟(6)中，單鏈RNA產(chǎn)物與復(fù)合引物雜交。在第七個(gè)步驟(7)中，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體。在第八個(gè)步驟⑶中，從第二 RNA/DNA雜交體中去除RNA部分以產(chǎn)生單鏈DNA模板。繼續(xù)進(jìn)行步驟(3)、(4)和(5)以便指數(shù)產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物。單鏈RNA產(chǎn)物可以使用例如包含與靶多核苷酸序列部分互補(bǔ)的序列的分子信標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，其中所述序列在復(fù)合弓I物或靶多核苷酸序列的5’末端部分或它們的相應(yīng)互補(bǔ)序列中不存在。圖3中舉例說明的方法使用復(fù)合引物，其包含(i)5’啟動(dòng)子部分(P)，和(ii)與靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，其中3’靶-識(shí)別部分(Be)包含對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的區(qū)段，并且合在一起，所述區(qū)段及其互補(bǔ)序列形成第一對(duì)自折疊區(qū)段。在第一個(gè)步驟(I)中，靶多核苷酸序列(+)與復(fù)合引物(_)雜交，且通過阻遏寡核苷酸(“阻遏物”)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第一 RNA/DNA雜交體。在第二個(gè)步驟(2)中，RNA部分被去除以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第一單鏈DNA模板(-)，所述第一單鏈DNA模板也包含第一對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第一單鏈DNA模板的5’末端，而自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第一單鏈DNA模板的3’末端。在第三個(gè)步驟(3)中，第一單鏈DNA模板自折疊并形成第一柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的第一對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖、和含介于第一對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第四個(gè)步驟(4)中，第一柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。在第五個(gè)步驟(5)中，從雙鏈啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)，其中啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)是在單鏈RNA產(chǎn)物的3’末端。在第六步驟￠)中，單鏈RNA產(chǎn)物與復(fù)合引物雜交。在第七個(gè)步驟
(7)中，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體。在第八個(gè)步驟⑶中，從第二·RNA/DNA雜交體中去除RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板(-)，所述第二單鏈DNA模板也包含彼此互補(bǔ)和分隔開的第二對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端。在第九個(gè)步驟(9)中，第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖、和含介于第二對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第十個(gè)步驟(10)中，第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。從雙鏈啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物。圖4中舉例說明的方法使用復(fù)合引物，其包含(i)5’啟動(dòng)子部分(P)，和(ii)與靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在較長的多核苷酸模板內(nèi)。靶多核苷酸序列包含第一對(duì)自折疊區(qū)段，其包含對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的區(qū)段及其位于靶多核苷酸序列獨(dú)立部分的互補(bǔ)序列(Ac)。在第一個(gè)步驟⑴中，靶多核苷酸序列⑴與復(fù)合引物㈠雜交，且通過阻遏寡核苷酸(“阻遏物”)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端。然后，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第一 RNA/DNA雜交體。在第二個(gè)步驟(2)中，RNA部分被去除以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第一單鏈DNA模板(_)，所述第一單鏈DNA模板也包含第一對(duì)自折疊區(qū)段(即A和Ac)，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第一單鏈DNA模板的5’末端，而自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第一單鏈DNA模板的3’末端。在第三個(gè)步驟(3)中，第一單鏈DNA模板自折疊并形成第一柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分(Be)的5’單鏈柄、含彼此雜交的第一對(duì)自折疊區(qū)段(即A和Ac)的雙鏈莖、和含介于第一對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第四個(gè)步驟(4)中，第一柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。在第五個(gè)步驟(5)中，從雙鏈啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)，其從5’到3’端包含復(fù)合引物的3’末端靶-識(shí)別部分(Be)、靶多核苷酸序列(T)和啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)，其中啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)是在單鏈RNA產(chǎn)物的3’末端。在第六步驟￠)中，單鏈RNA產(chǎn)物與復(fù)合引物雜交。在第七個(gè)步驟(7)中，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體。在第八個(gè)步驟(8)中，從第二 RNA/DNA雜交體中去除RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板(-)，所述第二單鏈DNA模板也包含彼此互補(bǔ)和分隔開的第二對(duì)自折疊區(qū)段(即B和Be)，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端。在第九個(gè)步驟(9)中，第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖、和含介于第二對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第十個(gè)步驟(10)中，第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。從雙鏈啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物。圖5中舉例說明的方法使用復(fù)合引物，其包含(i)5’啟動(dòng)子部分(P)，(ii)與靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和從5’到3’端，并在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分(Be)之間，(iii)在靶多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中不存在的通用部分(U)，和(iv)對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列(Ac)形成第一對(duì)自折疊區(qū)段。在第一個(gè)步驟(I)中，靶多核苷酸序列(+)與復(fù)合引物(_)雜交，且通過阻遏序列(“阻遏物”)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端(A)上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后,復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第一 RNA/DNA雜交體。在第二個(gè)步驟(2)中，RNA部分被去除以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)、通用部分(U)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第一單鏈DNA模板(-)，所述第一單鏈DNA模板也包含第一對(duì)自折疊區(qū)段(即A和Ac)，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在單鏈DNA模板的5’末端，而自折疊區(qū)段中的ー個(gè)(即Ac)是在單鏈DNA模板的3’末端。在第三個(gè)步驟(3)中，第一單鏈DNA模板自折疊并形成第一柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)的5’單鏈柄、含彼此雜交的該對(duì)自折疊區(qū)段(即A和Ac)的雙鏈莖、和含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第四個(gè)步驟(4)中，柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。在第五個(gè)步驟(5)中，從雙鏈啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)，其中啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)是在單鏈RNA產(chǎn)物的3’末端。在第六步驟出)中，單鏈RNA產(chǎn)物與復(fù)合引物雜交。或者，單鏈RNA產(chǎn)物與由啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)組成、優(yōu)選基本上由啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)組成的較短復(fù)合引物 雜交。在第七個(gè)步驟(7)中，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體。在第八個(gè)步驟(8)中，從第二 RNA/DNA雜交體中去除RNA部分以產(chǎn)生第二單鏈DNA模板。在第九個(gè)步驟(9)中，第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段(即U和Uc)的雙鏈莖、和含介于第二對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第十個(gè)步驟(10)中，第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。從雙鏈啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物。單鏈RNA產(chǎn)物可以使用例如包含與靶多核苷酸序列部分互補(bǔ)的序列的分子信標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，其中所述序列在復(fù)合引物、靶多核苷酸序列的5’末端部分、通用部分或其相應(yīng)的互補(bǔ)序列中不存在。在某些實(shí)施方案中,所述方法包括在祀多核苷酸序列的5’末端使用模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)引入確定的序列(參見例如圖6)。在序列的一端引入確定的序列的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的(參見例如Laney等人的美國專利第5，679，512號(hào)；和Kurn的美國專利第6，251，639號(hào))。圖6中舉例說明的方法使用復(fù)合引物，其包含(i)5’啟動(dòng)子部分(P)，(ii)與靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分(B)互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分(Be)，靶多核苷酸序列(T)是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和(iii)在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分(Be)之間，在靶多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中不存在的通用部分(U)，其中通用部分(U)及其互補(bǔ)序列(Uc)形成ー對(duì)自折疊區(qū)段。在第一個(gè)步驟(I)中，靶多核苷酸序列(+)與復(fù)合引物(_)雜交，且通過包含通用部分(U)的模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端 (A)上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第一 RNA/DNA雜交體。在第二個(gè)步驟(2)中，RNA部分被去除以產(chǎn)生單鏈DNA模板(_)，其從5’到3’端包含啟動(dòng)子部分(P)、靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)和通用部分(U)的互補(bǔ)序列，所述單鏈DNA模板也包含該對(duì)自折疊區(qū)段(即U和Uc)，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在單鏈DNA模板的5’末端，而自折疊區(qū)段中的ー個(gè)(即Uc)是在單鏈DNA模板的3’末端。在第三個(gè)步驟(3)中，單鏈DNA模板自折疊并形成柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的該對(duì)自折疊區(qū)段(即U和Uc)的雙鏈莖、和含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第四個(gè)步驟(4)中，柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。在第五個(gè)步驟(5)中，從雙鏈啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)，其中啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)是在單鏈RNA產(chǎn)物的3’末端。在第六步驟(6)中，單鏈RNA產(chǎn)物與復(fù)合引物雜交。在第七個(gè)步驟(7)中，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體。在第八個(gè)步驟(8)中，從第二 RNA/DNA雜交體中去除RNA部分以產(chǎn)生單鏈DNA模板。繼續(xù)進(jìn)行步驟(3)、(4)、(5)和(6)以便指數(shù)產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物。如圖7所示，本發(fā)明的方法也可用于ー種或多種DNA靶多核苷酸序列的擴(kuò)增。在第一個(gè)步驟⑴中，使雙鏈DNA雙鏈體變性以產(chǎn)生包含靶多核苷酸序列⑴的單鏈DNA多核苷酸模板。在第二個(gè)步驟⑵中，復(fù)合引物㈠從5’到3’端包含⑴5’啟動(dòng)子部分(P)，
(ii)對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的區(qū)段，和(iii)與靶多核苷酸序列(T)的3’末端部分互補(bǔ)且與靶多核苷酸序列雜交的3’靶-識(shí)別部分，且通過阻遏寡核苷酸與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交來確定靶多核苷酸序列的5’末端(A)。然后，靶多核苷酸序列的3’末端延伸以產(chǎn)生DNA/DNA雜交體。在第三個(gè)步驟(3)中，使DNA/DNA雜交體變性以產(chǎn)生單鏈DNA模板(-)，其從5’到3’端包含啟動(dòng)子部分(P)、對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分(A)的區(qū)段和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)。在第四個(gè)步驟(4)中，單鏈DNA模板自折疊并形成莖-柄-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的該對(duì)自折疊區(qū)段(即A和Ac)的雙鏈莖、和含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。在第五個(gè)步驟(5)中，柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端延伸以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子。在第六步驟出)中，從雙鏈啟動(dòng)子開始轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)，其包含靶多核苷酸序列(T)和啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)，其中啟動(dòng)子部分的互補(bǔ)序列(Pc)是在單鏈RNA產(chǎn)物的3’末端。在第七個(gè)步驟(7)中，單鏈RNA產(chǎn)物與復(fù)合引物雜交。在第八個(gè)步驟(8)中，復(fù)合引物的3’末端延伸以產(chǎn)生RNA/DNA雜交體。在第九個(gè)步驟(9)中，從RNA/DNA雜交體中去除RNA部分以產(chǎn)生單鏈DNA模板。繼續(xù)進(jìn)行步驟(4)、(5)和(6)以便指數(shù)產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物。單鏈RNA產(chǎn)物可以使用例如包含與靶多核苷酸序列部分互補(bǔ)的序列的分子信標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，其中所述序列在復(fù)合弓I物或靶多核苷酸序列的5’末端部分或其相應(yīng)的互補(bǔ)序列中不存在。包含通用部分(U)的復(fù)合引物或模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸的使用為多重核酸檢測(cè)，例如在多種性傳播疾病檢測(cè)和血庫的病毒篩查中，提供了ー種非常簡(jiǎn)單的系統(tǒng)。例如，ー種含有通用部分的引物可以用于HIV、HCV和HBV的血庫多重?cái)U(kuò)增。
任選地，本發(fā)明的方法還包括檢測(cè)單鏈RNA產(chǎn)物產(chǎn)生的檢測(cè)步驟。在ー個(gè)方面，該檢測(cè)步驟包括使檢測(cè)工具例如包含位于靶多核苷酸序列的3’和5’末端之間的靶-識(shí)別部分的分子信標(biāo)雜交。盡管圖1-7通過使用負(fù)義(_)復(fù)合引物說明正義(+)靶多核苷酸序列的擴(kuò)增，但是同樣的步驟可以接著通過使用正義(+)復(fù)合引物來擴(kuò)增負(fù)義(_)靶多核苷酸序列。本發(fā)明的方法也可用于超過一個(gè)靶多核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增和檢測(cè)。圖8提供使用本發(fā)明的方法，針對(duì)多個(gè)RNA靶多核苷酸序列的復(fù)合引物、阻遏序列、RNA/DNA雜交體和檢測(cè)工具的通用序列格式。5. 2試劑盒和擴(kuò)增反應(yīng)混合物本發(fā)明也涉及用于ー個(gè)或多個(gè)靶多核苷酸序列的選擇性擴(kuò)增和任選檢測(cè)的試劑盒，以及包含一個(gè)或多個(gè)靶多核苷酸序列、一種或多種復(fù)合引物和一種或多種擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物的組合物。在某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含對(duì)于每一個(gè)靶多核苷酸序列，至少ー種復(fù)合引物，其包含α)5’啟動(dòng)子部分和(ii)與靶多核苷酸序列3’末端部分互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分；和任選用于確定靶多核苷酸序列的5’末端的工具；和任選檢測(cè)工具。在某些實(shí)施方案中，復(fù)合引物、任選的鑒定工具和任選的檢測(cè)工具置于試劑盒的同一個(gè)容器裝置中。在某些實(shí)施方案中，復(fù)合引物、任選的鑒定工具和任選的檢測(cè)工具置于試劑盒的獨(dú)立容器裝置中。任選地，本發(fā)明的試劑盒還包含說明手冊(cè)，該說明手冊(cè)記載例如各容器裝置中的組分、ー個(gè)或多個(gè)容器裝置的使用順序，等等。在某些實(shí)施方案中，所述組合物包含上述復(fù)合引物和擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物例如柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)或莖-環(huán)結(jié)構(gòu)。柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)包含α)5’單鏈柄，包含啟動(dòng)子部分(P)；( )雙鏈莖，包含至少ー對(duì)彼此雜交的自折疊區(qū)段，其中自折疊區(qū)段中的一個(gè)是靶多核苷酸序列的5’末端部分或其互補(bǔ)序列；和(iii)單鏈環(huán)，包含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列。莖-環(huán)結(jié)構(gòu)與柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)不同，因?yàn)?’單鏈柄在引物延伸之后已變成了雙鏈。6.實(shí)施例下面提供實(shí)施例來舉例說明本發(fā)明的某些方面和實(shí)施方案。相信下面的實(shí)施例能準(zhǔn)確反映出實(shí)際進(jìn)行過的實(shí)驗(yàn)的細(xì)節(jié)，然而，在實(shí)際進(jìn)行過的工作和以下公開的不影響這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)論或技術(shù)人員實(shí)踐它們的能力的實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)之間可能存在有ー些微小的差異是有可能的。技術(shù)人員將會(huì)理解這些實(shí)施例并不是用來把本發(fā)明限制到本文描述的具體實(shí)施方案。另外，本領(lǐng)域技術(shù)人員使用本文描述的技術(shù)、材料和方法能夠容易地想出和優(yōu)化用于實(shí)現(xiàn)這些方法和相關(guān)方法且同時(shí)仍在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)的替代擴(kuò)增系統(tǒng)。6. I實(shí)施例I :用本發(fā)明方法的靶-特異性擴(kuò)增進(jìn)行了下面的實(shí)驗(yàn)以用本發(fā)明的復(fù)合引物評(píng)價(jià)等溫?cái)U(kuò)增。使用本發(fā)明的方法擴(kuò)增了 HCV RNA。6. I. I材料與方法I.寡核苷酸I.復(fù)合引物復(fù)合引物具有以下序列并按10pmol/rxn使用5’ AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGGCA ATTCC GGTGT ACTCA3’ (SEQ ID NO:I)。第1-27位的核苷酸構(gòu)成了 T7啟動(dòng)子序列；下劃線部分是折疊序列；和3’序列的其余部分與HCV RNA部分互補(bǔ)。2.檢測(cè)探針檢測(cè)探針(分子信標(biāo))具有以下序列并按5pmol/rXn使用5’ Fam-CGUUC CGCAG ACCAC UAUGA ACG-Dabcyl 3’ (SEQ ID NO:2)。第5-19位的核苷酸與HCV RNA部分互補(bǔ)并且可以與擴(kuò)增的產(chǎn)物雜交。3.阻遏序列阻遏序列具有以下序列并按2. 5pmol/rxn使用5，AUGGC UAGAC GCUUU CUGCG UGAAG 3，(SEQ ID NO:3)II.試劑I.擴(kuò)增緩沖液“擴(kuò)增緩沖液”包含 26mM Trizma 堿(pH 8. O)、25mM MgCl2,23. 3mM KCl2,3. 33%(v/v)甘油、0. 05mM こ酸鋅、0. 76mM dATP、0. 76mM dCTP、0. 76mM dGTP、0. 76mM dTTP、6. OmMATP,6. 0mMCTP、6. OmM GTP 和 6. OmM UTP，pH 7. 81-8. 0，在 22。C。2.酶混合物“酶混合物”包含 70mM N-こ?；?L-半胱氨酸、10% (v/v) TRITON X_102、16mMHEPESUmM EDTA、20mM Trizma 堿緩沖液、50mM KC12、20%(v/v)甘油、165. 6mM 海藻糖(pH 7和含有 224RTU/μ L 莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus, “MMLV”)反轉(zhuǎn)錄酶和140U/ μ L T7 RNA聚合酶)。III.機(jī)器使用Mx3005P 實(shí)時(shí) PCR 系統(tǒng)(Strategene，La Jolla, Ca)作為檢測(cè)機(jī)器。IV.詳細(xì)方案、
采用以下步驟完成實(shí)驗(yàn)步驟(I):將75“1含有10 11101復(fù)合引物、2.5 11101阻遏寡核苷酸、5 11101檢測(cè)探針和3 μ I含HCV RNA緩沖液的擴(kuò)增緩沖液加入到96孔微量滴定板的各孔中。加入3 μ I無HCV RNA靶的緩沖液作為陰性對(duì)照。該板用一透明密封卡(card)覆蓋。步驟⑵該96孔微量滴定板于60° C孵育0_5分鐘。步驟(3):該96孔微量滴定板于42° C孵育2_5分鐘。步驟⑷將25 μ I的酶混合物加入到各孔中。步驟(5):立即將板置于Μχ3005Ρ 實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)中(在42° C等溫孵育)并每隔I分鐘測(cè)量各孔的熒光。Ct值由監(jiān)測(cè)的熒光信號(hào)來確定，Ct值用作合成的擴(kuò)增子量的指標(biāo)。
6. I. 2 結(jié)果正如可在圖9中看見的，當(dāng)將O. Ipg的HCV RNA轉(zhuǎn)錄物加入到反應(yīng)物時(shí)，Dt值為約26分鐘(參見短劃線加上實(shí)心圓圈一·一)，而在陰性對(duì)照(沒有加入HCV RNA)中沒有觀察到高于背景的可檢測(cè)信號(hào)(參見短劃線加上實(shí)心方塊_ ■ _)。Dt為熒光信號(hào)跨過閾值所需要的時(shí)間(即超過背景水平)。6. 2實(shí)施例2 :本發(fā)明的方法中不同長度的折疊序列的影響以下實(shí)驗(yàn)研究了本發(fā)明的方法中不同長度的折疊序列在復(fù)合引物中的影響。6. 2. I材料與方法復(fù)合引物具有以下序列中的ー個(gè)5’ AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGGCA ATTCC GGTGT ACTCA3，(SEQ ID NO: 1，具有9個(gè)堿基的折疊序列)，5’AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGCCG GCAAT TCCGG TGTAC TCA3’ (SEQ ID NO: 4,具有12個(gè)堿基的折疊序列)，或5’ AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGCGT TAGGC AATTC CGGTGTACTC A3，(SEQ ID NO: 5,具有15個(gè)堿基的折疊序列)。第1-27位的核苷酸構(gòu)成了 T7啟動(dòng)子序列；下劃線部分是折疊序列；和3’序列的其余部分與HCV RNA部分互補(bǔ)。除了毎次反應(yīng)使用IOpg的HCV靶外，檢測(cè)探針、阻遏序列、試劑、機(jī)器和實(shí)驗(yàn)方案基本上與實(shí)施例I中描述的相同。6. 2. 2 結(jié)果如圖10所示，三種不同復(fù)合引物的Dt值是相似的(約12分鐘)。曲線A是包含SEQ ID NO: I的氨基酸序列的復(fù)合引物的Dt值。曲線B是包含SEQ ID N0:4的氨基酸序列的復(fù)合引物的Dt值。曲線C是包含SEQ ID N0:5的氨基酸序列的復(fù)合引物的Dt值。在另ー個(gè)實(shí)驗(yàn)(數(shù)據(jù)未顯示)中，使用了以下具有長折疊序列的復(fù)合引物(參見下文)，但沒有觀察到高于背景的可檢測(cè)信號(hào)5’ AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGCGT TAGTA TGAGG GCAATTCCGG TGTAC TCA 3’ (SEQ ID NO :6,具有22個(gè)堿基的折疊序列，見下劃線部分)。這些結(jié)果表明折疊序列的長度可以影響擴(kuò)增效力。6. 3實(shí)施例3 :使用本發(fā)明的方法對(duì)靶核酸的定量檢測(cè)以下實(shí)驗(yàn)證明了利用HCV RNA轉(zhuǎn)錄物作為例子，本發(fā)明的方法可以用來進(jìn)行靶核酸的定量檢測(cè)。6. 3. I材料與方法復(fù)合引物具有以下序列5’AATTT AATAC GACTC ACTAT AGGGA GACTA GCCATGGCGG GCAAT TCCGG TGTAC TCA3’ (SEQ ID NO: 4,具有12個(gè)堿基的折疊序列，見下劃線部分)。除了本實(shí)施例中毎次反應(yīng)使用IOpg的HCV靶外，檢測(cè)探針、阻遏序列、試劑、機(jī)器和實(shí)驗(yàn)方案基本上與實(shí)施例I中描述的相同。6. 3. 2 結(jié)果如圖11中所示，當(dāng)將10pg、lpg或O. Ipg的HCV RNA轉(zhuǎn)錄物加入到反應(yīng)物時(shí)，Dt值 分別為約14分鐘(參見短劃線加上實(shí)心圓圈一·一)、20分鐘(參見短劃線加上實(shí)心方塊一·一)或28分鐘(參見短劃線加上實(shí)心三角一▲一)，而在陰性對(duì)照(沒有加入HCV RNA)中沒有觀察到高于背景的可檢測(cè)信號(hào)。這些結(jié)果表明本發(fā)明的方法可以用于靶核酸的定量檢測(cè)。7.具體方面/實(shí)施方案、引用的參考文獻(xiàn)本發(fā)明并不限于由本文描述的具體方面和實(shí)施方案限定的范圍。事實(shí)上，根據(jù)以上說明書和附圖，除了本文所述內(nèi)容以外，本發(fā)明的各種修改對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的。這樣的修改都落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。本文中引用了各種參考文獻(xiàn)，包括專利申請(qǐng)、專利和科學(xué)出版物；各類參考文獻(xiàn)的公開內(nèi)容都通過引用其全部結(jié)合到本文中。
權(quán)利要求
1.一種用于選擇性擴(kuò)增靶多核苷酸序列(T)的方法，包括以下步驟 (a)靶多核苷酸序列(+)與第一復(fù)合引物(_)雜交，所述第一復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分(P)和與靶多核苷酸序列3’末端部分互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分； (b)確定靶多核苷酸序列的5’末端部分； (c)延伸第一復(fù)合引物的3’末端并產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第一單鏈DNA模板( _)，所述第一單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)的第一對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第一單鏈DNA模板的5’末端，而所述自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第一單鏈DNA模板的3’末端； (d)第一單鏈DNA模板自折疊并形成第一柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄和含彼此雜交的第一對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖； (e)延伸第一柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和 (f)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)，其包含靶多核苷酸序列⑴。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述靶多核苷酸序列是RNA。
3.權(quán)利要求2的方法，其中步驟(c)包括延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第一RNA/DNA雜交體，和去除第一 RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生第一單鏈DNA模板。
4.權(quán)利要求3的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和其中步驟(b)包括通過酶切緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域來確定靶多核苷酸序列的5’末端。
5.權(quán)利要求3的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和其中步驟(b)包括通過阻遏寡核苷酸(_)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交確定靶多核苷酸序列的5’末端，其中在步驟(c)中，所述阻遏寡核苷酸阻斷第一復(fù)合引物的延伸。
6.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一復(fù)合引物還包含在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分之間，對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列形成所述第一對(duì)自折疊區(qū)段，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟 (g)使單鏈RNA產(chǎn)物(+)與第一復(fù)合引物(_)雜交并延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體； (h)去除第二RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生第一單鏈DNA模板㈠；和 繼續(xù)步驟⑷、(e)和⑴。
7.權(quán)利要求5的方法，其中第一復(fù)合引物的3’靶-識(shí)別部分包含對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列形成所述第一對(duì)自折疊區(qū)段，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟 (g)使單鏈RNA產(chǎn)物(+)與第一復(fù)合引物(_)雜交并延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體； (h)去除第二RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板(-)，所述第二單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)的第ニ對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端； (i)第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄和含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖； U)延伸第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和 (k)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)。
8.權(quán)利要求5的方法，其中所述第一對(duì)自折疊區(qū)段包含對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段及其位于靶多核苷酸序列獨(dú)立部分的互補(bǔ)序列，該方法還包括在步驟(f)之 后的以下步驟 (g)單鏈RNA產(chǎn)物(+)與第一復(fù)合引物(_)雜交并延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體； (h)去除第二RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板(_)，所述第二單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)的第ニ對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端； (i)第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄和含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖； U)延伸第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和 (k)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)。
9.權(quán)利要求3的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和其中步驟(b)包括通過使模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)(-)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交，來確定靶多核苷酸序列的5’末端，其中步驟(c)包括延伸第一復(fù)合引物3’端至模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)的部分。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述第一復(fù)合引物還包含，從5’到3’端，并在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分之間，在靶多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中不存在的通用部分(U)，且模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)包含，從5’到3’端，通用部分(U)和與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域互補(bǔ)的部分，其中所述第一對(duì)自折疊區(qū)段包含通用部分(U)及其互補(bǔ)序列，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟 (g)使單鏈RNA產(chǎn)物(+)與第一復(fù)合引物或第二復(fù)合引物(_)雜交并延伸第二復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體，其中所述第二復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分(P)和通用部分(U)； (h)去除第二RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生第一單鏈DNA模板㈠；和 繼續(xù)步驟⑷、(e)和⑴。
11.權(quán)利要求I的方法，其中所述靶多核苷酸序列是DNA。
12.權(quán)利要求11的方法，在步驟(a)之前，包括一個(gè)變性步驟。
13.權(quán)利要求12的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和其中步驟(b)包括通過酶切緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域來確定靶多核苷酸序列的5’末端。
14.權(quán)利要求12的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和其中步驟(b)包括通過阻遏寡核苷酸(_)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交確定靶多核苷酸序列的5’末端，其中在步驟(c)中，所述阻遏寡核苷酸阻斷第一復(fù)合引物的延伸。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述第一復(fù)合引物還包含，在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分之間，對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列形成所述第一對(duì)自折疊區(qū)段，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟 (g)單鏈RNA產(chǎn)物(+)與第一復(fù)合引物(_)雜交并延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生RNA/DNA雜交體； (h)去除RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生第一單鏈DNA模板㈠；和 繼續(xù)步驟⑷、(e)和⑴。
16.權(quán)利要求14的方法，其中第一復(fù)合引物的3’靶-識(shí)別部分包含對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列形成所述第一對(duì)自折疊區(qū)段，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟 (g)單鏈RNA產(chǎn)物(+)與第一復(fù)合引物(_)雜交并延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生RNA/DNA雜交體； (h)去除RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板(-)，所述第二單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)的第二對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端； (i)第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄和含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖； U)延伸第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和 (k)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述第一對(duì)自折疊區(qū)段包含對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段及其位于靶多核苷酸序列獨(dú)立部分的互補(bǔ)序列，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟 (g)使單鏈RNA產(chǎn)物(+)與第一復(fù)合引物(_)雜交并延伸第一復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生RNA/DNA雜交體； (h)去除RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板(-)，所述第二單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)的第二對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端； (i)第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄和含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖； U)延伸第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和 (k)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)。
18.權(quán)利要求12的方法,其中所述祀多核苷酸序列是在較長的多核苷酸模板內(nèi)，和其中步驟(b)包括通過使模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)(-)與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域雜交，來確定靶多核苷酸序列的5’末端，其中步驟(c)包括延伸第一復(fù)合引物3’端至模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)的部分。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述第一復(fù)合引物還包含，從5’到3’端，并在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶-識(shí)別部分之間，在靶多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中不存在的通用部分(U)，且模板轉(zhuǎn)換寡核苷酸(TSO)包含，從5’到3’端，通用部分(U)和與緊接靶多核苷酸序列的5’末端上游的多核苷酸模板區(qū)域互補(bǔ)的部分，其中所述第一對(duì)自折疊區(qū)段包含通用部分(U)及其互補(bǔ)序列，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟 (g)使單鏈RNA產(chǎn)物(+)與第一復(fù)合引物或第二復(fù)合引物(_)雜交并延伸第二復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體，其中所述第二復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分(P) 和通用部分(U)；(h)去除第二RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生第一單鏈DNA模板㈠；和 繼續(xù)步驟⑷、(e)和⑴。
20.權(quán)利要求I的方法，其中所述第一復(fù)合引物還包含，從5’到3’端，并在啟動(dòng)子部分(P)和3’靶識(shí)別部分之間，在靶多核苷酸序列或其互補(bǔ)序列中不存在的通用部分(U)，和對(duì)應(yīng)于靶多核苷酸序列的5’末端部分的區(qū)段，其中該區(qū)段及其互補(bǔ)序列形成所述第一對(duì)自折疊區(qū)段，該方法還包括在步驟(f)之后的以下步驟 (g)單鏈RNA產(chǎn)物(+)與第一復(fù)合引物或第二復(fù)合引物(_)雜交并延伸第二復(fù)合引物的3’末端以產(chǎn)生第二 RNA/DNA雜交體，其中所述第二復(fù)合引物包含5’啟動(dòng)子部分(P)和通用部分⑶； (h)去除第二RNA/DNA雜交體中的RNA部分以產(chǎn)生包含啟動(dòng)子部分(P)、通用部分(U)和靶多核苷酸序列的互補(bǔ)序列(Tc)的第二單鏈DNA模板㈠，所述第二單鏈DNA模板包含彼此互補(bǔ)并分隔開的第二對(duì)自折疊區(qū)段，其中所述啟動(dòng)子部分(P)是在第二單鏈DNA模板的5’末端，而第二對(duì)自折疊區(qū)段中的一個(gè)是在第二單鏈DNA模板的3’末端； (i)第二單鏈DNA模板自折疊并形成第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分(P)的5’單鏈柄、含彼此雜交的第二對(duì)自折疊區(qū)段的雙鏈莖和含介于第二對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)； U)延伸第二柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)的3’末端以產(chǎn)生包含彼此雜交的啟動(dòng)子部分(P)及其互補(bǔ)序列(Pc)的雙鏈啟動(dòng)子；和 (k)從雙鏈啟動(dòng)子開始啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄以產(chǎn)生多拷貝的單鏈RNA產(chǎn)物(+)。
全文摘要
本申請(qǐng)涉及一種用于選擇性擴(kuò)增一個(gè)或多個(gè)靶核酸或其片段的方法和試劑盒，以及由該方法所獲得的擴(kuò)增反應(yīng)混合物。更具體地講，本申請(qǐng)涉及一種包含5’啟動(dòng)子部分和與靶多核苷酸序列3’末端部分互補(bǔ)的3’靶-識(shí)別部分的復(fù)合引物和一種任選地，用于確定靶多核苷酸序列的5’末端部分的工具。本申請(qǐng)涉及的擴(kuò)增反應(yīng)混合物包含至少一種柄-莖-環(huán)結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)包含含啟動(dòng)子部分的5’單鏈柄和含至少一對(duì)彼此雜交的自折疊區(qū)段的雙鏈莖，和任選地，含介于該對(duì)自折疊區(qū)段之間的序列的單鏈環(huán)。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102725424SQ201180007068
公開日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年1月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月25日
發(fā)明者居金良 申請(qǐng)人:Rd生物科技公司