用于檢測豬藍(lán)耳病病毒的液相芯片檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬檢驗(yàn)檢疫領(lǐng)域，具體涉及用于檢測豬藍(lán)耳病病毒的液相芯片檢測試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 豬藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)引起的高度傳染性疾病，是目前種豬繁殖障礙的主 要疫病之一。主要表現(xiàn)為感染豬發(fā)熱、厭食，妊娠母豬晚期流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎和木乃 伊胎，各種年齡豬(特別是仔豬）呼吸障礙，還會導(dǎo)致免疫抑制而引起多種其他疾病，同時也 是引起豬呼吸系統(tǒng)疾病復(fù)合體（porcine respiratory disease complex，PRDC)的重要病 原體之一，給我國乃至世界范圍內(nèi)規(guī)模化的豬生產(chǎn)帶來巨大的威脅。
[0003] 由于本病的臨床癥狀與解剖病理變化差異較大，缺乏特征性的病理變化，因此在 臨床診斷上相當(dāng)困難，常常根據(jù)臨床特征結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷進(jìn)行綜合診斷，主要包括抗原檢 測和血清學(xué)診斷。由于PRRSV的廣泛傳播給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，本病已經(jīng) 引起各國的高度重視。因此，開發(fā)一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡單易行、適合批量操作的新型 檢測方法將具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0004] 液相芯片，也稱為微球體懸浮芯片（Suspension Array，liquid chip)，是基于 xMAP (flexible Multi-Analyte Profiling)技術(shù)的新型生物芯片技術(shù)平臺。該技術(shù)是20 世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來的，被喻為后基因組時代的芯片技術(shù)，是集流式技術(shù)、熒光微球、 激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)為一體的新型生物分子高通量檢測技術(shù)，它是在不同 熒光編碼的微球上進(jìn)行抗原-抗體、酶-底物、配體-受體的結(jié)合反應(yīng)，通過紅、綠兩束激光 分別檢測微球編碼和報告熒光來達(dá)到定性和定量的目的。該技術(shù)的優(yōu)勢在于檢測通量大、 速度快、靈敏度高、操作靈活、樣本用量少、檢測范圍廣、特異性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好、費(fèi) 用低。
[0005] 鑒于豬藍(lán)耳病病毒的危害和現(xiàn)存檢測該病毒方法尚存的一些弊端，本發(fā)明利用免 疫學(xué)技術(shù)和液相芯片技術(shù)相結(jié)合研制用于檢測豬藍(lán)耳病病毒的液相芯片檢測試劑盒。簡言 之，采用單抗制備技術(shù)制備了豬藍(lán)耳病病毒單克隆抗體，并與羧基化21號微球偶聯(lián)，獲得 捕獲單抗-微球；采用多抗制備技術(shù)制備了兔源豬藍(lán)耳病病毒多克隆抗體，經(jīng)生物素化獲 得了檢測多抗；采用重組DNA技術(shù)制備了豬藍(lán)耳病病毒3個抗原蛋白偶聯(lián)體MNM，作為檢測 標(biāo)準(zhǔn)品。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測豬藍(lán)耳病病毒的液相芯片檢測試劑盒。
[0007] -種重組蛋白基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。
[0008] 一種重組蛋白，它是序列表SEQ ID NO. 5所不的基因表達(dá)的蛋白。
[0009] 一種表達(dá)重組蛋白質(zhì)粒，它是以PRRSV的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成的CDNA為模板； 1) 用引物： PMl :5' AAGCTTATGGGGTCGTCTCTAGA 3' PM2 :5' CTCGAGTTTGGCATATTTGACA 3' 擴(kuò)增，插入PMD18T中； 2) 用引物： PMN2-1 :5' GGATCCATGGGGTCGTCTCTAGA 3' PMN2-2 :5' GAATTCTGCTGAGGGTGATGCT 3' 擴(kuò)增，插入pET28a中； 3) 將1)、2)獲得的質(zhì)粒，分別用Hind III和Xho I酶切采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。
[0010] 一種重組蛋白在制備檢測豬藍(lán)耳病病毒檢測試劑盒中的應(yīng)用。
[0011] 用于檢測豬藍(lán)耳病病毒的液相芯片檢測試劑盒，它的抗原標(biāo)準(zhǔn)品為序列表SEQ ID NO. 5所不的基因表達(dá)的蛋白； 所述的抗原標(biāo)準(zhǔn)品的工作濃度為2 μ g/mL。
[0012] 本發(fā)明提供了用于檢測豬藍(lán)耳病病毒的液相芯片檢測試劑盒，病毒的濃度達(dá)到 IO1TCID5ci時仍可被檢出，豬藍(lán)耳病病毒、豬流行性乙型腦炎病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬 圓環(huán)病毒2型、豬腦心肌炎病毒、豬偽狂犬病毒、豬脊髓灰質(zhì)炎病毒無交叉反應(yīng)，特異性強(qiáng)， 本發(fā)明還提供了抗原標(biāo)準(zhǔn)品，它的工作濃度為2 μ g/mL。
【附圖說明】
[0013] 圖1細(xì)胞融合； 圖2純化多克隆抗體的檢測結(jié)果； 圖3單抗偶聯(lián)微球的最佳工作濃度； 圖4試劑盒靈敏度檢測結(jié)果； 圖5試劑盒特異性檢測結(jié)果；其中：1-3豬藍(lán)耳病病毒病毒；5-6豬流行性乙型腦炎病 毒；7-9豬細(xì)小病毒（PPV) ; 10-12豬瘟病毒（CSFV) ; 13-15豬圓環(huán)病毒2型（PCV2) ; 16-18 豬腦心肌炎病毒（EMCV) ; 19-21豬偽狂犬病毒；22-24豬脊髓灰質(zhì)炎病毒。
[0014] 附圖6試劑盒重復(fù)性檢測結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1豬藍(lán)耳病病毒單克隆抗體的制備 (I) PRRSV的培養(yǎng)與免疫原的制備 Marc-145細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇培養(yǎng)，待Marc-145細(xì)胞長成單層后，將純化后的PRRSV病毒(本 實(shí)驗(yàn)室保存)，稀釋至100 TCID5tl后，取ImL接種于Marc-145細(xì)胞單層上，常規(guī)增殖病毒操 作，在倒置顯微鏡下逐日觀察細(xì)胞病變（CPE)，出現(xiàn)約80%的拉網(wǎng)，空泡、聚縮等細(xì)胞病變后 收獲病毒。收毒時將細(xì)胞培養(yǎng)瓶快速置_70°C和37°C反復(fù)凍融三次，于4°C 5000r/min離 心30min，收集上清液(含PRRSV)，用0. 1%的甲醛滅活病毒36h，采用差速離心法純化病毒， 將滅活后的病毒液于15000r/min，4°C離心20min，棄去沉淀，取高速離心的上清液于4°C， 30000r/min超速離心lh，棄去上清，用適量PBS緩沖液懸浮沉淀，再進(jìn)行2次差速離心，最 后用適量PBS將沉淀溶解。4°C，5000r/min離心20min，取上清即為純化的病毒液。
[0016] 取純化的病毒，超聲波粉碎儀裂解，用U2010紫外分光光度計于260nm與280nm下 測定吸光度，計算其蛋白濃度，用PBS稀釋至15(^g/ml與等量的弗氏完全佐劑或弗氏不完 全佐劑混合制成乳劑，置4°C放置3d，若呈乳白色不分層，即可作為免疫原。
[0017] (2)小鼠免疫及血清效價檢測 選擇4-6周齡雌性Balb/c小鼠5只，用上述制備的弗氏完全佐劑疫苗進(jìn)行首免，二免、 三免使用弗氏不完全佐劑制備的疫苗進(jìn)行免疫注射，最后一次免疫于融合前3天進(jìn)行加 強(qiáng)，具體免疫程序見附表1。
[0018]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種重組蛋白基因，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 5所示。
2. -種重組蛋白，它是序列表SEQ ID NO. 5所示的基因表達(dá)的蛋白。
3. -種表達(dá)重組蛋白質(zhì)粒，它是以PRRSV的總RNA，反轉(zhuǎn)錄成的cDNA為模板； 1) 用引物： PMl :5' AAGCTTATGGGGTCGTCTCTAGA 3'（含 Hind III 酶切位點(diǎn)） PM2 :5' CTCGAGTTTGGCATATTTGACA 3'（含 Xho I 酶切位點(diǎn)） 擴(kuò)增，插入PMD18T中； 2) 用引物： PMN2-1 :5' GGATCCATGGGGTCGTCTCTAGA 3'（含 BamH I 酶切位點(diǎn)） PMN2-2 :5' GAATTCTGCTGAGGGTGATGCT 3'（含 EcoR I 酶切位點(diǎn)） 擴(kuò)增，產(chǎn)物插入pET28a中； 3) 將1)、2)獲得的質(zhì)粒，分別用Hind III和Xho I酶切，采用T4DNA連接酶進(jìn)行連接。
4. 一種重組蛋白在制備檢測豬藍(lán)耳病病毒檢測試劑盒中的應(yīng)用。
5. 用于檢測豬藍(lán)耳病病毒的液相芯片檢測試劑盒，它的抗原標(biāo)準(zhǔn)品為序列表SEQ ID NO. 5所不的基因表達(dá)的蛋白。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的用于檢測豬藍(lán)耳病病毒的液相芯片檢測試劑盒，其特征在 于：所述的抗原標(biāo)準(zhǔn)品的工作濃度為2 y g/mL。
【專利摘要】本發(fā)明公開了用于檢測豬藍(lán)耳病病毒的液相芯片檢測試劑盒，病毒的濃度達(dá)到101TCID50時仍可被檢出，豬藍(lán)耳病病毒、對豬流行性乙型腦炎病毒、豬細(xì)小病毒、豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型、豬腦心肌炎病毒、豬偽狂犬病毒、豬脊髓灰質(zhì)炎病毒無交叉反應(yīng)，本發(fā)明還公開了抗原標(biāo)準(zhǔn)品，它的工作濃度為2μg/mL。
【IPC分類】G01N33-569, G01N33-68, C12N15-40, C12N15-70, C07K14-08
【公開號】CN104744573
【申請?zhí)枴緾N201510140002
【發(fā)明人】孟日增, 石建平, 劉陽, 宋翱, 馬文晨, 王瑋琳, 王寧, 聶丹丹
【申請人】中華人民共和國吉林出入境檢驗(yàn)檢疫局
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月27日