專利名稱：一種采用戊二醛交聯(lián)固定化修飾脂肪酶Novozyme435的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種采用戊ニ醛交聯(lián)固定化修飾脂肪酶Novozyme 435的方法，以及采用修飾后的脂肪酶Novozyme 435催化外消旋2，2- ニ甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解合成西司他丁關(guān)鍵手性中間體(S)-(+)_2，2-ニ甲基環(huán)丙烷甲酸。
(ニ)
背景技術(shù)：
S-(+)_2，2-ニ甲基環(huán)丙烷甲酸是合成西司他丁的重要手性中間體。西司他丁 (Cilsatatin)化學(xué)名(+) _ (Z) _7_[ QR) - (2_ 氨基 _2_ 羧基乙基)硫]_2_[ (IS) - (2，2-ニ 甲基環(huán)丙烷甲酰胺基)]-2-庚烯酸，是第一個(gè)應(yīng)用于臨床的腎脫氫ニ肽酶抑制劑。西司他丁與碳青霉烯類抗生素亞胺培南(Imipenem)制成的復(fù)合劑泰能 (Tienam)既有極強(qiáng)的廣譜抗菌活性，又具內(nèi)酰胺酶抑制作用，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革蘭氏陰性菌、需氧菌和厭氧菌均有較強(qiáng)的抗菌作用，特別適用于治療多種菌聯(lián)合感染以及需氧菌和厭氧菌的混合感染，是目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗生素和治療未知重癥感染的王牌藥物之一。制備S-(+)_2，2-ニ甲基環(huán)丙烷甲酸的方法主要有化學(xué)法和生物法。王普等采用脂肪酶Novozyme 435 (即大孔吸附樹脂固定化的脂肪酶CAL-B)催化外消旋2，2-ニ甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解合成西司他丁關(guān)鍵手性中間體S-(+)-2，2-ニ甲基環(huán)丙烷甲酸， 可獲得45. 6%的產(chǎn)率，產(chǎn)物光學(xué)純度為99. 2%。脂肪酶Novozyme 435重復(fù)使用4次后，產(chǎn)率下降至25.8%，僅為初次催化產(chǎn)率的56. 5%，ee值為96. 9% (脂肪酶Novozyme 435選擇性催化2，2_ ニ甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯合成S-(+)-2，2-ニ甲基環(huán)丙烷甲酸.催化學(xué)報(bào).2010， 31 (6) =651-655)。由于Novozyme 435為南極假絲酵母脂肪酶B (即脂肪酶CAL-B)經(jīng)大孔吸附樹脂吸附制得的固定化酶，在反應(yīng)過程中會(huì)出現(xiàn)酶分子脫落現(xiàn)象，從而造成酶回收量的減少，影響酶的重復(fù)使用效果，從而影響該生物拆分過程的催化劑成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是進(jìn)ー步提高脂肪酶Novozyme 435 (即大孔吸附樹脂固定化的脂肪酶CAL-B)催化外消旋2，2_ ニ甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解的酶活性和穩(wěn)定性，通過對(duì)脂肪酶Novozyme 435進(jìn)行戊ニ醛交聯(lián)的“酶二次修飾”，提高該酶的穩(wěn)定性，改善其催化活性，提高重復(fù)使用次數(shù)。本發(fā)明采用的技術(shù)方案是一種采用戊ニ醛交聯(lián)固定化修飾脂肪酶Novozyme 435的方法，所述方法包括將脂肪酶Novozyme 435以10g/L 20g/L添加量，加入質(zhì)量濃度0. 5% 10%的戊ニ醛溶液中，在20 50°C、40 MOrpm下進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)15 120min，交聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水充分洗去未反應(yīng)的戊ニ醛，干燥得到戊ニ醛交聯(lián)修飾后的脂肪酶Novozyme 435。所述的脂肪酶 Novozyme 435 購(gòu)自丹麥諾禾ロ諾德公司(Novo Nordisk, Bagsvard, Denmark)。戊ニ醛與酶分子中的氨基結(jié)合，使酶分子固定化，從而提高酶的穩(wěn)定性，但加入過量的戊二醛也會(huì)破壞酶分子的結(jié)構(gòu)，引起酶的失活。因此，在進(jìn)行戊二醛交聯(lián)反應(yīng)時(shí)，需要選取適當(dāng)?shù)奈於舛?，既保證酶的修飾所需，同時(shí)又盡可能減少因過高戊二醛濃度造成的酶分子失活，以提高酶的穩(wěn)定性。所用戊二醛溶液質(zhì)量濃度優(yōu)選為0. 5% 3. 0%。優(yōu)選的，所述交聯(lián)反應(yīng)在30 35 °C、120 MOrpm下進(jìn)行。采用戊二醛交聯(lián)后的脂肪酶Novozyme 435為生物催化劑，以外消旋2，2_ 二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯為底物，于水相反應(yīng)體系中，PH 6. 0 8. 0、20 50°C下進(jìn)行酶催化不對(duì)稱水解反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液經(jīng)分離得到產(chǎn)物(S)-(+)_2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸。該水相反應(yīng)體系通?？梢允莗H 6. 0 8. 0的磷酸鹽緩沖液，即所述的反應(yīng)是將2， 2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯與戊二醛交聯(lián)修飾后的脂肪酶Novozyme 435加入pH值為6. 0 8. 0的磷酸緩沖液中進(jìn)行水解反應(yīng)，通常反應(yīng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為40 240rpm，pH 6. 0 8. 0,20 50°C，反應(yīng)時(shí)間為0 80h，所述的2，2- 二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯的添加量為5g/ L 20g/L磷酸緩沖液，所述的交聯(lián)修飾脂肪酶Novozyme 435添加量為10g/L 20g/L磷酸緩沖液。所述的產(chǎn)物產(chǎn)率和產(chǎn)物e. e.值測(cè)定采用氣相色譜法。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用兩倍體積乙酸乙酯萃取，定容后采用氣相色譜分析。本發(fā)明中所用色譜柱為Chirasil-Dex CB毛細(xì)管柱Q5mmX0· 25mm ；Varian Co.， Palo Alto, CA, USA)。色譜條件為載氣為氮?dú)?；檢測(cè)器為氫火焰離子檢測(cè)器；進(jìn)樣口溫度和檢測(cè)器溫度為250°C ；柱溫為程序升溫80°C保留3min，然后以8°C /min升溫至180°C，保留^iin ；流速為2ml/min ； 分流比為15 1。底物和產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品的氣相色譜圖見

圖1。酶活力的定義為在30°C下，每分鐘催化2，2_ 二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解生成1微克 S-(+)-2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸所需的酶量，為一個(gè)酶活力單位(U)。酶活力用每克脂肪酶 Novozyme 435所含的酶活力單位數(shù)(U/g)表示。生物催化2，2_ 二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解的反應(yīng)過程如下
權(quán)利要求
1.一種采用戊二醛交聯(lián)固定化修飾脂肪酶Novozyme 435的方法，所述方法包括將脂肪酶Novozyme 435以10g/L 20g/L添加量，加入質(zhì)量濃度0. 5% 10%的戊二醛溶液中， 在20°C 50°C、40rpm MOrpm下進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)反應(yīng)15min 120min，反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水充分洗去未反應(yīng)的戊二醛，干燥得到戊二醛交聯(lián)修飾后的脂肪酶NOVOZyme435。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所用戊二醛溶液質(zhì)量濃度為0.5% 3. 0%。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述交聯(lián)反應(yīng)在30°C 35°C、120rpm 240rpm下進(jìn)行。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種采用戊二醛交聯(lián)修飾脂肪酶Novozyme 435的方法，所述方法包括將脂肪酶Novozyme 435以10g/L～20g/L添加量，加入質(zhì)量濃度0.5％～10％的戊二醛溶液中，在20℃～50℃、40rpm～240rpm下進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)15min～120min，反應(yīng)結(jié)束后，用蒸餾水充分洗去未反應(yīng)的戊二醛，干燥得到戊二醛交聯(lián)修飾后的脂肪酶Novozyme 435。本發(fā)明采用戊二醛對(duì)脂肪酶Novozyme 435進(jìn)行化學(xué)交聯(lián)后，得到的二次修飾后脂肪酶Novozyme 435的穩(wěn)定性得到了提高，經(jīng)考察重復(fù)5次用于催化2，2-二甲基環(huán)丙烷甲酸乙酯不對(duì)稱水解的催化性能，經(jīng)二次修飾后的Novozyme 435重復(fù)使用5次后所得產(chǎn)率較未交聯(lián)修飾的脂肪酶Novozyme 435提高了49.3％。
文檔編號(hào)C12N11/08GK102533710SQ20111046047
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者何軍邀, 梁法勇, 王普, 黃金 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)