一種平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法，具體為：凍傷前，先用剪毛法剪去兔雙耳自耳尖向耳根方向70－80mm區(qū)域內(nèi)的毛，并在該剪毛分界處用筆涂一直線作為浸凍邊界線，然后將兔雙耳的耳尖至浸凍邊界線之間的區(qū)域同時浸入溫度-24.5±2℃、濃度90－95%的乙醇中，待兩耳凍結(jié)開始計(jì)時，65±5s后取出，拭干后在空氣中自然復(fù)溫，造成兔耳凍傷模型。經(jīng)試驗(yàn)論證：該兔耳凍傷模型制作方法可行，指標(biāo)選擇科學(xué)，技術(shù)先進(jìn)，有利于平原凍傷的發(fā)病機(jī)理研究和創(chuàng)新藥物的研發(fā)與評價。
【專利說明】一種平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于凍傷模型制作【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法。

【背景技術(shù)】
[0002]生物醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)展常常依賴于使用動物模型作為實(shí)驗(yàn)假說和臨床假說二者的試驗(yàn)基礎(chǔ)。人類各種疾病的發(fā)生發(fā)展是十分復(fù)雜的，要深入探討其疾病的發(fā)病機(jī)理及療效機(jī)理不能也不應(yīng)該在病人身上進(jìn)行?？梢酝ㄟ^對動物各種疾病和生命現(xiàn)象的研究，進(jìn)而推用到人類，探索人類生命的奧秘，以控制人類的疾病和衰老，延長人類壽命。
[0003]人類疾病的動物模型(Animal Model of Human Diseases)是生物醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中所建立的具有人類疾病模擬性表現(xiàn)的動物實(shí)驗(yàn)對象和材料。使用動物模型是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)研究中的一個極為重要的實(shí)驗(yàn)方法和手段，有助于更方便、更有效地認(rèn)識人類疾病的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和創(chuàng)新藥物的研發(fā)與評價。
[0004]凍傷是由于寒冷潮濕作用引起的人體局部或全身損傷。輕時可造成皮膚一過性損傷，要及時救治；重時可致永久性功能障礙，嚴(yán)重的可危及生命，需緊急搶救。而凍傷的臨床發(fā)病機(jī)制是當(dāng)身體較長時間處于低溫和潮濕刺激時，就會使體表的血管發(fā)生痙攣，血液流量因此減少，造成組織缺血缺氧，細(xì)胞受到損傷，尤其是肢體遠(yuǎn)端血液循環(huán)較差的部位。目前有關(guān)平原兔耳凍傷模型的制作，主要依據(jù)中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部《軍隊(duì)特需藥品研發(fā)勤務(wù)技術(shù)指導(dǎo)原則(內(nèi)部資料)》第10章，10.1項(xiàng)“寒冷環(huán)境因素對人體損傷防治藥物”的記載，但造模技術(shù)落后，造模條件可控性差，缺乏實(shí)用性和可行性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為克服現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明目的在于提供一種平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法，該方法造模可控性強(qiáng)，操作實(shí)用方便。
[0006]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取如下技術(shù)方案:
一種平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法，該方法為:凍傷前，先用剪毛法剪去兔雙耳自耳尖向耳根方向70 - 80mm區(qū)域內(nèi)的毛，并在該剪毛分界處用筆涂一直線作為浸凍邊界線，然后將兔雙耳的耳尖至浸凍邊界線之間的區(qū)域同時浸入溫度_24.5±2°C、濃度90 -95%的乙醇中，待兩耳凍結(jié)(即變白、變硬)開始計(jì)時，65±5s后取出，拭干后在空氣中自然復(fù)溫，造成兔耳凍傷模型。
[0007]較好的，凍傷前，先用剪毛法剪去兔雙耳自耳尖向耳根方向70 - 80mm區(qū)域內(nèi)的毛，其中于50±5mm處留I?2mm寬的毛不剪。在50±5mm處預(yù)留I?2mm寬的毛不剪，這樣當(dāng)兔耳浸入乙醇中冷凍時，便于觀察浸凍邊界。用筆涂的直線，浸凍時間長了，有時容易被乙醇溶解掉。
[0008]剪毛法采用本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)即可，如:固定動物，先用蘸有水的紗布把被毛浸濕，再用剪毛剪刀緊貼皮膚剪去被毛。不可用手提起被毛，以免剪破皮膚，剪下的毛應(yīng)集中放在一容器內(nèi)，防止飛揚(yáng)。
[0009]本發(fā)明針對平原條件下凍傷疾病的相應(yīng)臨床指標(biāo)，建立了一種新型平原兔耳凍傷模型的制作方法以及相應(yīng)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化檢測及病理評價技術(shù)，為開展平原凍傷的發(fā)病機(jī)理研究和創(chuàng)新藥物的研發(fā)與評價提供了有力的技術(shù)支撐。
[0010]【專利附圖】

【附圖說明】:
圖1為凍傷模型對照組兔耳凍后第3d的圖片；圖中，A為給基質(zhì)耳背側(cè)面，B為給基質(zhì)耳腹側(cè)面，C為模型對照耳背側(cè)面，D為模型對照耳腹側(cè)面；
圖2為凍傷模型對照組兔耳凍后第5d的圖片；圖中，E為給基質(zhì)耳背側(cè)面，F(xiàn)為模型對照耳背側(cè)面，G中為模型對照耳(左)、基質(zhì)耳(右)的腹側(cè)面；
圖3為凍傷模型對照組兔耳凍后第12d的圖片；圖中，H為給基質(zhì)耳背側(cè)面，I為給基質(zhì)耳腹側(cè)面，J為模型對照耳背側(cè)面，K為模型對照耳腹側(cè)面；
圖4為陽性對照藥治療組兔耳凍后第3d的圖片；圖中，L為給藥耳背側(cè)面，M為模型對照耳背側(cè)面，N中為模型對照耳(左)、給藥耳(右)的腹側(cè)面；
圖5為陽性對照藥治療組兔耳凍后第5d的圖片；圖中，O為給藥耳背側(cè)面，P為模型對照耳背側(cè)面，Q中為模型對照耳(左)、給藥耳(右)的腹側(cè)面；
圖6為陽性對照藥治療組兔耳凍后第12d的圖片；圖中，R為給藥耳背側(cè)面，S為給藥耳腹側(cè)面，T為模型對照耳背側(cè)面，U為模型對照耳腹側(cè)面；
圖7為不同組兔耳凍傷病理組織學(xué)的變化(X 100，HE染色)，圖中，U為陰性對照組，V為凍傷模型對照組，W為陽性對照藥治療組。
[0011]【具體實(shí)施方式】:
以下通過具體實(shí)施例來說明本發(fā)明技術(shù)方案，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。
[0012]實(shí)施例1
一種平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法，該方法為:凍傷前，先用剪毛法剪去兔雙耳自耳尖向耳根方向70mm區(qū)域內(nèi)的毛,其中于45mm處留I?2mm寬的毛不剪,并在該剪毛分界處用無刺激軟頭記號筆涂一直線作為浸凍邊界線，然后將兔雙耳的耳尖至浸凍邊界線之間的區(qū)域同時浸入溫度-22.5°C、濃度95v%的乙醇中(乙醇置于DFY-5L/40型低溫恒溫反應(yīng)浴冷凍槽內(nèi))，待兩耳凍結(jié)(即變白、變硬)開始計(jì)時，60s后取出，拭干后在空氣中自然復(fù)溫，造成兔耳凍傷模型。
[0013]實(shí)施例2
一種平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法，該方法為:凍傷前，先用剪毛法剪去兔雙耳自耳尖向耳根方向80mm區(qū)域內(nèi)的毛,其中于55mm處留I?2mm寬的毛不剪,并在該剪毛分界處用無刺激軟頭記號筆涂一直線作為浸凍邊界線，然后將兔雙耳的耳尖至浸凍邊界線之間的區(qū)域同時浸入溫度-26.5°C、濃度90v%的乙醇中(乙醇置于DFY-5L/40型低溫恒溫反應(yīng)浴冷凍槽內(nèi))，待兩耳凍結(jié)(即變白、變硬)開始計(jì)時，70s后取出，拭干后在空氣中自然復(fù)溫，造成兔耳凍傷模型。
[0014]I實(shí)驗(yàn)材料
1.1實(shí)驗(yàn)動物、飼料、飲水及飼養(yǎng)環(huán)境
1.1.1實(shí)驗(yàn)動物:普通級日本大耳白兔(購自河南省康達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司)
1.1.2飼料:兔用全價顆粒飼料(購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心) 1.1.3飲水:城市自來水，水源水質(zhì)符合生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)(GB5749-2006)
1.1.4飼養(yǎng)環(huán)境:鄭州大學(xué)藥學(xué)院動物房普通級兔飼養(yǎng)室
1.1.5動物種屬選擇依據(jù):生物學(xué)特性，兔與人均為哺乳類動物，皮膚、粘膜反應(yīng)比較相近，為外用藥藥理學(xué)研究常規(guī)使用動物。
[0015]1.2實(shí)驗(yàn)藥品
1.2.1陰性對照組所用藥品:磺胺嘧啶鋅軟膏基質(zhì)(乳白色，購自上海全宇生物科技內(nèi)鄉(xiāng)制藥有限公司)
1.2.2陽性對照藥:磺胺嘧啶鋅軟膏(購自上海全宇生物科技內(nèi)鄉(xiāng)制藥有限公司)。用法用量:直接涂敷于創(chuàng)面，然后用無菌紗布覆蓋包扎。軟膏用量隨創(chuàng)面的大小及感染情況而定，每日用量不超過500g。
[0016]陽性對照藥選擇依據(jù):
(I)本品系中國人民解放軍總后勤部衛(wèi)生部《軍隊(duì)特需藥品研發(fā)勤務(wù)技術(shù)指導(dǎo)原則(內(nèi)部資料)》第10章，10.1項(xiàng)“寒冷環(huán)境因素對人體損傷防治藥物”推薦用于治療凍傷的藥物之一 O
[0017](2)本品屬局部應(yīng)用磺胺藥，對多數(shù)革蘭陽性菌、革蘭陰性菌、酵母菌和其他真菌均有良好抗菌作用。使用本品可增強(qiáng)機(jī)體抵抗感染和創(chuàng)面愈合能力。
[0018]1.3主要試劑
兔血栓素 B2(TXB2)試劑盒，批號 201201，R&D Systems China C0.Ltd.兔 6-酮-前列腺素 Fla (6-keto-PGFl a )試劑盒，批號 201201,R&D Systems ChinaC0.Ltd.1.4主要儀器
Yaxin-0232針狀熱電偶測溫儀，北京雅欣理儀科技有限公司 CDG3022A型酶聯(lián)免疫檢測儀，國營華東電子管廠 YD-2508B電腦恒溫冷凍石蠟兩用切片機(jī)，金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠 SYD-B病理石蠟包埋機(jī)，沈陽市高新區(qū)譽(yù)德病理設(shè)備廠 SYD-PK漂烘烤片機(jī)，沈陽市高新區(qū)譽(yù)德病理設(shè)備廠 Nikon COOLPI x S600，中國尼康映像儀器銷售有限公司 DFY-5L/40型低溫恒溫反應(yīng)浴，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司 MiE顯微圖像處理軟件，山東易創(chuàng)電子有限公司 2實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果
2.1動物環(huán)境適應(yīng)
2?3月齡成年健康雄性日本大耳白兔(體重1.7?2.5kg,選取兔耳大小及厚度較為接近者)。于動物房兔檢疫室適應(yīng)性喂養(yǎng)、觀察7d，每天觀察記錄動物的外觀狀態(tài)。
[0019]2.2 24只兔按體重隨機(jī)分為3組，即凍傷模型對照組，陽性對照藥治療組和陰性對照組(即正常對照組)，每組8只。
[0020]2.1.4造模方法:除陰性對照組外，凍傷模型對照組和陽性對照藥治療組兔耳均按照實(shí)施例1所述方法進(jìn)行造模。
[0021]2.1.4陽性對照藥磺胺嘧啶鋅軟膏治療方法
2.1.4.1治療頻率和時間:凍后4h第I次上藥，第2、3、4d上、下午各上藥I次，以后每天上藥I次，直至兔耳凍區(qū)壞死分界線清楚之后，結(jié)束治療，共12d。
[0022]2.1.4.2治療途徑:將陽性對照藥磺胺嘧啶鋅軟膏涂敷于局部凍傷區(qū)域，如有水皰，排盡皰液后再上藥。上藥后，戴上滅菌雙耳紗布套，用鈕扣固定在頜下，使外用藥能在耳上保留一定時間。
[0023]2.1.4.3 給藥方法:
凍傷模型對照組半數(shù)動物(隨機(jī)數(shù)表法抽取)左耳(給基質(zhì)耳)給予磺胺嘧啶鋅軟膏基質(zhì)，右耳(模型對照耳)不給基質(zhì)；另半數(shù)動物右耳(給基質(zhì)耳)給予磺胺嘧啶鋅軟膏基質(zhì)，左耳(模型對照耳)不給基質(zhì)。
[0024]陽性對照藥治療組半數(shù)動物(隨機(jī)數(shù)表法抽取)左耳(給藥耳)給予藥物，右耳(模型對照耳)給予對應(yīng)基質(zhì)；另半數(shù)動物右耳(給藥耳)給予藥物，左耳(模型對照耳)給予對應(yīng)基質(zhì)。
[0025]陰性對照組兔雙耳均涂敷磺胺嘧啶鋅軟膏基質(zhì)。
[0026]所有兔均采用無粉塵乳膠手指套在兔耳凍傷局部均勻涂敷，供試品用量隨創(chuàng)面大小而定，涂敷厚度約為1_。
[0027]2.1.5療效指標(biāo)的檢測頻率及方法
2.1.5.1各組平原兔耳凍傷一般狀況觀察
每天觀察記錄兔整體一般狀況(如外觀、活動及被毛光澤度等)。凍傷即日起，每日于治療前觀察記錄兔耳創(chuàng)面的變化，并用數(shù)碼相機(jī)與標(biāo)尺一起拍攝該區(qū)域照片留存。
[0028]2.1.5.2各組平原兔耳凍傷兔體重的變化
于兔耳凍傷前及治療第l，4，8d各稱I次體重；在所有兔耳壞死分界線清楚時稱取活存兔末次體重，并計(jì)算體重增長率(％)。體重增長率(％)=(末次體重一凍傷前體重)/凍傷前體重X 100。每次稱重均于臨治療前進(jìn)行。
[0029]2.1.5.3各組平原兔耳凍傷活存面積的變化
于兔耳凍傷前及治療后壞死分界線完全清楚時，分別用數(shù)碼相機(jī)(兔耳鋪展，在40cm高度，640X480像素下，與標(biāo)尺一起拍攝，)拍攝該區(qū)域背側(cè)和腹側(cè)的照片，用MiE顯微圖像處理軟件測量兔耳凍傷前的預(yù)備凍區(qū)面積及治療后的活存面積(同法重復(fù)測量3次，取其平均值)，計(jì)算凍耳組織活存面積百分比。
[0030]活存面積(%)=[凍傷后兔耳活存面積/凍傷前兔耳凍區(qū)面積]X 100
2.1.5.4各組兔耳平原凍傷皮溫的變化
于兔耳凍傷前及治療第l，4，8d，在環(huán)境溫度為(22?24) 1:的條件下，用針狀熱電偶測量兔耳同一部位(在浸凍線中點(diǎn)向耳尖方向Icm處)的皮溫，在所有兔耳壞死分界線清楚時同法測量末次皮溫。
[0031]2.1.5.5各組平原凍傷兔耳病理組織學(xué)的變化
治療第5d，每組隨機(jī)處死2只兔，剪下凍耳浸凍部分，在浸凍線中點(diǎn)向耳尖方向Icm處取直徑約Icm的組織標(biāo)本，用甲醛與PBS配制成的10%的中性福爾馬林固定液固定48h后，石蠟包埋，切片，脫蠟水化，常規(guī)HE染色，以陰性對照組兔耳為對照，鏡下觀察組織病理學(xué)改變。
[0032]2.1.6數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差G 土s)表示，采用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)軟件，組間對比采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，顯著性水平為:α = 0.05。
[0033]2.1.7 結(jié)果
2.1.7.1各組平原兔耳凍傷一般狀況的觀察
實(shí)驗(yàn)期間，陰性對照組兔生長良好，體重自然增長，活動敏捷，被毛潤澤，各造模組(即凍傷模型對照組和陽性對照藥治療組)兔于實(shí)驗(yàn)期間均有輕微煩躁、噬咬現(xiàn)象。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時，除治療第5d考察造模情況處死的2只兔外全部活存，活存率為100%。
[0034]當(dāng)兔耳浸凍結(jié)束從低溫恒溫反應(yīng)浴冷凍槽中取出時，兩耳發(fā)硬、蒼白，室溫空氣中自然復(fù)溫后凍耳開始發(fā)紅、發(fā)熱，其原因是融化復(fù)溫后，出現(xiàn)微血管舒張，血管內(nèi)皮受損，血漿外滲，肉眼觀察見兔耳凍傷局部腫脹，并出現(xiàn)漿液性水皰，皰液無色或淡黃色，12h后腫脹逐漸加劇，水皰增大或新水皰形成，皮膚呈現(xiàn)紫紅色。凍后第3d，凍傷模型對照組兔耳和陽性對照藥治療組的模型對照耳顯紫紅色，部分兔耳水皰破裂，并見漿液性滲出，肉眼觀察見腫脹程度較前減輕(見圖1和圖4中的M、N)。5d后兔耳表皮潰破，有大量滲出液，兔耳遠(yuǎn)端開始出現(xiàn)皺縮變形，與周圍活存組織之間的壞死分界線隱約可見(見圖2和圖5中的P、Q)。至12d時，模型對照組兔耳和各組的模型對照耳皺縮變形區(qū)域形成硬痂或干性壞疽，兔耳壞死分界線清楚(見圖3和圖6中的T、U)。
[0035]陽性對照藥治療組的給藥耳，在用藥第3d時，肉眼觀察見其腫脹明顯，呈深紅色，皮膚表面散在少量水皰(圖4中的L、N)。5d后兔耳凍區(qū)腫脹漸輕，但皮膚表面潮濕發(fā)白，散在明顯的紫紅色瘀斑，沿兔耳遠(yuǎn)端邊緣開始皺縮變形(圖5中的0、Q)。至12d時，肉眼觀察見兔耳壞死分界線完全清楚，給藥耳活存組織(圖6中的R、S)多于模型對照組兔耳(見圖3)。
[0036]2.1.7.2各組兔耳凍傷兔體重的變化
表1各組兔耳凍傷兔體重的變化(i ±.5，/7=8)

【權(quán)利要求】
1.一種平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法，其特征在于:凍傷前，先用剪毛法剪去兔雙耳自耳尖向耳根方向70 — 80_區(qū)域內(nèi)的毛，并在該剪毛分界處用筆涂一直線作為浸凍邊界線，然后將兔雙耳的耳尖至浸凍邊界線之間的區(qū)域同時浸入溫度_24.5±2°C、濃度90 - 95%的乙醇中，待兩耳凍結(jié)開始計(jì)時，65±5s后取出，拭干后在空氣中自然復(fù)溫，造成兔耳凍傷模型。
2.如權(quán)利要求1所述平原條件下兔耳凍傷模型的制作方法，其特征在于:凍傷前，先用剪毛法剪去兔雙耳自耳尖向耳根方向70 — 80mm區(qū)域內(nèi)的毛，其中于50±5mm處留I?2mm寬的毛不剪。
【文檔編號】A61P39/00GK104127395SQ201410332790
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月14日
【發(fā)明者】李寅超, 韓晉, 趙宜紅, 石金金, 周旭, 孫曼, 袁海龍, 何永俠, 陳慧芳 申請人:鄭州大學(xué)