一種卡貝縮宮素的純化方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及多肽反相HPLC技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種批量化產(chǎn)業(yè)化純化卡貝縮宮素的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卡貝縮宮素(Carbetocin)是一種合成的具有激動劑性質(zhì)的長效催產(chǎn)素九肽類似物。像催產(chǎn)素一樣，卡貝縮宮素與子宮平滑肌的催產(chǎn)素受體結(jié)合，引起子宮的節(jié)律性收縮，在原有的收縮基礎(chǔ)上，增加其頻率和增加子宮張力。對非妊娠得子宮沒有作用，但是對妊娠的子宮和剛生產(chǎn)的子宮具有有效的子宮收縮作用，其臨床和藥物特性與天然產(chǎn)生的催產(chǎn)素類似。在非妊娠狀態(tài)下，子宮的催產(chǎn)素受體含量很低，在妊娠期間增加，分娩時(shí)達(dá)高峰。
[0003]不論是靜脈注射還是肌肉注射卡貝縮宮素后，子宮迅速收縮，可在2分鐘內(nèi)達(dá)到一個(gè)明確強(qiáng)度。單劑量靜脈注射卡貝縮宮素對子宮的活性作用可持續(xù)大約I個(gè)小時(shí)，因?yàn)樽阋灶A(yù)防剛生產(chǎn)后的產(chǎn)后出血。產(chǎn)后給予卡貝縮宮素后，在收縮的頻率與幅度方面都比催產(chǎn)素要長，并且對有出血傾向、需要額外使用縮宮素者，卡貝縮宮素耐受性更好，與縮宮素一樣有效甚至更有效。
[0004]目前臨床常用的促進(jìn)子宮收縮藥物麥角新堿，會導(dǎo)致惡心、嘔吐、高血壓和冠脈痙攣等?？ㄘ惪s宮素是一種長效的類催產(chǎn)素藥物。與麥角新堿相比，使用卡貝縮宮素在預(yù)防陰道分娩婦女的產(chǎn)后出血方面同樣有效，并且惡心、嘔吐、高血壓的發(fā)生比例顯著降低。
[0005]因此卡貝縮宮素在臨床有很好的應(yīng)用前景，具有很高的開發(fā)價(jià)值。目前為止，很少有關(guān)于分離純化的文獻(xiàn)報(bào)道，特別是規(guī)?；a(chǎn)的方法?，F(xiàn)常用的純化方法通常為凝膠法、離子交換等。主要缺點(diǎn)是方法單一，產(chǎn)品純度低或者采取多種手段，產(chǎn)品收率低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一條適于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)卡貝縮宮素的純化工藝方法，解決現(xiàn)有技術(shù)分離方法單一，產(chǎn)品純度低或者采取多種手段，產(chǎn)品收率低的技術(shù)問題。本發(fā)明使用反相高效液相色譜法純化卡貝縮宮素，并用離子交換法交換轉(zhuǎn)鹽，生產(chǎn)成本低，工藝簡單，環(huán)境污染低，收率高，便于工業(yè)化實(shí)施。
[0007]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下:一種純化卡貝縮宮素的方法，包括如下步驟:
1)將卡貝縮宮素粗品溶液以0.45 μπι濾膜過濾，以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱，流動相:高氯酸鈉水溶液為A相，乙腈溶液為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶液；
2)將純化后的高純度肽溶液采用離子交換法轉(zhuǎn)換成醋酸鹽；
3)將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。
[0008]更為優(yōu)選的方案是:所述B相為色譜純乙腈溶液。
[0009]更為優(yōu)選的方案是:所述色譜乙腈溶液的質(zhì)量百分濃度為10-50%，檢測波長為220nm。
[0010]更為優(yōu)選的方案是:所述的流動相中高氯酸鈉的質(zhì)量百分濃度為0.1%。
[0011]更為優(yōu)選的方案是:所述的離子交換法采用陰離子交換樹脂轉(zhuǎn)鹽，樹脂型號為D314大孔吸附樹脂。
[0012]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明提出的一條適于產(chǎn)業(yè)化卡貝縮宮素的純化工藝方法，利用離子交換法轉(zhuǎn)鹽，不僅能得到HPLC純度大于99.0%的精肽，而且可以有效降低生產(chǎn)過程中有機(jī)溶劑的毒性，降低成本，從而達(dá)到大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)的目的。
【具體實(shí)施方式】
[0013]實(shí)施例1
1.樣品處理:在卡貝縮宮素氧化液中加入少許乙腈超聲至液體澄清，用孔徑為0.45um濾膜過濾后收集濾液備用。
[0014]2.純化
純化條件:色譜柱:以十八烷基硅膠鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:5cmX25cm.流動相:A相:質(zhì)量百分濃度0.1%高氯酸鈉水溶液；B相:乙腈溶液。流速:60-80ml/min。檢測波長:220nm。梯度:B% (質(zhì)量百分濃度):10_50%，30_50min。進(jìn)樣量為
3.5_5g0
[0015]純化過程:將色譜柱用質(zhì)量百分濃度35%的B相平衡好后上樣，上樣量為1.5-2.0L樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。
[0016]3.轉(zhuǎn)鹽，樹脂型號為D314大孔吸附樹脂樹脂的預(yù)處理:
O甲醇清洗3-5次，
2)去離子水清洗3-5次，
3)0.2N的NaOH浸泡，并不時(shí)的攪拌，大約2個(gè)小時(shí)，
4)去離子水清洗至pH值為8左右，
5)甲醇清洗3-5次，
6)去離子水清洗3-5次，
7)加入質(zhì)量百分比為10%醋酸水溶液浸泡，并不時(shí)攪拌，大約2小時(shí)左右，
8)去離子水清洗PH值為6左右；
在玻璃柱中加入預(yù)先處理好的樹脂，將收集好的肽溶液加入柱中，交換比例質(zhì)量比為5-10倍，調(diào)節(jié)液體流速為2-4滴/min，收集全部的目標(biāo)峰。
[0017]4.將轉(zhuǎn)鹽后所得的所有肽溶液，進(jìn)行減壓濃縮至lg/50ml，濃縮溫度不超過37°C，然后冷凍干燥得純度大于99.0%的卡貝縮宮素，純化收率78.2%。
[0018]實(shí)施例2
1.樣品處理:在卡貝縮宮素氧化液中加入少許乙腈超聲至液體澄清，用孔徑為0.45um濾膜過濾后收集濾液備用。
[0019]2.純化
純化條件:色譜柱:以十八烷基硅膠鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:1cmX 25cm.流動相:A相:質(zhì)量百分濃度0.1%高氯酸鈉水溶液；B相:乙腈溶液。流速:180-220ml/min。檢測波長:220nm。梯度:B% (質(zhì)量百分濃度):10_50%，30_50min。進(jìn)樣量為 10-15go
[0020]純化過程:將色譜柱用質(zhì)量百分濃度35%的B相平衡好后上樣，上樣量為4-5L樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。
[0021]3.轉(zhuǎn)鹽，樹脂型號為D314大孔吸附樹脂樹脂的預(yù)處理:
O甲醇清洗3-5次，
2)去離子水清洗3-5次，
3)0.2N的NaOH浸泡，并不時(shí)的攪拌，大約2個(gè)小時(shí)，
4)去離子水清洗至PH值為8左右，
5)甲醇清洗3-5次，
6)去離子水清洗3-5次，
7)加入質(zhì)量百分比為10%醋酸水溶液浸泡，并不時(shí)攪拌，大約2小時(shí)左右，
8)去離子水清洗pH值為6左右，
在玻璃柱中加入預(yù)先處理好的樹脂，將收集好的肽溶液加入柱中，交換比例質(zhì)量比為5-10倍，調(diào)節(jié)液體流速為2-4滴/min，收集全部的目標(biāo)峰。
[0022]4.將轉(zhuǎn)鹽后所得的所有肽溶液，進(jìn)行減壓濃縮至lg/50ml，濃縮溫度不超過37°C，然后冷凍干燥得純度大于99.0%的卡貝縮宮素，純化收率77.8%。
[0023]實(shí)施例3
1.樣品處理:在卡貝縮宮素氧化液中加入少許乙腈超聲至液體澄清，用孔徑為0.45um濾膜過濾后收集濾液備用。
[0024]2.純化
純化條件:色譜柱:以十八烷基硅膠鍵合硅膠為固定相的色譜柱，柱子直徑和長度為:15cmX25cm.流動相:A相:質(zhì)量百分濃度0.1%高氯酸鈉水溶液；B相:乙腈溶液。流速:650-850ml/min。檢測波長:220nm。梯度:B% (質(zhì)量百分濃度):10_50%，30_50min。進(jìn)樣量為 15-20go
[0025]純化過程:將色譜柱用質(zhì)量百分濃度35%的B相平衡好后上樣，上樣量為8-10L樣品溶液。線性梯度洗脫，收集目的峰，將收集好的肽溶液放置收集瓶中備用。
[0026]3.轉(zhuǎn)鹽，樹脂型號為D314大孔吸附樹脂樹脂的預(yù)處理:
O甲醇清洗3-5次，
2)去離子水清洗3-5次，
3)0.2N的NaOH浸泡，并不時(shí)的攪拌，大約2個(gè)小時(shí)，
4)去離子水清洗至pH值為8左右，
5)甲醇清洗3-5次，
6)去離子水清洗3-5次，
7)加入質(zhì)量百分比為10%醋酸水溶液浸泡，并不時(shí)攪拌，大約2小時(shí)左右，
8)去離子水清洗PH值為6左右，
在玻璃柱中加入預(yù)先處理好的樹脂，將收集好的肽溶液加入柱中，交換比例質(zhì)量比為5-10倍，調(diào)節(jié)液體流速為2-4滴/min，收集全部的目標(biāo)峰。
[0027]4.將轉(zhuǎn)鹽后所得的所有肽溶液，進(jìn)行減壓濃縮至lg/50ml，濃縮溫度不超過37°C，然后冷凍干燥得純度大于99.0%的卡貝縮宮素，純化收率77.5%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種純化卡貝縮宮素的方法，其特征是包括如下步驟: O將卡貝縮宮素粗品溶液以0.45 μπι濾膜過濾，以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱，流動相:高氯酸鈉水溶液為A相，乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶液； 2)將純化后的高純度肽溶液采用離子交換法轉(zhuǎn)成醋酸鹽； 3)將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種純化卡貝縮宮素的方法，其特征是:所述步驟I)中B相為色譜純乙腈溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種純化卡貝縮宮素的方法，其特征是:所述步驟I)中A相高氯酸鈉的質(zhì)量百分濃度為0.1%，梯度洗脫純化B相的質(zhì)量百分濃度為10-50%，檢測波長為 220nmo
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種純化卡貝縮宮素的方法，其特征是:所述的離子交換法是利用陰離子交換樹脂轉(zhuǎn)鹽。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用反相高效液相色譜法純化卡貝縮宮素的方法，解決現(xiàn)有技術(shù)分離方法單一，產(chǎn)品純度低或者采取多種手段，產(chǎn)品收率低的技術(shù)問題。本發(fā)明包括如下步驟：1）將卡貝縮宮素粗品溶液以0.45μm濾膜過濾后待用，以固定相為十八烷基鍵合硅膠的反相硅膠柱，流動相：質(zhì)量百分濃度0.1%的高氯酸鈉為A相，色譜純乙腈為B相，進(jìn)行梯度洗脫純化，收集目的峰值的肽溶液；2）利用離子交換法轉(zhuǎn)成醋酸鹽；3）將最終的高純度肽溶液減壓旋蒸濃縮冷凍干燥，得粉末狀成品肽。本發(fā)明用于工業(yè)化生產(chǎn)卡貝縮宮素。
【IPC分類】C07K1-20, C07K7-16
【公開號】CN104744567
【申請?zhí)枴緾N201510107759
【發(fā)明人】徐紅巖, 秦敬國, 楊翼
【申請人】上海吉爾多肽有限公司, 濱海吉爾多肽有限公司
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年3月12日