專利名稱：一種耐氧化性淀粉酶突變體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種耐一種耐氧化性淀粉酶突變體及其制備方法，具體涉及一種耐氧化性淀粉酶突變體及其制備方法。
背景技術(shù)：
α-淀粉酶(EC 3.2. 1. 1)是一種降解淀粉的重要的工業(yè)用酶，主要應(yīng)用在食品、 紡織、醫(yī)藥、洗滌劑等領(lǐng)域。耐氧化性淀粉酶可用于紡織品退漿、洗滌劑添加劑以及以淀粉作粘結(jié)劑的粘度調(diào)節(jié)劑等。Horikoshi在1971年首先報(bào)道了產(chǎn)自嗜堿菌A-40-2的堿性淀粉酶。2007年Mxena等人篩選到一株可以產(chǎn)堿性淀粉酶的菌株。2010年P(guān)ancha φ (Pancha I， Jain D, ShrivastavA, Mishra S, Shethia B, Mishra S, VP Μ, Jha B. A thermoactive[alpha]-amylase from a Bacillus sp. isolated from CSMCRI saltfarm. International Journal of Biological Macromolecules, 2010,47 (2) :288-291.)篩選出一株產(chǎn)耐溫淀粉酶菌株。目前，國內(nèi)的前處理酶制劑市場基本被丹麥諾維信公司和美國杰能科公司所壟斷。諾維信公司介紹了一種淀粉酶，有較寬的PH及溫度范圍。具有耐化學(xué)氧化性的淀粉酶主要應(yīng)用于洗滌劑添加劑和紡織退漿一浴法等工業(yè)中。但耐氧化性淀粉酶的工業(yè)化生產(chǎn)并沒有報(bào)道。耐氧化性淀粉酶生產(chǎn)菌株的獲得主要通過篩選、誘變和酶分子改造獲得。篩選的盲目性較大，不容易獲得目的菌株。誘變包括自然突變和誘變，自然突變的幾率相當(dāng)小，誘變的工作量較大且不可控出現(xiàn)負(fù)突變的幾率較大。酶分子改造目的性強(qiáng)， 針對酶分子具體結(jié)構(gòu)分析進(jìn)行改造，達(dá)到耐氧化性的目的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種耐氧化性淀粉酶突變體，在SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中催化區(qū)域進(jìn)行蛋氨酸的突變。所述氨基酸的取代位點(diǎn)為淀粉酶催化區(qū)域周圍暴露在酶表面的第307個(gè)氨基酸蛋氨酸位點(diǎn)。所述氨基酸的取代位點(diǎn)為催化區(qū)域內(nèi)四個(gè)蛋氨酸位點(diǎn)，分別為第135位，第204 位，第219位，第237位。能表達(dá)生產(chǎn)權(quán)利要求1-3任一所述淀粉酶突變體的載體也屬于本發(fā)明要保護(hù)的范圍。能表達(dá)生產(chǎn)權(quán)利要求1-3任一所述淀粉酶突變體的細(xì)胞系或基因工程菌也屬于本發(fā)明要保護(hù)的范圍。本發(fā)明要保護(hù)的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種制備所述淀粉酶突變的方法，其技術(shù)方案如下1)根據(jù)嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)的淀粉酶序列(SEQ ID N0. 1)， 采用化學(xué)全合成的方法全合成后克隆到質(zhì)粒pET-22b(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAQ (圖1)；2)利用Swiss-model軟件對源自嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)的淀粉酶進(jìn)行模擬，獲得淀粉酶空間結(jié)構(gòu)；3)通過對淀粉酶空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，確定催化區(qū)域內(nèi)4個(gè)蛋氨酸殘基(M135， M204，M219，M237)及催化區(qū)域附近酶分子表面一個(gè)蛋氨酸殘基(Met307)(圖2)；4)針對已分析序列中不耐氧化的蛋氨酸位點(diǎn)(Met)設(shè)計(jì)引物，在引物中利用絲氨酸(Ser)的編碼堿基序列替代蛋氨酸(Met)編碼堿基，獲得用于突變的引物(表1)；5)利用設(shè)計(jì)的突變引物，對淀粉酶基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得含有突變淀粉酶序列的重組載體；6)將突變后重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得突變株。7)測定突變株表達(dá)淀粉酶的耐氧化性。本發(fā)明提供的淀粉酶突變體耐氧化性強(qiáng)，在500mM H2O2條件下40°C處理30min，酶活性殘留由原來的18%提高至92% ；相對于采用篩菌或誘變等手段，縮短了酶學(xué)性質(zhì)改造時(shí)間。將該耐氧化淀粉酶突變體應(yīng)用于紡織退漿、洗滌劑添加等領(lǐng)域，可以在強(qiáng)氧化環(huán)境下高效降解淀粉，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1 :pAAQ的質(zhì)粒圖譜。圖2 淀粉酶3D空間結(jié)構(gòu)。圖3 不同濃度H2A處理對淀粉酶穩(wěn)定性的影響。_:M135S ；K2:M204S ;_:M219S ； ES3 M237S ；隱:M307S ;Γ · WT (突變前)。圖4 :500mM H2O2環(huán)境下，不同處理時(shí)間對淀粉酶穩(wěn)定性的影響?！?:M135S ；· M204S ;▲ :M219S ；T:M237S ; :M307S ；〇WT(突變前)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 淀粉酶耐氧化性定點(diǎn)突變分析與方法通過對淀粉酶3D空間結(jié)構(gòu)(圖2)進(jìn)行分析，確定催化區(qū)域內(nèi)不耐氧化的Met殘基(M135，M204, M219，M237)。同時(shí)，對活性位點(diǎn)周圍其他在酶結(jié)構(gòu)分子表面的Met殘基進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，M307在淀粉酶酶分子表面，易被氧化劑氧化，造成淀粉酶活性降低或失活。根據(jù)嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)的淀粉酶序列，采用化學(xué)全合成的方法全合成后克隆到質(zhì)粒pET-22b(+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAQ(圖1)。針對不同Met位點(diǎn)的定點(diǎn)突變，設(shè)計(jì)相對應(yīng)定點(diǎn)突變引物(表1)。利用定點(diǎn)突變引物，淀粉酶進(jìn)行定點(diǎn)突變。采用PCR酶，利用突變引物對重組質(zhì)粒pAAQ進(jìn)行擴(kuò)增。將擴(kuò)增后片段利用膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。將獲得的純化后片段，采用磷酸化試劑盒對片段兩端進(jìn)行磷酸化。將磷酸化后的片段，利用連接酶進(jìn)行連接，獲得突變后的重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌宿主BL21，進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，獲得耐氧化性突變后的重組淀粉酶。表1淀粉酶突變引物序列突變淀粉酶引物序列(5’—3，)
M135SCCATCGTTCGGGTGCGG
M204STATCTGTCGGGTGAAGACGTTGAC T
M219SAGGAGTCGAAGGCGTGGG
M237STTTCGTTCGGACGCGATTGC
M307SCGGAGATTCGCGTTGGTGCGG實(shí)施例2 淀粉酶在不同濃度H2A條件下處理后殘留酶活力測定DNS法測定堿性淀粉酶酶活1)DNS試劑的配置稱取2. 5g 3，5_ 二硝基水楊酸溶于少量水中，加入0. 5g苯酚， 再溶解0. 075g亞硫酸鈉、2. 5g氫氧化鈉、50g酒石酸鉀鈉，將其轉(zhuǎn)入500mL容量瓶中搖勻定容，儲(chǔ)存于棕色瓶放置在4°C冰箱中待用。2)麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作配制0. 2g/L-l. Og/L不同濃度的麥芽糖溶液。取ImL 不同濃度的麥芽糖與同體積的DNS溶液混合，放入沸水浴中，水浴lOmin。用冷水冷卻，定容至10mL，A54tl測定吸光值。以麥芽糖的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。3)將2mL 1 %的可溶性淀粉加入到試管中，加入ImL的緩沖液，混勻，55°C預(yù)熱 5min,加入0. 4mL稀釋好的酶液，反應(yīng)5min。取Iml反應(yīng)液與同體積的DNS試劑混勻，沸水浴煮沸l(wèi)Omin，用冷水冷卻，定容至10ml，混勻后，以沒有加酶液但加入當(dāng)量的去離子水的反應(yīng)體系作為對照，測定A540吸光值。淀粉酶在不同H2A條件下處理后殘留酶活力測定采用不同濃度H2A(IOOmM, 200mM, 300mM, 400mM, 500mM)在 40°C處理 30min。利用過氧化氫酶(1200U/mL)進(jìn)行降解殘存H202。采用pH 10. O甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，將緩沖液與可溶性淀粉混勻，采用幻的方法測定淀粉酶處理后殘存酶活力(見圖:3)。M135，M204， M219, M237, M307 突變成 Ser 后，不同濃度 H2R (IOOmM, 200mM, 300mM, 400mM, 500mM)在 40°C 處理30min。在最高濃度條件500mM H2O2環(huán)境下處理后，酶活力殘留分別為處理前的88%， 92%，81 %，74%，60%。該淀粉酶耐氧化性獲得極大提高，在強(qiáng)氧化環(huán)境下可以高效降解淀粉。酶活力單位定義在pH 10. 0，溫度55°C，在Imin降解可溶性淀粉產(chǎn)生1 μ g還原物質(zhì)(以麥芽糖計(jì)算)所需要的酶量，為1個(gè)酶活單位(U)。實(shí)施例3 淀粉酶在500mM H2O2條件下處理不同時(shí)間殘留酶活力測定將耐氧化定點(diǎn)突變后的重組淀粉酶在500mM H2O2條件下40°C處理不同時(shí)間。采用過氧化氫酶(1200U/mL)進(jìn)行降解殘存H202。采用pH 10. O甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液，將緩沖液與可溶性淀粉混勻，采用幻的方法測定淀粉酶處理后殘存酶活力(見圖4)。M135， M204, M219, M237, M307 突變成 Ser 后，500mM 濃度 H2A 在 40°C處理 30min。處理 5h 后，酶活力殘留分別為處理前的63^,70^,54%,46%，56%。該淀粉酶耐氧化性獲得極大提高， 在強(qiáng)氧化環(huán)境下可以高效降解淀粉?？梢岳斫獾氖?，對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說，可以根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，而所有這些改變或替換都應(yīng)屬于本發(fā)明所附的權(quán)利要求的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求
1.一種耐氧化性淀粉酶突變體，其特征在于SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列中催化區(qū)域進(jìn)行蛋氨酸的突變。
2.權(quán)利要求1所述的淀粉酶突變體，其特征在于氨基酸的取代位點(diǎn)分別為第307個(gè)氨基酸蛋氨酸位點(diǎn)、第135位蛋氨酸位點(diǎn)、第204位蛋氨酸位點(diǎn)、第219位蛋氨酸位點(diǎn)、及第 237位蛋氨酸位點(diǎn)。
3.能表達(dá)生產(chǎn)權(quán)利要求1-2任一所述淀粉酶突變體的載體。
4.能表達(dá)生產(chǎn)權(quán)利要求1-2任一所述淀粉酶突變體的細(xì)胞系或基因工程菌。
5.權(quán)利要求1所述淀粉酶突變的的制備方法，其特征在于以嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)為出發(fā)菌珠，在對淀粉酶催化區(qū)域內(nèi)的單個(gè)或多個(gè)氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行突變，提高淀粉酶的耐氧化性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于具體步驟為1)根據(jù)嗜堿芽孢桿菌(Bacillusalcalophilus)的淀粉酶序列，采用化學(xué)全合成的方法全合成后克隆到質(zhì)粒pET-22b (+)中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pAAQ ；2)利用Swiss-model軟件對源自嗜堿芽孢桿菌的淀粉酶進(jìn)行模擬，獲得淀粉酶空間結(jié)構(gòu)；3)通過對淀粉酶空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，確定要要突變的蛋氨酸位點(diǎn)；4)設(shè)計(jì)的突變引物，對淀粉酶基因序列進(jìn)行定點(diǎn)突變，將蛋氨酸位點(diǎn)突變?yōu)榻z氨酸，獲得含有突變淀粉酶序列的重組載體；5)將突變后重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，誘導(dǎo)表達(dá)，獲得淀粉酶突變體。
7.權(quán)利要求1-3任一所述的淀粉酶在紡織退漿、洗滌劑、化工、食品領(lǐng)域的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐氧化性淀粉酶突變體及其制備方法，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明以嗜堿芽孢桿菌(Bacillus alcalophilus)JN21(CCTCC NOM 2011231)淀粉酶為母本，采用分子生物學(xué)技術(shù)對嗜堿芽孢桿菌淀粉酶序列進(jìn)行定點(diǎn)突變。在此改造條件下，嗜堿芽孢桿菌淀粉酶在500mM H2O2環(huán)境下40℃處理30min，酶活性殘留由對照(突變前)例的18％變?yōu)?2％.利用此策略可以大大提高淀粉酶的耐氧化性，為其在紡織退漿、洗滌劑添加劑等工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域提供了基礎(chǔ)。此策略對淀粉酶及其它酶的耐氧化性質(zhì)改造具有重要的指導(dǎo)意義。
文檔編號C12N15/56GK102533697SQ20111042557
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者劉龍, 堵國成, 李江華, 楊海泉, 陳堅(jiān) 申請人:江南大學(xué)