專利名稱：多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效評價方法及多態(tài)性檢測用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效評價方法及多態(tài)性檢測用試齊U盒。
背景技術(shù)：
多藥耐藥基因MDRl (ABCBl)為編碼各種藥劑的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，其限定了以地高辛為代表的各種藥劑的體內(nèi)動力學(xué)。一般認(rèn)為，外顯子26的第3435位的C置換為T的突變(C3435T突變)存在時， 源自MDRl基因的P糖蛋白的表達(dá)量變動，各種藥劑的體內(nèi)動力學(xué)改變(例如Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，2000 年，第 97 卷，第 7 號，p. 3473-3478)。已知源自MDRl基因的P糖蛋白的表達(dá)量也由于MDRl基因的外顯子21的第 2677位的G置換為A或T的突變(G2677A/T突變)而受影響。還已知上述C3435T突變和G2677A/T突變以高頻率同時發(fā)生。作為C3435T突變的檢測方法，已知有以下方法使用為了擴(kuò)增包含MDRl基因的外顯子26的第3435位的堿基的部分而設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行PCR，用能根據(jù)第3435位的堿基中有無突變來區(qū)分切斷與否的限制性酶進(jìn)行切斷，然后用電泳檢測是否切斷(PCR-RFIi^i)(例如=Genet. Mol. Res.，2010 年，第 9 卷，第 1 號，p. 34-40)。作為檢測C3435突變及G2677A/T突變的方法，已知有下述方法通過PCR-RFLP法檢測C3435突變，通過序列分析法檢測G2677A/T突變(例如Br. J. Clin. Pharmco 1. ,2005 年、第 59 卷、第 3 號、p. 365-370)?！矫妫阎邢率龇椒ㄔ谟肞CR法擴(kuò)增包含突變的區(qū)域后，使用用熒光染料標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行解鏈曲線分析，基于解鏈曲線分析的結(jié)果分析堿基序列的突變(例如 Clin. Chen.，2000 年，第 46 卷，第 5 號，p. 631-635，日本特開 2002-119291 號公報(bào))。已知有使用與上述同樣的核酸探針來檢測MDRl基因的外顯子26中C3435T突變的方法(例如日本特許4454366號公報(bào))。

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題在Genet. Mol. Res.，2010 年，第 9 卷，第 1 號，ρ· 34-40 及 Br. J. Clin. Pharmcol.， 2005年，第59卷，第3號，p. 365-370中記載的PCR-RFLP法中，需要在PCR反應(yīng)后取出擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行限制性酶處理。因此，有時擴(kuò)增產(chǎn)物有可能混入之后的反應(yīng)體系中，由此得到假陽性、假陰性的結(jié)果。并且，在PCR結(jié)束后，用限制性酶進(jìn)行處理，然后進(jìn)行電泳，因此，有時到檢測出為止所需要的時間也會非常長。另外，由于操作復(fù)雜，因此難以自動化。在日本特許4454366號公報(bào)中記載的技術(shù)中，即使能夠檢測MDRl基因的外顯子26 中的C3435T突變，也無法檢測MDRl基因的外顯子21中的G2677A/T突變。
本發(fā)明提供了能夠以高靈敏度簡便地檢測MDRl基因的外顯子21中的G2677A/T 突變的多態(tài)性檢測用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測方法及藥效評價方法以及多態(tài)性檢測用試齊U盒。用于解決問題的手段用于解決上述問題的具體方法如下所示。<1>MRD1基因的多態(tài)性檢測用探針，其包含選自包括下述Pl寡核苷酸及P2寡核苷酸的組中的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸，其中，(Pl)寡核苷酸，其具有與序列號2所示的堿基序列中包含第288 300位的堿基的堿基長為13 68的第一堿基序列互補(bǔ)的序列或與該互補(bǔ)序列同源的序列，所述寡核苷酸中與第288位的堿基互補(bǔ)的堿基用第一熒光染料標(biāo)記，(P2)寡核苷酸，其具有與序列號2所示的堿基序列中包含第300 305位的堿基的堿基長為6 93的第二堿基序列互補(bǔ)的序列或與該互補(bǔ)序列同源的序列，所述寡核苷酸中與第305位的堿基互補(bǔ)的堿基用第二熒光染料標(biāo)記。<2>如上述<1>所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，上述Pl寡核苷酸在從上述Pl寡核苷酸的3’末端起數(shù)第1 3位中的任意位置具有用上述第一熒光染料標(biāo)記的堿基，上述P2寡核苷酸在從上述P2寡核苷酸的5’末端起數(shù)第1 3位中的任意位置具有用上述第二熒光染料標(biāo)記的堿基。<3>如上述<1>或<2>所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，上述Pl寡核苷酸在上述 Pl寡核苷酸的3’末端具有用上述第一熒光染料標(biāo)記的堿基，上述P2寡核苷酸在上述P2寡核苷酸的5’末端具有用上述第二熒光染料標(biāo)記的堿基。<4>如上述<1>至<3>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，上述熒光標(biāo)記寡核苷酸與目標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與目標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度小或大。<5>如上述<1>至<4>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，上述熒光標(biāo)記寡核苷酸與標(biāo)記的序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未與標(biāo)記的序列雜交時的熒光強(qiáng)度小
<6>如上述<1>至<5>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，上述Pl寡核苷酸的堿基長為13 56，上述P2寡核苷酸的堿基長為6 29。<7>如上述<1>至<6>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，上述Pl寡核苷酸的堿基長為13 26，上述P2寡核苷酸的堿基長為6 23。<8>如上述<1>至<7>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，上述Pl寡核苷酸的堿基長為13 21，上述P2寡核苷酸的堿基長為6 18。<9>如上述<1>至<8>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，上述探針為用于解鏈曲線分析的探針。<10>如上述<1>至<9>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針，所述探針包含下述至少兩種熒光標(biāo)記寡核苷酸，所述至少兩種熒光標(biāo)記寡核苷酸中與序列號2所示的堿基序列的第300位的堿基互補(bǔ)的堿基互不相同且上述互補(bǔ)的堿基為C、T或A。< 11 >MDR1基因的多態(tài)性檢測方法，其使用上述< 1 >至< 10>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針。<12>如上述<11>所述的多態(tài)性檢測方法，包含
5
(I)使上述<1>至<10>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，使上述熒光標(biāo)記寡核苷酸及上述單鏈核酸雜交而得到雜交體；(II)通過改變包含上述雜交體的上述試樣的溫度，使上述雜交體解離，測定基于上述雜交體的解離的熒光信號的變動；(III)基于上述熒光信號的變動，評價雜交體的解離溫度的Tm值；和(IV)基于上述Tm值，確認(rèn)MDRl基因的多態(tài)性的存在。<13>如上述<11>或<12>所述的多態(tài)性檢測方法，還包括得到上述單鏈核酸的步驟，上述得到單鏈核酸的步驟包括在上述(1)之前或與(1)同時擴(kuò)增核酸。<14>如上述<11>至<13>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測方法，其還包括使能夠檢測序列號1所示的堿基序列的第256位的堿基的突變的多態(tài)性檢測用探針與上述試樣中的上述單鏈核酸接觸。<15>如上述<14>所述的多態(tài)性檢測方法，其中，上述能夠檢測序列號1所示的堿基序列的第256位的堿基的突變的多態(tài)性檢測用探針為具有與序列號1所示的堿基序列中從第248位的堿基開始9 50個堿基長的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的熒光標(biāo)記寡核苷酸。<16>藥劑的藥效評價方法，包括通過上述<11>至<15>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測方法，檢測MDRl基因中的多態(tài)性；和基于檢測的多態(tài)性的有無，對針對源自上述試樣的藥劑的耐受性或源自上述試樣的藥劑的藥效進(jìn)行評價。<17>多態(tài)性檢測用試劑盒，其包含上述<1>至<10>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針。<18>如上述<17>所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，其還包含能夠以序列號2所示的堿基序列中包含與上述Pl或P2寡核苷酸雜交的堿基序列的區(qū)域?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增的引物。<19>如上述<17>至<18>中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，其還包含具有與序列號1所示的堿基序列中從第248位的堿基開始的9 50個堿基長的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的熒光標(biāo)記寡核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，可以提供能夠以高靈敏度簡便地檢測MDRl基因的外顯子21中 G2677A/T突變的多態(tài)性檢測用探針、使用該探針的多態(tài)性檢測方法以及藥效評價方法及多態(tài)性檢測用試劑盒。


圖1 (A)是表示核酸混合物的解鏈曲線的一個示例的圖，以及圖1⑶是表示微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖2(A)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其不互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖2(B)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖3(A)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其不互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖3(B)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其不互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖4(A)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖4(B)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其不互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖。圖5(A)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其不互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖5(B)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和包含與其不互補(bǔ)的核酸及互補(bǔ)的核酸的核酸混合物的微分解鏈曲線的一個示例的圖。圖6(A)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和包含與其不互補(bǔ)的核酸及互補(bǔ)的核酸的核酸混合物的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖6(B)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和包含與其不互補(bǔ)的核酸及互補(bǔ)的核酸的核酸混合物的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖7(A)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和包含與其不互補(bǔ)的核酸及互補(bǔ)的核酸的核酸混合物的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖7(B)是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其不互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖8是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其不互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖9是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和與其互補(bǔ)的核酸的微分解鏈曲線的一個示例的圖；圖10是表示本發(fā)明的多態(tài)性檢測用探針和包含與其不互補(bǔ)的核酸及互補(bǔ)的核酸的核酸混合物的微分解鏈曲線的一個示例的圖。
具體實(shí)施例方式多態(tài)性檢測用探針本實(shí)施方式的多態(tài)性檢測用探針(以下，也簡稱為“探針”)，包括選自包括下述Pl 及P2的組中的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸(以下，也稱為“特定熒光標(biāo)記寡核苷酸”)。(Pl)寡核苷酸，其具有與序列號2所示的堿基序列中包含第288 300位的堿基的堿基長為13 68的第一堿基序列互補(bǔ)的序列或與該互補(bǔ)序列同源的序列，所述寡核苷酸中與第288位的堿基互補(bǔ)的堿基用第一熒光染料標(biāo)記，(P2)寡核苷酸，其具有與序列號2所示的堿基序列中包含第300 305位的堿基的堿基長為6 93第二堿基序列互補(bǔ)的序列或與該互補(bǔ)序列同源的序列，所述寡核苷酸中與第305位的堿基互補(bǔ)的堿基用第二熒光染料標(biāo)記。通過包含至少一種所述特定的熒光標(biāo)記寡核苷酸，能夠以高靈敏度簡便地檢測 MDRl基因的外顯子21的G2677A/T突變。序列號2所示的堿基序列為MDRl基因的外顯子21的部分堿基序列，MDRl基因的外顯子21中第2677位的堿基與序列號2所示的堿基序列的第300位的堿基對應(yīng)。序列號2所示的堿基序列的第300位的堿基在野生型(wild type)中為G(鳥嘌呤)，但在突變型中突變?yōu)锳 (腺嘌呤)或T (胸腺嘧啶)。在Pl寡核苷酸中，所謂“與第288位的堿基互補(bǔ)的堿基”是指相對序列號2所示的堿基序列中第288位的堿基G(鳥嘌呤)而言互補(bǔ)的堿基C(胞嘧啶)。此外，在本公開中，所謂相對某堿基序列而言“同源的序列，，是指與該堿基序列相似性為80%以上、更優(yōu)選為90%以上、進(jìn)一步優(yōu)選為95%以上的堿基序列。在Pl寡核苷酸中，與該熒光標(biāo)記互補(bǔ)的堿基C優(yōu)選存在于從3’末端起數(shù)第1 3位的任意位置，更優(yōu)選存在于3’末端。Pl寡核苷酸為能夠檢測序列號2所示的堿基序列的第300位堿基的多態(tài)性的探針。該堿基與MDRl基因的外顯子21的第2677位的堿基相應(yīng)，在野生型中為G，在突變型中為T或A。因此，與該堿基互補(bǔ)的Pl寡核苷酸中的堿基優(yōu)選為C、A或T。S卩，Pl寡核苷酸優(yōu)選包含選自包括(i)具有與野生型互補(bǔ)的互補(bǔ)序列的寡核苷酸、(ii)具有與⑴同源的序列的寡核苷酸、(iii)具有與突變型互補(bǔ)的互補(bǔ)序列的寡核苷酸、以及(iv)具有與(i)同源的序列的寡核苷酸的組中的至少一種。Pl寡核苷酸的堿基長為13 68，優(yōu)選為13 56，更優(yōu)選為13 26，進(jìn)一步優(yōu)選為13 21。通過該范圍的堿基長，例如使多態(tài)性檢測靈敏度進(jìn)一步提高。通過改變Pl寡核苷酸的堿基長，可以使Pl寡核苷酸與其互補(bǔ)序列形成的雜交體的解離溫度的Tm值成為期望的值。以下，將本發(fā)明中的Pl寡核苷酸的堿基序列的示例示于表1，但本發(fā)明并不限于這些。此外，在表1中一并示出序列號2的第300位的堿基為G、T及A的情況時的寡核苷酸和與各個熒光標(biāo)記寡核苷酸的雜交體的Tm值。這里，Tm信使用Meltcalc 99 free (http //www, meltcalc. com/),在設(shè)定條件為 Oligoconc「μ Ml 0. 2、Na eq. [mM]50 的條件下算出。[表 1]
權(quán)利要求
1.MRD1基因的多態(tài)性檢測用探針，其包含選自包括下述Pl寡核苷酸及P2寡核苷酸的組中的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸(Pl)寡核苷酸，其具有與序列號2所示的堿基序列中包含第288 300位的堿基的堿基長為13 68的第一堿基序列互補(bǔ)的序列或與該互補(bǔ)序列同源的序列，所述寡核苷酸中與第288位的堿基互補(bǔ)的堿基用第一熒光染料標(biāo)記，(P2)寡核苷酸，其具有與序列號2所示的堿基序列中包含第300 305位的堿基的堿基長為6 93的第二堿基序列互補(bǔ)的序列或與該互補(bǔ)序列同源的序列，所述寡核苷酸中與第305位的堿基互補(bǔ)的堿基用第二熒光染料標(biāo)記。
2.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl寡核苷酸在從所述Pl寡核苷酸的3’末端起數(shù)第1 3位中的任意位置具有用所述第一熒光染料標(biāo)記的堿基，所述P2寡核苷酸在從所述P2寡核苷酸的5’末端起數(shù)第1 3位中的任意位置具有用所述第二熒光染料標(biāo)記的堿基。
3.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl寡核苷酸在所述Pl寡核苷酸的3’末端具有用所述第一熒光染料標(biāo)記的堿基，所述P2寡核苷酸在所述P2寡核苷酸的5’末端具有用所述第二熒光染料標(biāo)記的堿基。
4.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與目標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未和目標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度小或大。
5.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述熒光標(biāo)記寡核苷酸與目標(biāo)序列雜交時的熒光強(qiáng)度比未和目標(biāo)的序列雜交時的熒光強(qiáng)度小。
6.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl寡核苷酸的堿基長為13 56，所述P2寡核苷酸的堿基長為6 29。
7.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl寡核苷酸的堿基長為13 26，所述P2寡核苷酸的堿基長為6 23。
8.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述Pl寡核苷酸的堿基長為13 21，所述P2寡核苷酸的堿基長為6 18。
9.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述探針為用于解鏈曲線分析的探針。
10.如權(quán)利要求1所述的多態(tài)性檢測用探針，其中，所述探針包含下述至少兩種熒光標(biāo)記寡核苷酸，所述至少兩種熒光標(biāo)記寡核苷酸中與序列號2所示的堿基序列的第300位的堿基互補(bǔ)的堿基互不相同且所述互補(bǔ)的堿基為C、T或A。
11.MDRl基因的多態(tài)性檢測方法，其中，所述方法包括使用權(quán)利要求1 10中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針。
12.如權(quán)利要求11所述的多態(tài)性檢測方法，所述方法包括(I)使所述多態(tài)性檢測用探針和試樣中的單鏈核酸接觸，使所述熒光標(biāo)記寡核苷酸和所述單鏈核酸雜交而得到雜交體；(II)通過改變包含所述雜交體的所述試樣的溫度，使所述雜交體解離，測定基于所述雜交體的解離的熒光信號的變動；(III)基于所述熒光信號的變動，評價雜交體的解離溫度的Tm值；和(IV)基于所述Tm值，確認(rèn)MDRl基因的多態(tài)性的存在。
13.如權(quán)利要求11所述的多態(tài)性檢測方法，還包括得到所述單鏈核酸的步驟，所述得到單鏈核酸的步驟包括在所述(1)之前或與(1)同時擴(kuò)增核酸。
14.如權(quán)利要求11所述的多態(tài)性檢測方法，還包括使能夠檢測序列號1所示的堿基序列的第256位的堿基的突變的多態(tài)性檢測用探針與所述試樣中的所述單鏈核酸接觸。
15.如權(quán)利要求14所述的多態(tài)性檢測方法，其中，所述能夠檢測序列號1所示的堿基序列的第256位的堿基的突變的多態(tài)性檢測用探針為具有與序列號1所示的堿基序列中從第248位的堿基開始9 50個堿基長的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的熒光標(biāo)記寡核苷酸。
16.藥劑的藥效評價方法，所述方法包括通過權(quán)利要求11所述的多態(tài)性檢測方法，檢測MDRl基因中的多態(tài)性；和基于檢測的多態(tài)性的有無，對針對源自所述試樣的藥劑的耐受性或源自所述試樣的藥劑的藥效進(jìn)行評價。
17.多態(tài)性檢測用試劑盒，其包含權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)所述的多態(tài)性檢測用探針。
18.如權(quán)利要求17所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，其還包含能夠以序列號2所示的堿基序列中包含與所述Pl或P2寡核苷酸雜交的序列的區(qū)域?yàn)槟０暹M(jìn)行擴(kuò)增的引物。
19.如權(quán)利要求17所述的多態(tài)性檢測用試劑盒，其還包含具有與序列號1所示的堿基序列中從第248位的堿基開始9 50個堿基長的堿基序列互補(bǔ)的堿基序列的熒光標(biāo)記寡核苷酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及多態(tài)性檢測用探針、多態(tài)性檢測方法、藥效評價方法及多態(tài)性檢測用試劑盒。具體地，本發(fā)明提供了MRD1基因的多態(tài)性檢測用探針，所述探針包含選自包括下述P1寡核苷酸及P2寡核苷酸的組中的至少一種熒光標(biāo)記寡核苷酸，(P1)寡核苷酸，其具有與序列號2所示的堿基序列中包含第288～300位的堿基的堿基長為13～68的第一堿基序列互補(bǔ)的序列或與該互補(bǔ)序列同源的序列，所述寡核苷酸中與第288位的堿基互補(bǔ)的堿基用第一熒光染料標(biāo)記，(P2)寡核苷酸，其具有與序列號2所示的堿基序列中包含第300～305位的堿基的堿基長為6～93的第二堿基序列互補(bǔ)的序列或與該互補(bǔ)序列同源的序列，所述寡核苷酸中與第305位的堿基互補(bǔ)的堿基用第二熒光染料標(biāo)記。
文檔編號C12N15/11GK102453766SQ20111042552
公開日2012年5月16日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月28日
發(fā)明者黑瀬熏 申請人:愛科來株式會社