專利名稱：一種膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型及其建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供的一種適應(yīng)于谷物籽粒、鋅強(qiáng)化劑和動(dòng)物性食物中鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型，同時(shí)還涉及一種該模型的建立方法。
背景技術(shù)：
膳食多樣性、食品鋅強(qiáng)化、補(bǔ)充鋅強(qiáng)化劑是解決人體鋅缺乏的重要途徑。但近些年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，世界范圍內(nèi)仍有較大比例，尤其是兒童缺鋅更為嚴(yán)重。我國2008年的調(diào)查表明，兒童頭發(fā)鋅低于正常者下限者仍高達(dá)60%，這一結(jié)果提醒我們應(yīng)更多的關(guān)注膳食中鋅對(duì)人體的實(shí)際生物有效性。由于涉及倫理道德和人體生命安全， 采用人體實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)膳食中鋅生物有效性受到了限制。近年來，細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和相關(guān)生物技術(shù)的發(fā)展，使得用細(xì)胞模型評(píng)價(jià)鋅對(duì)人體的生物有效性提供了保障。目前，鋅生物有效性有的采用細(xì)胞內(nèi)鋅含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。由于這種模型缺乏鋅向體內(nèi)器官的轉(zhuǎn)運(yùn)和蓄積過程評(píng)價(jià)，從而與鋅在人體內(nèi)的吸收過程存在差異，并導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果與鋅實(shí)際生物有效性間存在差異。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供的一種膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型。本發(fā)明的目的還在于提供一種該膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型的建立方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型，包括模型結(jié)構(gòu)、細(xì)胞種類和評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中，評(píng)價(jià)指標(biāo)為Caco-2細(xì)胞內(nèi)鋅含量，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)鋅量和內(nèi)臟上皮細(xì)胞內(nèi)鋅含量。所述的模型結(jié)構(gòu)為在培養(yǎng)板底部設(shè)置有插入槽，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)位置為插入槽底膜上，模型結(jié)構(gòu)具備頂側(cè)室(腸腔側(cè))和基底側(cè)室(血漿側(cè))。所述的細(xì)胞種類包括Caco-2細(xì)胞，內(nèi)臟上皮細(xì)胞。所述的內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)板的基底側(cè)。所述的內(nèi)臟上皮細(xì)胞為原代培養(yǎng)的或繼代培養(yǎng)的肝臟、腎臟上皮樣生長的細(xì)胞。進(jìn)一步地，本發(fā)明的技術(shù)方案還采用了一種膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型的建立方法，包括以下步驟(I) Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)；(2)內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)；(3)模型建立當(dāng)步驟(I)和步驟(2)的細(xì)胞均達(dá)到試驗(yàn)要求的極性狀態(tài)和結(jié)構(gòu)形態(tài)后，將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有內(nèi)臟上皮細(xì)胞的六孔板中，聯(lián)合培養(yǎng)24h ；(4)鋅生物有效性試驗(yàn)將被評(píng)價(jià)食物樣品采用傳統(tǒng)的消化系統(tǒng)進(jìn)行模擬消化，離心，獲取上清液，將上清液與MEM液混合制成鋅吸收試驗(yàn)液。同時(shí)做不含鋅的對(duì)照組試驗(yàn)液。吸取I. 5mL鋅吸收試驗(yàn)液滴入聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)在內(nèi)臟上皮細(xì)胞層加入等滲的MEM孵育液，于37°C,55轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)器中孵育2h ；
(5)指標(biāo)測定分別收取Caco-2細(xì)胞、內(nèi)臟上皮細(xì)胞、基底側(cè)孵育液，用ICP-MS技術(shù)檢測Caco_2細(xì)胞內(nèi)鋅含量、內(nèi)臟上皮細(xì)胞內(nèi)鋅含量和基底側(cè)孵育液中鋅含量。用內(nèi)臟上皮細(xì)胞內(nèi)鋅含量評(píng)價(jià)鋅在內(nèi)臟器官中的利用；用內(nèi)臟上皮細(xì)胞內(nèi)鋅含量與基底側(cè)孵育液中鋅含量之和評(píng)價(jià)鋅在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量；用Caco-2細(xì)胞內(nèi)鋅含量、內(nèi)臟上皮細(xì)胞內(nèi)鋅含量、基底側(cè)孵育液中鋅含量之和評(píng)價(jià)膳食鋅對(duì)人體的總吸收效率。步驟(I)所述的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)為將插入槽放入六孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞密度為3 X IO5的Caco-2細(xì)胞混合液I. 5mL滴入插入槽的底 膜上，同時(shí)，在基底側(cè)加入2mL含胎牛血清10%的DMEM培養(yǎng)液。步驟(2)所述的內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)為將內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)于另一塊六孔板的基底側(cè)，并根據(jù)細(xì)胞生長特性，考慮與Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行調(diào)整(可適當(dāng)提前、延后或同時(shí)培養(yǎng))；若選用原代細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)以原代細(xì)胞培養(yǎng)為主，當(dāng)原代細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后，再結(jié)合Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)。本發(fā)明的模型能夠準(zhǔn)確、高效和全面的模擬鋅在人體的吸收利用過程，為膳食中鋅生物有效性的評(píng)價(jià)提供更合理和正確的方法；模型結(jié)構(gòu)上與人體腸道吸收結(jié)構(gòu)相似；本發(fā)明提供的模型即可評(píng)價(jià)膳食鋅在腸道的吸收效率，又可評(píng)價(jià)鋅在體內(nèi)的利用效率；評(píng)價(jià)結(jié)果與鋅實(shí)際生物有效性更接近。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I水稻籽粒鋅對(duì)人體的生物有效性評(píng)價(jià)方法(I) Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)將插入槽放入六孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞密度為3 X IO5的Caco-2細(xì)胞混合液I. 5mL滴入插入槽的底膜上，同時(shí)，在基底側(cè)加入2mL含胎牛血清10%的DMEM培養(yǎng)液；(2) 293T 細(xì)胞培養(yǎng)將人腎胚T (293T)細(xì)胞培養(yǎng)于另一塊六孔板的基底側(cè)，培養(yǎng)液與Caco-2細(xì)胞所用培養(yǎng)液相同；(3)模型建立將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有293T細(xì)胞的六孔板中，聯(lián)合培養(yǎng)24h ；(4)鋅生物有效性試驗(yàn)將水稻籽粒蒸熟，磨碎，采用傳統(tǒng)的消化系統(tǒng)進(jìn)行模擬消化，離心，獲取上清液，將上清液與MEM液混合制成鋅吸收試驗(yàn)液；同時(shí)用等滲的MEM液作對(duì)照組。吸取I. 5mL鋅吸收試驗(yàn)液和對(duì)照組溶液分別滴入聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)在293T細(xì)胞層加入等滲的MEM孵育液，于37°C，55轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)器中孵育2h ；(5)指標(biāo)測定分別收取Caco-2細(xì)胞、293T細(xì)胞、基底側(cè)孵育液，用ICP-MS技術(shù)檢測Caco-2細(xì)胞內(nèi)鋅含量、293T細(xì)胞內(nèi)鋅含量和基底側(cè)孵育液中鋅含量。用293T細(xì)胞內(nèi)鋅含量評(píng)價(jià)稻米籽粒鋅在腎臟器官中的利用；用293T細(xì)胞內(nèi)鋅含量與基底側(cè)孵育液中鋅含量之和評(píng)價(jià)鋅在體內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)量；用Caco-2細(xì)胞內(nèi)鋅含量、293T細(xì)胞內(nèi)鋅含量、基底側(cè)孵育液中鋅含量之和評(píng)價(jià)稻米籽粒鋅對(duì)人體的總生物有效性。
實(shí)施例2硫酸鋅和甘氨酸鋅中鋅生物有效性評(píng)價(jià)方法(I) Caco-2 細(xì)胞培養(yǎng)將插入槽放入六孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞密度為3 X IO5的Caco-2細(xì)胞混合液I. 5mL滴入插入槽的底膜上，同時(shí)，在基底側(cè)加入2mL含胎牛血清10%的DMEM培養(yǎng)液；⑵293T細(xì)胞培養(yǎng)將人腎胚T (293T)細(xì)胞培養(yǎng)于另一塊六孔板的基底側(cè)，培養(yǎng)液與Caco-2細(xì)胞所用培養(yǎng)液相同； (3)模型建立將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有293T細(xì)胞的六孔板中，聯(lián)合培養(yǎng)24h ；(4)鋅生物有效性試驗(yàn)將硫酸鋅和甘氨酸鋅分別溶解于去離子水中，采用傳統(tǒng)的消化系統(tǒng)進(jìn)行模擬消化，離心，獲取上清液，將上清液與MEM液混合制成鋅吸收試驗(yàn)液。吸取I. 5mL鋅吸收試驗(yàn)液滴入聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)在293T細(xì)胞層加入等滲的MEM孵育液，于37°C, 55轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)器中孵育2h。同時(shí)做空白試驗(yàn)組；(5)指標(biāo)測定分別收取Caco-2細(xì)胞、293T細(xì)胞、基底側(cè)孵育液，用ICP-MS技術(shù)檢測Caco-2細(xì)胞內(nèi)鋅含量、293T細(xì)胞內(nèi)鋅含量和基底側(cè)孵育液中鋅含量。比較硫酸鋅組和甘氨酸鋅組293T細(xì)胞鋅含量，以評(píng)價(jià)不同鋅化合物在人腎臟的利用；比較硫酸鋅組和甘氨酸鋅組293T細(xì)胞內(nèi)鋅含量和基底側(cè)孵育液中鋅含量，評(píng)價(jià)鋅化合物向體內(nèi)的總轉(zhuǎn)運(yùn)量；比較硫酸鋅組和甘氨酸鋅組Caco-2細(xì)胞內(nèi)鋅含量、293T細(xì)胞內(nèi)鋅含量、基底側(cè)孵育液中鋅含量總的差異。評(píng)價(jià)不同鋅化合物在腸道的總吸收效率。
權(quán)利要求
1.一種膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型，其特征在于包括模型結(jié)構(gòu)、細(xì)胞種類和評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中，評(píng)價(jià)指標(biāo)為Caco-2細(xì)胞內(nèi)鋅含量,細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)鋅量和內(nèi)臟上皮細(xì)胞內(nèi)鋅含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型，其特征在于所述的模型結(jié)構(gòu)為在培養(yǎng)板底部設(shè)置有插入槽，Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)位置為插入槽底膜上，模型結(jié)構(gòu)具備頂側(cè)室(腸腔側(cè))和基底側(cè)室(血漿側(cè))。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型，其特征在于所述的細(xì)胞種類包括Caco-2細(xì)胞，內(nèi)臟上皮細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型，其特征在于所述的內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)于培養(yǎng)板的基底側(cè)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型，其特征在于所述的內(nèi)臟上皮細(xì)胞為原代培養(yǎng)的或繼代培養(yǎng)的肝臟、腎臟上皮樣生長的細(xì)胞。
6.一種膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型的建立方法，其特征在于包括以下步驟 (1)Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)； (2)內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)； (3)模型建立將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有內(nèi)臟上皮細(xì)胞的六孔板中，聯(lián)合培養(yǎng)24h ； (4)鋅生物有效性試驗(yàn) 將被評(píng)價(jià)食物樣品采用傳統(tǒng)的消化系統(tǒng)進(jìn)行模擬消化，離心，獲取上清液，將上清液與MEM液混合制成鋅吸收試驗(yàn)液。同時(shí)做不含鋅的對(duì)照組試驗(yàn)液。吸取1.5mL鋅吸收試驗(yàn)液滴入聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)在內(nèi)臟上皮細(xì)胞層加入等滲的MEM孵育液，于37 0C，55轉(zhuǎn)/min培養(yǎng)器中孵育2h ； (5)指標(biāo)測定 分別收取Caco-2細(xì)胞、內(nèi)臟上皮細(xì)胞、基底側(cè)孵育液，用ICP-MS技術(shù)檢測Caco-2細(xì)胞內(nèi)鋅含量、內(nèi)臟上皮細(xì)胞內(nèi)鋅含量和基底側(cè)孵育液中鋅含量。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型的建立方法，其特征在于步驟(1)所述的Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)為將插入槽放入六孔培養(yǎng)板中。將細(xì)胞密度為3X IO5的Caco_2細(xì)胞混合液I. 5mL滴入插入槽的底膜上，同時(shí)，在基底側(cè)加入2mL含胎牛血清10%的DMEM培養(yǎng)液。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型的建立方法，其特征在于步驟(2)所述的內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)為將內(nèi)臟上皮細(xì)胞培養(yǎng)于另一塊六孔板的基底側(cè)，并根據(jù)細(xì)胞生長特性，考慮與Caco-2細(xì)胞在培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行調(diào)整，可適當(dāng)提前、延后或同時(shí)培養(yǎng)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型的建立方法，其特征在于若內(nèi)臟上皮細(xì)胞為原代細(xì)胞時(shí)，應(yīng)以原代細(xì)胞培養(yǎng)為主，當(dāng)原代細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定后，再結(jié)合Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種膳食鋅生物有效性的評(píng)價(jià)模型及其建立方法，該模型包括模型結(jié)構(gòu)、細(xì)胞種類和評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中，評(píng)價(jià)指標(biāo)為Caco-2細(xì)胞內(nèi)鋅含量，細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)鋅量和內(nèi)臟上皮細(xì)胞內(nèi)鋅含量。本發(fā)明的模型能夠準(zhǔn)確、高效和全面的模擬鋅在人體的吸收利用過程，為膳食中鋅生物有效性的評(píng)價(jià)提供更合理和正確的方法；模型結(jié)構(gòu)上與人體腸道吸收結(jié)構(gòu)相似；本發(fā)明提供的模型即可評(píng)價(jià)膳食鋅在腸道的吸收效率，又可評(píng)價(jià)鋅在體內(nèi)的利用效率；評(píng)價(jià)結(jié)果與鋅實(shí)際生物有效性更接近。
文檔編號(hào)C12M1/00GK102676369SQ20111042714
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者何萬領(lǐng), 曹平華, 李元曉, 李旺, 李曉麗, 鄧凱偉 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)