專利名稱：：人pak7基因的用途及其相關(guān)藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物
技術(shù)領(lǐng)域：
，更具體地涉及人PAK7基因的用途及其相關(guān)藥物。
背景技術(shù)：
：核糖核酸干擾(RNAinterference，RNAi)現(xiàn)象是指當(dāng)與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)某段序列同源的雙鏈RNA(dsRNA)導(dǎo)入細(xì)胞后，該mRNA發(fā)生特異性降解，而導(dǎo)致該基因表達(dá)的沉默。研究表明，長(zhǎng)度為21-23nt的雙鏈RNA能夠在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平特異性的引起RNAi(TuschlT,ZamorePD,SharpPA,BartelDP.RNAi:double-strandedRNAdirectstheATP-dependentcleavageofmRNAat21to23nucleotideintervals.Cell2000；101:25-33.)。腫瘤是威脅人類健康的主要疾病。腫瘤患者雖經(jīng)化療、放療和綜合治療，但五年生存率仍很低，如能對(duì)腫瘤發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)的基因進(jìn)行干預(yù)，將能為腫瘤的治療開(kāi)辟新途徑。近年來(lái)，RNAi已成為腫瘤的基因治療的有效策略。利用RNAi技術(shù)可以抑制原癌基因、突變的抑癌基因、細(xì)胞周期相關(guān)基因、抗凋亡相關(guān)基因等的表達(dá)來(lái)抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展(Uprichard,SusanL.ThetherapeuticpotentialofRNAinterference.FEBSLetters2005；579:5996-6007.)。p21活化激酶(p21-aCtiVatedkinase,PAK)家族是進(jìn)化上高度保守的蘇氨酸/絲氨酸激酶，為Mio家族小鳥苷三磷酸酶(Iiho-GTPase)Cdc42和Rac下游重要的靶蛋白，也是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)途徑的上游調(diào)節(jié)因子。PAK家族蛋白參與許多重要的細(xì)胞活動(dòng)，如細(xì)胞骨架的動(dòng)力學(xué)調(diào)節(jié)、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、生存和凋亡、細(xì)胞周期、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、細(xì)胞生長(zhǎng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)化等(KumarR,VadlamudiRK.EmergingFunctionsofp21_ActivatedKinasesinHumanCancerCells.JCellPhysiol.2002；193(2):133-44.SellsMA,BoydJT,ChernoffJ.p21-activatedkinase1(Pakl)regulatescellmotilityinmammalianfibroblasts.JCellBiol.1999；145(4):837-49.VadlamudiRK,KumarR.P2トactivatedkinasesinhumancancer.CancerMetastasisRev.2003；22(4):385-93.EdwardsDC,SandersLC,BokochGM,GillGN.ActivationofLIM-kinasebyPaklcouplesRac/Cdc42GTPasesignallingtoactincytoskeletaldynamics.NatCellBiol.1999；1(5)253-9.)。根據(jù)PAK家族成員的同源程度可將其分為兩個(gè)亞組:A組(包括ΡΑΚΙ-；)和B組(包括PAK4-6)。PAK7是最后被克隆的PAK家族成員，定位于染色體20pl2位，編碼SOkD蛋白。該蛋白含⑶C42/Racl相互作用樣式和GIPase結(jié)合結(jié)構(gòu)域。PAK7可被p21激活并進(jìn)一步激活下游的MAPK信號(hào)通路，具有自我磷酸化和自我激活的能力。PAK7蛋白定位在線粒體膜上，于112位絲氨酸磷酸化BAD蛋白(CotteretS，JafferZM,BeeserA,ChernoffJ.p21-Activateakinase5(PaK5)localizestomitochondriaandinhibitsapoptosisbyphosphorylatingBAD.MolCellBiol.2003；23(16):55^-39.)，也能在激活蛋白激酶AKT后于136位絲氨酸磷酸化Bcl-2家族的促凋亡蛋白BAD(CotteretS，Chernoffj.NucleocvtoplasmicshuttlingofPak5regulatesitsantiapoptoticproperties.MolCellBiol.2006；26(8):3215-30.)，從而實(shí)現(xiàn)直接和間接對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制(GirouxV,DagornJし，IovannaJL.AReviewofKinasesImplicatedmPancreaticLancer.Pancreatology.2009(6)；9:738-54.)。研究還發(fā)現(xiàn)，PAK7蛋白可在細(xì)胞核和線粒體之間穿梭，而精確的亞細(xì)胞定位對(duì)其發(fā)揮抑制凋亡作用至關(guān)重要。PAK7還參與細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，通過(guò)下調(diào)MARK2蛋白保持微管穩(wěn)定，引起F-肌動(dòng)蛋白網(wǎng)絡(luò)紊亂，應(yīng)激纖維和粘著斑消失，使細(xì)胞形成偽足(MateniaD，GriesshaberB，LiXY,ThiessenA，JohneC，JiaoJ，MandelkowE，MandelkowEM.PAK5kinaseisaninhibitorofMARK/Par-1，whicnleadstostablemicrotubulesanddynamicactin.MolBiolCell.2005；16(9):4410-22.TimmTiMateniaD，LiXY,GriesshaberB，MandelkowEM.SignalingfromMARKtotau-regulation，cytoskeletalcrosstalk，andpathologicalphosphorylation.NeurodegenerDis.2006；3(4-5):207-17.)PAK7主要在腦中特定、持續(xù)表達(dá)(PandeyA,DanI，KristiansenTZ，WatanabeNM,VoldbyJ，KajikawaΕ，Knosravi-FarR，BlagoevB，MannΜ.CloningandcharacterizationofPAK5，anovelmemberofmammalianp21_activatedkinase—IIsubfamilythatispredominantlyexpressedinbrain.Oncogene.2002；21(24)3939-48.)，并且PAK7過(guò)表達(dá)在N1E-115細(xì)胞中促進(jìn)神經(jīng)突的生長(zhǎng)和延伸，而且PAK7的突變表現(xiàn)出抑制神經(jīng)突生長(zhǎng)的功能，提示其在腦發(fā)育過(guò)程起著重要作用(DmC，NathN，LibertoΜ,MindenΑ.ΡΑΚ5,anewDrainspecifickinase,promotesneuriteoutgrowthinNlE-115cells.MolCellBiol.2002；22(2):567-77.)。在臨床中發(fā)現(xiàn)PAK7在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，且隨著惡性程度増加表達(dá)水平提高，并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和遷移促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)不多(GongW,AnZ，WangY，PanX，F(xiàn)angW,JiangB，ZhangH.P21_activatedkinase5isoverexpressedduringcolorectalcancerprogressionandregulatescolorectalcarcinomaceiladhesionandmigration.IntJCancer.2009；125(3):548_55·)。*石if究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合抑制ΡΑΚ7、ΜΑΡ3Κ7和CK2，可獲得累加的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，ΡΑΚ7有望成為胰腺癌的——個(gè)有效治ヲ了半巴^、(GirouxV,DagornJC,IovannaJL.AReviewofKinasesImplicatedinPancreaticCancer.Pancreatology.2009(6)；9:738-54.)。目前，對(duì)PAK7在月中瘤細(xì)胞中的功能的研究主要集中于調(diào)節(jié)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲功能方面。關(guān)于PAK7在腫瘤細(xì)胞存活、凋亡和細(xì)胞周期進(jìn)展中的功能尚無(wú)報(bào)道。慢病毒(Ientivirus)載體是高效的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)工具，主要用于感染對(duì)常規(guī)方法轉(zhuǎn)染效率較低的細(xì)胞，如原代細(xì)胞等。慢病毒顆?？赏瑫r(shí)感染増殖和非増殖的細(xì)胞，且感染比較穩(wěn)定、持久。運(yùn)用慢病毒載體，可實(shí)現(xiàn)特定基因的高表達(dá)，也可以表達(dá)發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA(shorthairpinRNA,shRNA)以RNA干擾(RNAinterference,RNAi)方式下調(diào)某基因的表達(dá)。RNAi是利用雙鏈RNA介導(dǎo)的序列特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，已成為研究基因功能的ー種新興的有效手段，并有望成為腫瘤等疾病基因治療的工具(IzquierdoM.ShortinterferingRNAsasatoolforcancergenetherapy.CancerGeneTner.2005；12(3):217-27.)。本發(fā)明擬采用慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)研究PKA7基因在腫瘤細(xì)胞惡性増殖中的功能，為惡性腫瘤的非手術(shù)臨床治療提供理論依據(jù)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于公開(kāi)與人PAK7(P21(Cdc42/Rac)-activatedkinase7)基因相關(guān)的治療方法及藥物。本發(fā)明第一方面，公開(kāi)了將人PAK7基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物，或者將人PAK7基因用于制備腫瘤診斷藥物。人PAK7基因用于制備或篩選腫瘤治療藥物包括兩方面的內(nèi)容其一，將人PAK7基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于制備腫瘤治療藥物或制劑；其ニ，將人PAK7基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑。所述將人PAK7基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)具體是指將人PAK7基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生RNA干擾作用的靶標(biāo)，從而能降低腫瘤細(xì)胞人PAK7基因的表達(dá)水平。所述將人PAK7基因作為藥物或制劑針對(duì)腫瘤細(xì)胞的作用靶標(biāo)應(yīng)用于篩選腫瘤治療藥物或制劑具體是指將人PAK7基因作為作用對(duì)象對(duì)藥物或制劑進(jìn)行篩選，以找到可以抑制或促進(jìn)人PAK7基因表達(dá)的藥物作為腫瘤治療備選藥物。如之后所述的人PAK7基因小分子干擾RNA即是以人PAK7基因?yàn)樽饔脤?duì)象篩選獲得的，可用作具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用的藥物。諸如抗體藥物，小分子藥物等也可將PAK7基因作為作用対象。所述將人PAK7基因用于制備腫瘤診斷藥物，是指將人PAK7基因表達(dá)產(chǎn)物作為ー項(xiàng)腫瘤診斷指標(biāo)應(yīng)用于腫瘤診斷藥物的制備。所述的腫瘤可以為其腫瘤細(xì)胞的増殖與人PAK7基因的表達(dá)相關(guān)的任ー種腫瘤，更進(jìn)一歩的，為ー種惡性腫瘤，例如選自肺癌、胃癌和膠質(zhì)瘤。所述腫瘤治療藥物可以為小分子化學(xué)藥，抗體藥，也可以為核酸類藥物。進(jìn)ー步的，所述腫瘤治療藥物能降低人PAK7基因的表達(dá)水平從而抑制腫瘤細(xì)胞的増殖。采用前述腫瘤治療藥物治療腫瘤的方法，主要是通過(guò)降低人PAK7基因的表達(dá)水平抑制腫瘤細(xì)胞的增殖來(lái)達(dá)到治療目的的。具體的，治療時(shí)，將能有效降低人PAK7基因表達(dá)水平的物質(zhì)給藥于患者。進(jìn)ー步的，所述的能有效降低人PAK7基因表達(dá)水平的物質(zhì)，包括能夠特異性沉默人PAK7基因表達(dá)的小分子干擾RNA(siRNA)。該小分子干擾RNA(siRNA)可以起到特異性沉默腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源PAK7基因的表達(dá)的作用。進(jìn)ー步的，所述小分子干擾RNA以選自SEQIDNO:1_50之任一的序列作為特異性沉默人PAK7基因表達(dá)的靶點(diǎn)序列。所述小分子干擾RNA以選自SEQIDNO1_50之任一的序列作為特異性沉默人PAK7基因表達(dá)的靶點(diǎn)序列是指該小分子干擾RNA能與SEQIDNO1-50中的任ー種序列所編碼的mRNA片段特異性結(jié)合，并特異性沉默人PAK7基因的表達(dá)。進(jìn)ー步的，所述能夠特異性沉默人PAK7基因表達(dá)的小分子干擾RNA(SiRNA)經(jīng)由慢病毒載體表達(dá)。具體而言，這個(gè)過(guò)程包括將編碼所述人PAK7基因小分子干擾RNA的DNA片段克隆入慢病毒載體獲得人PAK7基因干擾慢病毒載體，進(jìn)而利用該人PAK7基因干擾慢病毒載體經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒后，感染腫瘤細(xì)胞并最終表達(dá)所述siRNA。人PAK7基因干擾慢病毒載體為將編碼所述人PAK7基因小分子干擾RNA的DNA片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人PAK7基因小分子干擾RNA。進(jìn)ー步的，所述的慢病毒載體可選自pLK0.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP,pLKO.I-CMV-Neo,pLKO.1-Neo,pLKO.トNeo-CMV_tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP,pLKO.トpuro_CMV_TagYFP、pLKO.トpuro_CMV_TagRFP、pLKO.l-puro-CMV-TagFP635,pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP,pLKO.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLKO-puro-IPTG_3xLacO、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ中的任ー種慢病毒載體，本發(fā)明實(shí)施例具體列舉了以PGCSIL-GFP為載體。慢病毒載體可在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝成為有感染力的病毒顆粒。本發(fā)明第二方面，公開(kāi)了ー種分離的人PAK7基因小分子干擾RNA(SiRNA)靶標(biāo)片段，其序列為SEQIDNO1-50中任意一條序列。所述分離的人PAK7基因小分子干擾RNA(SiRNA)靶標(biāo)片段可應(yīng)用于人PAK7基因小分子干擾RNA的篩選與制備。本發(fā)明第三方面，公開(kāi)了ー種人PAK7基因小分子干擾RNA(SiRNA)，能夠特異性沉默人PAK7基因的表達(dá)。所述人PAK7基因小分子干擾RNA以選自SEQIDNO1-50之任一的序列作為特異性沉默人PAK7基因表達(dá)的靶點(diǎn)序列。進(jìn)ー步的，所述人PAK7基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補(bǔ)，所述正義RNA片段含有SEQIDNO:1_50中之任一序列編碼的RNA。所述正義RNA片段和反義RNA片段存在于兩條不同的RNA鏈上或者存在于同一條RNA鏈上。所述正義RNA片段和反義RNA片段的長(zhǎng)度均為15_27個(gè)核苷酸；較佳的，長(zhǎng)度均為19-23個(gè)核苷酸；最佳的，長(zhǎng)度均為19、20或者21個(gè)核苷酸。進(jìn)ー步的，所述人PAK7基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，包括正義RNA片段、莖環(huán)片段和反義RNA片段，正義RNA片段和反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔；其中，正義RNA片段和反義RNA片段互補(bǔ)，正義RNA片段的序列選自SEQIDNO1-50之任一。所述莖環(huán)片段結(jié)構(gòu)包括6個(gè)或9個(gè)堿基。進(jìn)ー步的所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一UUCAAGAGA、AUG、CCC,UUCG,CCACC,CTCGAG,AAGCUU、CCACACC。本發(fā)明具體列舉了以UUCAAGAGA為莖環(huán)。如實(shí)施例列舉的，所述人PAK7基因小分子干擾RNA的序列為SEQIDNO51=GAGCUCUCUCCUACCUUCAUAUUCAAGAGAUAUGAAGGUAGGAGAGAGCUC。本發(fā)明第四方面，公開(kāi)了ー種人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體，包含編碼前述人PAK7基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達(dá)前述人PAK7基因小分子干擾RNA。所述的人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體可以是將編碼前述人PAK7基因小分子干擾RNA的基因片段克隆入已知載體獲得。進(jìn)ー步的，所述人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體為人PAK7基因干擾慢病毒載體，為將編碼所述人PAK7基因小分子干擾RNA的基因片段克隆入慢病毒載體后獲得，能產(chǎn)生人PAK7基因小分子干擾RNA。所述慢病毒載體可以選自pLK0.1-puro、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.1-puro-CMV-tGFP,pLKO.I-CMV-Neo,pLKO.トNeo、pLKO.トNeo-CMV_tGFP、pLKO.1-puro-CMV-TagCFP,pLKO.トpuro_CMV_TagYFP、pLKO.トpuro_CMV_TagRFP、pLKO.l-puro-CMV-TagFP635,pLKO.1-puro-UbC-TurboGFP,pLKO.l-puro-UbC_TagFP635、pLKO-puro-IPTG-lxLacO、pLKO-puro-IPTG_3xLacO、ρLPUpLP2、pLP/VSV-G、pENTR/U6、pLenti6/BL0CK-iT-DEST、pLenti6-GW/U6-laminshrna、pcDNAl.2/V5_GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5-DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ中的任一。本發(fā)明實(shí)施例具體列舉了以pGCSIL-GFP為載體構(gòu)建的人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體,命名為PAK7-shRNA-plasmid。進(jìn)ー步的，編碼所述人PAK7基因小分子干擾RNA的基因片段的序列含有SEQIDNO1-50中之任一序列及其互補(bǔ)序列。本發(fā)明的人PAK7基因小分子干擾RNA可用于抑制腫瘤細(xì)胞的増殖，進(jìn)ー步地可以用作治療或診斷腫瘤的藥物或制劑。人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體則可用于制備所述人PAK7基因小分子干擾RNA。當(dāng)用作治療腫瘤的藥物或制劑時(shí)，是將安全有效量的人PAK7基因小分子干擾RNA施用于哺乳動(dòng)物。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。本發(fā)明第五方面，公開(kāi)了ー種人PAK7基因干擾慢病毒，由前述人PAK7基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝而成。該慢病毒可感染腫瘤細(xì)胞并產(chǎn)生人PAK7基因小分子干擾RNA，從而抑制腫瘤細(xì)胞的増殖。本發(fā)明第六方面，還公開(kāi)了一種藥物組合物，含有治療有效量的人PAK7基因小分子干擾RNA或人PAK7基因干擾慢病毒。進(jìn)ー步的，所述藥物組合物含有199wt%如前所述的人PAK7基因小分子干擾RNA或人PAK7基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。在制備這些組合物吋，通常將活性成分與賦形劑混合，或用賦形劑稀釋，或包在可以膠囊或藥囊形式存在的載體中。當(dāng)賦形劑起稀釋劑作用時(shí)，它可以是固體、半固體或液體材料作為賦形劑、載體或活性成分的介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑、丸剤、粉劑、溶液劑、糖漿劑、滅菌注射溶液等。合適的賦形劑的例子包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、等。制劑還可包括濕潤(rùn)劑、乳化剤、防腐劑(如羥基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味劑等。綜上所述，本發(fā)明設(shè)計(jì)了針對(duì)人PAK7基因的50個(gè)RNAi靶點(diǎn)序列，構(gòu)建相應(yīng)的PAK7RNAi載體，其中編碼序列SEQIDNO35的RNAi載體PAK7_aiRNA_pIasmid能夠顯著下調(diào)PAK7基因在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。使用慢病毒(lentivirus，簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)v)作為基因操作工具攜帶RNAi載體pGCSIL-GFP-PAK7-siRNA能夠靶向地將針對(duì)PAK7基因的RNAi序列高效導(dǎo)入人肺癌H1299細(xì)胞、胃癌SGC7901細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，降低PAK7基因的表達(dá)水平，顯著抑制上述腫瘤細(xì)胞的増殖能力。因此慢病毒介導(dǎo)的PAK7基因沉默是惡性腫瘤潛在的臨床非手術(shù)治療方式。本發(fā)明提供的SiRNA或者包含該SiRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人PAK7基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中PAK7基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。圖1表示pGCSIL-GFP質(zhì)粒DNA圖譜圖2表示PAK7shRNA慢病毒侵染5天后，與對(duì)照慢病毒侵染組相比，人肺癌H1299細(xì)胞、胃癌SGC7901細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中的PAK7mRNA的表達(dá)水平降低圖3表示PAK7shRNA慢病毒浸染人肺癌H1299細(xì)胞5天后，顯著抑制細(xì)胞増殖圖4表示PAK7shRNA慢病毒浸染人胃癌SGC7901細(xì)胞5天后，顯著抑制細(xì)胞増殖圖5表示PAK7shRNA慢病毒浸染膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞5天后，顯著抑制細(xì)胞増殖圖6使用PAK7抗體在腫瘤組織樣本上的免疫組化檢測(cè)結(jié)果。a為胃癌b、c為肺癌具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于PAK7相關(guān)的研究，認(rèn)為PAK7可能參與了惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。本發(fā)明涉及了一組針對(duì)人PAK7基因的小分子干擾RNA(SiRNA)序列、RNA干擾載體和RNA干擾慢病毒。選取人PAK7mRNA編碼區(qū)序列作為siRNA的靶位點(diǎn)，根據(jù)靶位點(diǎn)中連續(xù)的10-30(優(yōu)選15-27，更優(yōu)選19-2個(gè)堿基序列設(shè)計(jì)siRNA靶點(diǎn)序列。通過(guò)基因克隆，構(gòu)建表達(dá)上述siRNA的核酸構(gòu)建體，包裝表達(dá)上述siRNA的慢病毒。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，上述siRNA序列能夠特異性沉默人腫瘤細(xì)胞中內(nèi)源PAK7基因的表達(dá)。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，采用RNAi方法下調(diào)人PAK7基因的表達(dá)后可有效地抑制腫瘤細(xì)胞的増殖，這ー研究成果表明PAK7基因是原癌基因，可作為腫瘤治療的靶點(diǎn)。發(fā)明人進(jìn)ー步合成和測(cè)試了多種針對(duì)PAK7基因的siRNA，篩選出了可有效抑制PAK7的表達(dá)進(jìn)而抑制人肺癌H1299細(xì)胞、胃癌SGC7901細(xì)胞和膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞増殖和生長(zhǎng)的siRNA，在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。本發(fā)明提供了一系列干擾人PAK7基因的小干擾RNA(SiRNA)序列，構(gòu)建了可特異性沉默PAK7基因表達(dá)的慢病毒。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，針對(duì)人PAK7基因設(shè)計(jì)的小干擾RNA及RNAi慢病毒，穩(wěn)定并特異地下調(diào)PAK7基因的表達(dá)，并有效地抑制人腫瘤細(xì)胞的増殖。本發(fā)明表明PAK7基因可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)，有望成為腫瘤早期診斷和治療的靶點(diǎn)。而且，通過(guò)RNAi方式沉默PAK7基因的表達(dá)，可作為抑制腫瘤發(fā)展的有效手段。本發(fā)明的設(shè)計(jì)思路為本發(fā)明通過(guò)如下方法來(lái)篩選獲得ー種人PAK7基因RNAi慢病毒從Genbank中調(diào)取人PAK7基因序列；預(yù)測(cè)siRNA位點(diǎn)；合成針對(duì)PAK7基因的有效的siRNA序列，設(shè)計(jì)并合成靶序列的OligoDNA,退火形成雙鏈DNA(序列由正義鏈、反義鏈、反向互補(bǔ)序列和環(huán)組成)；慢病毒載體雙酶切后與雙鏈DNAOligo連接，構(gòu)建表達(dá)PAK7基因siRNA序列的RNAi質(zhì)粒；將RNAi質(zhì)粒和慢病毒包裝需要的輔助載體(PackingMix,Sigma-aldrich公司)共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞^3T，產(chǎn)生重組慢病毒顆粒，即可制得高效沉默ΡΑΚ7基因的慢病毒(ΡΑΚ7shRNA)?；谏鲜龇椒?，本發(fā)明提供了50個(gè)干擾PAK7基因的有效靶點(diǎn)(具體如SEQIDNO1-50所示)，構(gòu)建了特異干擾人PAK7基因的慢病毒。同時(shí)本發(fā)明還公開(kāi)ー種人PAK7基因RNAi慢病毒及其制備與應(yīng)用。本研究發(fā)現(xiàn)，利用慢病毒介導(dǎo)的RNAi方法，在降低PAK7基因在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)后，可以有效抑制腫瘤細(xì)胞的増殖。本研究表明，PAK7基因是ー個(gè)原癌基因，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞増殖，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中具有重要的生物學(xué)功能，PAK7基因可以為腫瘤治療的靶標(biāo)，慢病毒介導(dǎo)的PAK7基因特異性沉默可作為腫瘤治療的ー種新手段。下面結(jié)合實(shí)施例進(jìn)ー步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而非限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法及未說(shuō)明配方的試劑均為按照常規(guī)條件，如[美]Sambrook.J等著；黃培堂等譯。分子克隆試驗(yàn)指南，第三版。北京科學(xué)出版社2002中所述的條件或者制造商建議的條件進(jìn)行或配置。實(shí)施例1針對(duì)人PAK7基因RNAi慢病毒的制備1.篩選針對(duì)人PAK7基因的有效的SiRNA靶點(diǎn)從Genbank調(diào)取PAK7(NM_177990)基因信息；利用上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司的設(shè)計(jì)軟件Genechem設(shè)計(jì)針對(duì)PAK7基因的有效的siRNA靶點(diǎn)。在PAK7基因的編碼序列(CDQ區(qū)域內(nèi)，每隔ー個(gè)堿基起始獲得21個(gè)堿基的序列，表1列出了其中50條針對(duì)PAK7基因的有效siRNA靶點(diǎn)序列；通過(guò)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行進(jìn)行BLAST分析，確定其不對(duì)任何其它基因產(chǎn)生干擾作用。表1靶向于人PAK7基因的siRNA靶點(diǎn)序列權(quán)利要求1.人PAK7基因在制備或篩選腫瘤治療藥物，或者在制備腫瘤診斷藥物中的用途。2.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在干，所述的腫瘤為其腫瘤細(xì)胞的増殖與人PAK7基因的表達(dá)相關(guān)的任ー種腫瘤。3.如權(quán)利要求1所述的用途，其特征在干，所述的腫瘤選自肺癌、胃癌和膠質(zhì)瘤。4.一種分離的人PAK7基因小分子干擾RNA靶標(biāo)片段，其序列為SEQIDN0:l_50中任意一條序列。5.ー種人PAK7基因小分子干擾RNA，能夠特異性沉默人PAK7基因的表達(dá)。6.如權(quán)利要求5所述人PAK7基因小分子干擾RNA，其特征在干，所述人PAK7基因小分子干擾RNA以選自SEQIDNO1_50之任一的序列作為特異性沉默人PAK7基因表達(dá)的靶點(diǎn)序列。7.如權(quán)利要求5所述人PAK7基因小分子干擾RNA，其特征在干，所述人PAK7基因小分子干擾RNA包含正義RNA片段和反義RNA片段，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段互補(bǔ)，所述正義RNA片段含有SEQIDNO1-50中之任一序列編碼的RNA。8.如權(quán)利要求7所述人PAK7基因小分子干擾RNA，其特征在干，所述正義RNA片段和反義RNA片段的長(zhǎng)度均為15-27個(gè)核苷酸。9.如權(quán)利要求7所述人PAK7基因小分子干擾RNA，其特征在干，所述人PAK7基因小分子干擾RNA為發(fā)夾型單鏈RNA，所述正義RNA片段和所述反義RNA片段中間由莖環(huán)片段分隔。10.如權(quán)利要求9所述人PAK7基因小分子干擾RNA，其特征在干，所述莖環(huán)片段的序列選自以下任一UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CTCGAG、AAGCUU、CCACACC。11.如權(quán)利要求5所述人PAK7基因小分子干擾RNA，其特征在干，所述人PAK7基因小分子干擾RNA的序列為SEQIDNO:51。12.—種人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體，包含編碼權(quán)利要求5-11任ー權(quán)利要求所述人PAK7基因小分子干擾RNA的基因片段，能表達(dá)人PAK7基因小分子干擾RNA。13.如權(quán)利要求12所述人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在干，所述人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體為人PAK7基因干擾慢病毒載體。14.如權(quán)利要求13所述人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體，其特征在干，所述慢病毒載體選_:pLK0.1-pur。、pLKO.1-CMV-tGFP、pLKO.l-puro-CMV-tGFP、pLKO.I-CMV-Neo,pLKO.l-Neo、pLK0.l-Neo-CMV-tGFP、pLKO.l-puro-CMV-TagCFP、pLKO.1-puro-CMV-TagYFP、pLKO.1-puro-CMV-TagRFP,pLKO.トpuro-CMV_TagFP635、pLKO.トpuro-UbC-TurboGFP、pLKO.l-puro-UbC-TagFP635>pLKO—puro—IPTG—lxLacO、pLKO—puro—IPTG—3xLac0、pLPl、pLP2、pLP/VSV-G,pENTR/U6、pLenti6/BL0CK_iT_DEST、pLenti6-Gff/U6-laminshrna,pcDNAl.2/V5-GW/lacZ、pLenti6.2/N-Lumio/V5_DEST、pGCSIL-GFP或pLenti6.2/N-Lumio/V5-Gff/lacZ中的任一。15.ー種人PAK7基因干擾慢病毒，由權(quán)利要求12-14任ー權(quán)利要求所述人PAK7基因干擾慢病毒載體在慢病毒包裝質(zhì)粒、細(xì)胞系的輔助下，經(jīng)過(guò)病毒包裝而成。16.一種藥物組合物，含有治療有效量的權(quán)利要求5-11任ー權(quán)利要求所述人PAK7基因小分子干擾RNA或權(quán)利要求15所述人PAK7基因干擾慢病毒，以及藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。17.如權(quán)利要求16所述藥物組合物，其特征在干，所述藥物組合物用于治療腫瘤，所述的腫瘤為其腫瘤細(xì)胞的増殖與人PAK7基因的表達(dá)相關(guān)的任ー種腫瘤。18.如權(quán)利要求17所述藥物組合物，其特征在干，所述腫瘤為惡性腫瘤，選自肺癌、胃癌和膠質(zhì)瘤之任一。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了人PAK7基因的用途及其相關(guān)藥物。本發(fā)明公開(kāi)了人PAK7基因在腫瘤治療、腫瘤診斷及藥物制備中的用途。本發(fā)明還進(jìn)一步構(gòu)建了人PAK7基因小分子干擾RNA、人PAK7基因干擾核酸構(gòu)建體、人PAK7基因干擾慢病毒并公開(kāi)了他們的用途。本發(fā)明提供的siRNA或者包含該siRNA序列的核酸構(gòu)建體、慢病毒能夠特異性抑制人PAK7基因的表達(dá)，尤其是慢病毒，能夠高效侵染靶細(xì)胞，高效率地抑制靶細(xì)胞中PAK7基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，在腫瘤治療中具有重要意義。文檔編號(hào)C12N15/113GK102552937SQ20111042587公開(kāi)日2012年7月11日申請(qǐng)日期2011年12月19日優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日發(fā)明者孫琴,曹躍瓊,朱向瑩,瞿紅花,翁仕強(qiáng),譚暢,金楊晟申請(qǐng)人:上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司