專利名稱：馬動脈炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于動物病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種馬動脈炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法。
背景技術(shù)：
馬病毒性動脈炎(Equine Viral Ateritis，EVA)是一種由馬病動脈炎病毒 (Equine Ateritis Virus，EAV)引起，在馬屬動物之間通過呼吸道或生殖器官傳播的傳染病。馬匹感染EAV后大部分呈亞臨床感染，一部分成年馬的流感樣癥狀、懷孕母馬發(fā)生流產(chǎn)，新生馬駒發(fā)生間質(zhì)性肺炎。約有30% -60%種公馬感染EAV后持續(xù)帶毒，精液中的病毒可傳播給雌馬，引起EAV的傳播。該病在臨疹上表現(xiàn)為發(fā)熱、白細(xì)胞減少，常伴有眼瞼水腫和四肢浮腫，其特征性病理變化為小動脈內(nèi)膜變性和壞死。本病主要以美洲和歐洲為中心呈世界性分布，以小規(guī)?；蛑械纫?guī)模的流行形式反復(fù)發(fā)生。澳大利亞雖然沒有臨床癥狀發(fā)生，但是通過對保存血清的檢查表明，1975年澳大利亞就有EAV抗體陽性馬。對1989-1992年收集的馬血清檢查結(jié)果表明，南非也有抗體陽性馬。1996年日本發(fā)現(xiàn)EAV抗體陽性的賽馬。1996年我國出口韓國的馬匹中也發(fā)現(xiàn)了 EAV 抗體陽性馬，但至今沒有從馬匹中分離到EAV。近年來，由于賽馬業(yè)的發(fā)展和國外對食用馬的需求，進(jìn)出口馬病的檢測量不斷增加。國內(nèi)外研究者開發(fā)了多項馬病快速檢測診斷方法，如山東檢驗檢疫局馬病實驗室研究的ELISA、PCR檢測馬鼻肺炎和馬動脈炎，固相基因芯片技術(shù)檢測五種馬病等這些方法基本上實現(xiàn)了快速檢測的需要。但是有些病還沒有成熟的檢測技術(shù)及試劑，如錐蟲病、焦蟲病等還需要用進(jìn)口檢測試劑。進(jìn)口試劑和試劑盒特別昂貴，且使用時必須提前2個月左右定貨， 會嚴(yán)重影響檢測進(jìn)程。此外，現(xiàn)有的快速檢測方法中，ELISA、PCR等技術(shù)通量小，費時費力； 固相芯片技術(shù)可以實現(xiàn)高通量檢測，但成本特別昂貴，無法在馬病檢測中應(yīng)用。迫切需要一種高通量、低成本、快速特異、靈敏可靠檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供馬動脈炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法，即一種操作簡單、結(jié)果準(zhǔn)確的馬動脈炎病毒液相芯片檢測方法，及其所用到的引物，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足。本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的，采用液相芯片技術(shù)。該技術(shù)是在核酸水平上的一種檢測技術(shù)，具有準(zhǔn)確性好、靈敏度高的特點。其原理是將編碼微球單個逐一通過檢測通道時受到雙色激光(如紅色和綠色)同時照射，第一束激光激發(fā)微球的分類熒光，根據(jù)熒光編碼確定微球的類別，即微球內(nèi)部的兩種熒光物質(zhì)受激發(fā)后可發(fā)射兩種不同波長的熒光，不同類別微球內(nèi)這兩種熒光物質(zhì)比例不同，則熒光強(qiáng)度比例也不同，從而將不同的特異性反應(yīng)區(qū)分開來；第二束激光激發(fā)報告分子上的熒光素，根據(jù)熒光強(qiáng)度確定微球上結(jié)合的報告分子的數(shù)量從而確定目標(biāo)分子的數(shù)量(定量)。系統(tǒng)只記錄與紅色熒光同時出現(xiàn)的綠色熒光信號，
3不記錄未結(jié)合的報告分子熒光信號，因此檢測前無需洗脫未結(jié)合的報告分子。此外，利用流式細(xì)胞術(shù)中90°C角散射光可有效地消除微球聚集對結(jié)果造成的影響。各種熒光信號經(jīng)分析軟件進(jìn)行數(shù)字化處理，可獲得檢測物的種類和數(shù)量。本發(fā)明中所涉及到的引物和探針序列如下正向引物dirct primer :5-CAACGGGTACACCGCAGTTGGT-3~ SEQ ID NO :1反向引物reverse pr imer :5-CGGACCCGCATCTGACCAAACA_3~ SEQ ID NO :2探針Probe :5~-CGGCGGCGACAGCCTACA-3~ SEQ ID NO :3。正向引物和反向引物5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；探針的5’端進(jìn)行氨基化修飾。本發(fā)明的引物和探針用于檢測馬動脈炎病毒，其檢測方法包括有1)檢測樣品 RNA的提取、2) RT-PCR擴(kuò)增目的片段、3)寡核苷酸探針與微球共價偶聯(lián)、4)探針與RT-PCR 擴(kuò)增片段雜交和幻液相芯片儀分析步驟。其中步驟^RT-PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為第一階段，反轉(zhuǎn)錄50°C :30min ；第二階段，預(yù)變性94°C :3min ；第三階段，擴(kuò)增94°C :30s, 59°C :30s, 72°C :30s，30 個循環(huán)；第四階段，延伸72°C :5min。本發(fā)明的檢測方法能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速檢測，從樣品處理到出結(jié)果僅需4小時左右；由于采用了接近生物反應(yīng)體系的液相芯片系統(tǒng)和特異性的探針，使該方法可與熒光定量PCR相媲美。本發(fā)明設(shè)計的引物與常見馬屬動物其他病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，由于采用了液相反應(yīng)體系，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)檢測方法，大大杜絕了非特異性擴(kuò)增造成的假陰性結(jié)果。本發(fā)明的方法提供了優(yōu)化的操作程序，操作簡單，具有良好重復(fù)性。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)描述。本發(fā)明所用到的儀器耗材信息如下表面羧基化的熒光編碼微球、鞘液購置于BD 公司，TMAC temtrameihyl-ammdnium chloride、Tris、SD S(10% sol μ tion)購置于美國 Sigma 公司，SPAE Str印tavidin-R-phycoerythrin 購于美國 Prozyme 公司，RNA 提取試劑盒、RT-PCR試劑盒購于大連寶生物公司。主要設(shè)備包括BD FACSArray液相芯片儀、梯度 PCR擴(kuò)增儀、凝膠成像系統(tǒng)、Sigma高速冷凍離心機(jī)等。通過hternet登陸美國國立生物信息技術(shù)中心(NCBI)，查詢檢索已公布的馬動脈炎病毒基因序列。利用I^rimer Premierf.O軟件設(shè)計引物和探針，并最終篩選出一對具有高特異性的引物和探針，參見表1。表1設(shè)計的引物和預(yù)期目的片段大小
引物和探針序列ι增片段大小Primerl5’-biotm-CAACGGGTACACCGCAGTTGGT-3、145bpPrimer25’-biotin-CGGACCCGCATCTGACCAAACA-3’ProbeNH2-CGGCGGCGAC AGCCT AC A-3、
注5’ -Biotin表示5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；5、-NH2表示5’端進(jìn)行氨基化修飾。本發(fā)明的檢測方法如下1、檢測樣品RNA的提取采用大連寶生物公司的RNA提取試劑盒提取樣品RNA，按照說明書的步驟進(jìn)行操作，提取的樣品電泳檢測提取質(zhì)量。2、RT-PCR擴(kuò)增目的片段采用RNA提取試劑盒(大連寶生物公司)進(jìn)行EAV RNA的提取。在0. 2mLPCR反應(yīng)管中，依次加入 10 X RT-PCR by ffer，2. 5μ L、、dNTP (各 2. 5mmol/L)，2· 0 μ L、IOpmol/μ L 引物對，各 1 μ L、Inhibiter 0· 5 μ L、AMV XL 0· 5 μ L、AMV Taq (5M/μ L)，0· 25μ L、25mmol/ L MgCl2, 5. 0 μ L、RNA模板5. 0 μ L，加入雙蒸水7. 25 μ L使反應(yīng)體積達(dá)到25 μ L。在PCR儀 (Eppendorf Mastercycler Gradient)上進(jìn)行 RT-PCR 擴(kuò)增。優(yōu)化并確定 RT-PCR 工作程序 500C 30min ；94°C 2min ；然后 94°C 30sec、59°C 30sec、72°C 30sec,30 個循環(huán)；最后 72°C延伸5min，4°C保溫。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳，在紫外凝膠圖像分析系統(tǒng)(Alphamager 2200) 上觀察、分析擴(kuò)增產(chǎn)物。3、寡核苷酸探針與微球共價偶聯(lián)1)將微球漩渦混合20s充分分散；取3 X IO6個微球(75 μ 1)，于1. 5ml離心管中 IOOOOg離心lmin，去上清；2)加入50 μ 1 0. lmol/L甲基咪唑溶液(ph4. 5)，漩渦混合，超聲波處理 (30s_imin)；3)加入氨基化探針1. Onmol,漩渦混合；4)加入2. 5 μ L碳二亞胺溶液(IOmg的碳二亞胺粉末加入1. OmL的滅菌純水，現(xiàn)用現(xiàn)配)充分混勻，室溫避光孵育30min。5)重復(fù) 4) 一次。6)加入 1. Oml 0. 02% Tween-20，混勻，IOOOOg 離心 lmin，棄上清；7)加入 1. Oml 0. 1% SDS，混勻，IOOOOg 離心 lmin，棄上清；8) 0. lmol/L甲基咪唑溶液(ph4. 5) 100 μ L重懸微球，2_8°C避光保存待用。4、探針與RT-PCR擴(kuò)增片段雜交雜交體系包換1.5yL探針偶聯(lián)微球，33yL 1. 5 X TMAC雜交液，14. 5 μ LTE， 2. 5yL RT-PCR產(chǎn)物?；旌暇鶆蚝笥?8°C變性lOmin，在選定溫度下孵育15min，18000g離心aiiin去上清；加入50μ L用IXTMAC雜交液稀釋的PE標(biāo)記的鏈親合素(1 500)，選定溫度下孵育lOmin，18000g離心^iin去上清；加入50 μ L IX TMAC雜交液，漩渦混合使微球重懸，上BD FACSArray液相芯片儀對雜交后的微球進(jìn)行分析。雜交溫度的優(yōu)化，雜交反應(yīng)時間在15min條件下，根據(jù)探針的Tm值，選48°C、50°C、 52°C、54°C、56°C等5個溫度梯度為研究對象，考察不同雜交溫度下液相芯片的檢測效果。5、液相芯片儀分析步驟利用BD FACSArray液相芯片儀對雜交微球進(jìn)行分析，參與計數(shù)的熒光編碼微球均 ^ 100個，表明用于計數(shù)的熒光編碼微球數(shù)量有效，所產(chǎn)生的MFI值可信，各個熒光編碼微球的空白對照MFI均< 500，表明結(jié)果有效，試驗可以進(jìn)行結(jié)果判定。
液相芯片定性比值結(jié)果(LQRR)等于樣品校正后的MFI值(MFIS)與空白對照 MFI平均值(MFIB)的比值，即LQRR = MFIS/MFIB。如果LQRR彡3，判定為陽性樣本；如果 2彡LQRR < 3，則判定為可疑；如果LQRR < 2，則判定為陰性。實施例1本發(fā)明的馬動脈炎病毒液相芯片引物探針和檢測方法的特異性分析1、材料為馬動脈炎病毒(EAV)、馬鼻肺炎病毒(EHV)、馬流感病毒H3N8亞型、馬流感病毒H7N7亞型和馬焦蟲；其中馬動脈炎病毒作為陽性檢測樣品。2、馬動脈炎病毒液相芯片檢測方法的特異性試驗利用本研究建立的液相芯片檢測馬動脈炎病毒的方法，提取馬動脈炎病毒、馬鼻肺炎病毒、馬流感病毒H3N8亞型、馬流感病毒H7N7亞型和馬焦蟲等的RNA或DNA，并進(jìn)行擴(kuò)增。將RT-PCR產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物，用液相芯片檢測體系進(jìn)行檢測。判斷整個液相芯片檢測體系對非目標(biāo)物有無檢測信號。3、結(jié)果分別以馬動脈炎病毒(EAV)、馬鼻肺炎病毒(EHV)、馬流感病毒H3N8亞型(H3N8)、 馬流感病毒H7N7亞型(H7N7)和馬焦蟲等的RT-PCR產(chǎn)物或PCR產(chǎn)物模板，進(jìn)行液相芯片檢測。結(jié)果(見表2)表明，對陽性樣品馬動脈炎病毒EAV的檢測結(jié)果為陽性，而對非目標(biāo)物擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測值均為陰性，表明本發(fā)明的引物和探針在檢測的時候不會產(chǎn)生假陽性或假陰性。表2液相芯片檢測體系特異性驗證
權(quán)利要求
1.一種馬動脈炎病毒的液相芯片檢測的引物和探針，其特征在于，引物和探針的核酸序列如下正向引物=SEQ ID NO 1 反向引物Γ SEQ ID NO 2 探針 Γ SEQ ID NO :3ο
2.如權(quán)利要求1所述的引物和探針，其特征在于所述的正向引物和反向引物5’端進(jìn)行生物素標(biāo)記；探針的5’端進(jìn)行氨基化修飾。
3.一種液相芯片檢測馬動脈炎病毒的方法，其特征在于，是用權(quán)利要求2所述的引物和探針進(jìn)行檢測。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于包括有1)檢測樣品RNA的提取、2)RT-PCR擴(kuò)增目的片段、幻寡核苷酸探針與微球共價偶聯(lián)、4)探針與RT-PCR擴(kuò)增片段雜交和幻液相芯片儀分析步驟。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的步驟2)RT-PCR反應(yīng)的循環(huán)條件為 第一階段，反轉(zhuǎn)錄50°C :30min ；第二階段，預(yù)變性94°C :3min ；第三階段，擴(kuò)增 94°C :30s, 59°C :30s，72°C :30s，30 個循環(huán)； 第四階段，延伸720C :5min0
全文摘要
本發(fā)明涉及一種馬動脈炎病毒的液相芯片檢測引物及檢測方法，本發(fā)明的檢測方法能夠?qū)悠愤M(jìn)行快速檢測，從樣品處理到出結(jié)果僅需4小時左右；由于采用了接近生物反應(yīng)體系的液相芯片系統(tǒng)和特異性的探針，使該方法可與熒光定量PCR相媲美。本發(fā)明設(shè)計的引物與常見馬屬動物其他病毒不發(fā)生交叉反應(yīng)，由于采用了液相反應(yīng)體系，使該方法的特異性高于傳統(tǒng)檢測方法，大大杜絕了非特異性擴(kuò)增造成的假陰性結(jié)果。本發(fā)明的方法提供了優(yōu)化的操作程序，操作簡單，具有良好重復(fù)性。
文檔編號C12N15/11GK102424865SQ20111042698
公開日2012年4月25日 申請日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者岳志芹, 徐彪, 朱來華, 梁成珠, 王群, 肖西志, 趙玉然, 鄧明俊, 鄭小龍 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術(shù)中心