專利名稱：單純皰疹病毒1型和2型同時檢測鑒定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種單純皰疹病毒1型和2型同時檢測鑒定方法。
背景技術(shù)：
單純皰疹病毒(herpes simplex virus, HSV)能引起人類多種疾病，如齦口炎 (gingivostomatitis)、角膜結(jié)膜炎(keratoconjunctivitis)、腦炎(encephalitis)以及生殖系統(tǒng)感染和新生兒的感染。在感染宿主后，常在神經(jīng)細胞中建立潛伏感染，激活后又會出現(xiàn)無癥狀的排毒，在人群中維持傳播鏈，周而復(fù)始的循環(huán)。單純皰疹病毒感染在我國非常普遍，發(fā)病率高，可通過胎盤及產(chǎn)道感染新生兒，導(dǎo)致流產(chǎn)及新生兒死亡，與宮頸癌的發(fā)生也有關(guān)，危害較大，因?qū)俨《靖腥?，又無特效療法，所以給人帶來很大痛苦。HSV分為1型(HSV-I)和2型(HSV-2)，兩者基因組的相似度大約在 50%，1型皰疹病毒主要通過呼吸道、皮膚和粘膜密切接觸傳播，主要感染腰以上部位的粘膜組織和器官。如引起口唇黏膜、鼻前庭、眼結(jié)膜、咽喉部的炎癥及皰疹，口和口周圍發(fā)生的皰疹，99%是由1型皰疹病毒引起的。2型皰疹病毒主要存在于女性宮頸、陰道、外陰皮膚及男性的陰莖、尿道等處，是引起生殖器發(fā)炎和皰疹的罪魁禍首，據(jù)有關(guān)資料表明，生殖器的病原體90%為2型皰疹病毒，僅10%為1型皰疹病毒。在治療方面，HSV-I引起的癥狀較輕，用藥后較易治療，所以有效的區(qū)分兩種病毒感染對臨床用藥有一定的指導(dǎo)意義。目前，臨床上對單純皰疹病毒的檢測方法分離培養(yǎng)是檢測HSV的金標準，但該方法操作十分繁瑣，且有一定的危險性，時間耗費長。臨床上常用ELISA和間接免疫熒光來檢測HSV的特異性抗體，但在疾病早期(即窗口期)無法檢測到病毒抗體，而且病毒抗體存在時間較長，治療成功后仍有抗體存在，在診斷方面會有一定的困擾，所以選擇核酸檢測是檢測病原體的最佳方法。研究證實，在生殖器潰瘍愈合過程中，熒光探針定量PCR檢測無癥狀排毒更為靈敏。因此，對于皰疹已結(jié)痂者，或無痂狀排毒的患者，用實時熒光定量PCR技術(shù)檢測單純皰疹病毒可作為首選。實時焚光定量 PCR 技術(shù)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction 簡稱Real Time PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)(HI⑶OHR， F0CKLERC, DOLLINGER G, et al. Kinetic PCR analysis :real-time monitoring of DNA amplification reactions [J]. Biotechnology, 1993,11 :1026 ；韓俊英，曾瑞萍.熒光定量 PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J],國外醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)分冊，2000，23 (3) :177.，在此全文引用作為參考， 如同全文敘述一樣)。在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，使每一個循環(huán)變得“可見”，最后通過Ct值和標準曲線對樣品中的DNA(OrcDNA)的起始濃度進行定量的方法。實時熒光定量PCR是目前確定樣品中DNA(或cDNA)拷貝數(shù)最敏感、最準確的方法。具有靈敏度和特異性高、能實現(xiàn)多重反應(yīng)、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，該技術(shù)在醫(yī)學(xué)臨床檢驗及臨床醫(yī)學(xué)研究方面有著重要的意義。目前，采用熒光定量PCR檢測技術(shù)可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、肝炎類病毒、人結(jié)核分枝桿菌、細小病毒B19、EB病毒和人巨細胞病毒等多種病原體進行測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點。本發(fā)明利用HSV-I和HSV-2的基因組差異，設(shè)計1對上游引物和下游引物，根據(jù)擴增的靶片段分別設(shè)計Taqman探針，并對兩條探針進行不同的熒光標記，實現(xiàn)了在同一反應(yīng)管中同時檢測HSV-I和HSV-2，并通過不同的熒光通道加以鑒別，擴增的同時可以直接在軟件上判讀結(jié)果，而不用跑電泳，避免了氣溶膠污染，在臨床上有更大的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
針對鑒定和檢測單純皰疹病毒需時間長和分型需要，及普通PCR容易造成氣溶膠污染的缺點，本發(fā)明提供了一種單純皰疹病毒1型和2型同時檢測或鑒定方法。具體的，一種同時鑒定或檢測單純皰疹病毒1型和2型的方法，包括采用如下引物及Taqman探針進行實時熒光定量PCR，所述引物包括上游引物HSV-F為 5，-GTCAGCGAGGATAACCTG-3，，下游引物 HSV-R 為 5，-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3，，為公用引物；1型單純皰疹病毒特異性探針HSV-IP序列為5’ -TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3，；2型單純皰疹病毒探針 HSV-2P 序列為 5，-CTTCGAGACCGCGGGTACGTAC-3，。優(yōu)選的，1型單純皰疹病毒的探針5’端標記FAM，3’端標記BHQ ；2型單純皰疹病毒的探針5，端標記J0E，3，端標記BHQ。本發(fā)明進一步提供鑒定或檢測單純皰疹病毒1型和2型的試劑盒，包含引物 HSV-F5，-GTCAGCGAGGATAACCTG-3，，引物 HSV-R 5，-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3，；探針 HSV -1P5，-TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3，，5，端標記 FAM，3，端標記 BHQ ；探針 HSV-2P5，-CTTCGAGA CCGCGGGTACGTAC-3，，5，端標記 J0E，3，端標記 BHQ。上述方法或試劑盒既可用于病毒純培養(yǎng)物的鑒定與檢測，用于科學(xué)研究等非疾病診斷的目的，也可用于臨床樣本的直接檢測。本發(fā)明利用單純皰疹病毒1型和2型之間的基因組差異，設(shè)計一對上游引物和下游引物，上下游引物均為公用引物。設(shè)計兩條Taqman探針分別針對1型和2型單純皰疹病毒，1型單純皰疹病毒的探針5’端標記FAM，3’端標記BHQ，2型單純皰疹病毒的探針5’端標記J0E，3’端標記BHQ。當樣品中只存1型單純皰疹病毒DNA時，反應(yīng)體系中的1型單純皰疹病毒檢測體系體系會進行擴增，在FAM通道有熒光信號出現(xiàn)，并有實時擴增曲線；當樣品中只存在2型單純皰疹病毒DNA時，反應(yīng)體系中2型單純皰疹病毒檢測體系會進行擴增， 在JOE通道有熒光信號出現(xiàn)，并有實時擴增曲線；當同時存在兩種病毒的DNA時，兩個體系會同時工作，在兩個通道都會出現(xiàn)實時擴增曲線，實現(xiàn)了在同一反應(yīng)管中同時檢測單純皰疹病毒1型和2型，并通過不同的熒光通道加以鑒別，擴增的同時可以直接在軟件上判讀結(jié)果，而不用跑電泳，避免了氣溶膠污染。


圖1HSV-I和HSV-2及HSV-F、HSV-R引物序列比對2Taqman探針技術(shù)工作原理圖3實時定量PCR擴增曲線
圖4針對HSV-I DNA模板的擴增曲線圖5針對HSV-2 DNA的擴增曲線圖6針對HSV-I DNA和HSV-2 DNA混合模板的擴增曲線圖7針對兩種系列稀釋模板的擴增曲線
具體實施例方式一種快速同時鑒別和檢測1型和2型單純皰疹病毒的方法。根據(jù)1型和2型單純皰疹病毒基因組DNA序列的差異，設(shè)計一對上游引物和下游引物，上下游引物均為公用引物。設(shè)計兩條Taqman探針分別針對1型和2型單純皰疹病毒，1型單純皰疹病毒的探針5’ 端標記FAM(6-羧基熒光素)熒光基團，3’端標記BHQ (Black hole quenchers)淬滅基團， 2型單純皰疹病毒的探針5’端標記JOE (2，7- 二甲基-4，5- 二氯-6-羧基熒光素)熒光基團，3’端標記BHQ。當樣品中只存1型單純皰疹病毒DNA時，反應(yīng)體系中的1型單純皰疹病毒檢測體系會進行擴增，在FAM通道有熒光信號出現(xiàn)，并有實時擴增曲線；當樣品中只存在2型單純皰疹病毒DNA時，反應(yīng)體系中2型單純皰疹病毒檢測體系會進行擴增，在JOE通道有熒光信號出現(xiàn)，并有實時擴增曲線；當同時存在兩種病毒的DNA時，兩個體系會同時工作，在兩個通道都會出現(xiàn)實時擴增曲線，從而實現(xiàn)對兩者的鑒別。本發(fā)明所提供的引物序列如下上游引物HSV-F為 5，-GTCAGCGAGGATAACCTG-3，(SEQ ID NO 1),下游弓| 物 HSV-R 為 5，-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3，(SEQ ID NO :2)，均為公用引物。1型單純皰疹病毒特異性 Taqman 探針 HSV-1P 序列為 5，-TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3，(SEQ ID NO 3) ；2 型單純皰疹病毒 Taqman 探針 HSV-2P 序列為 5，-CTTCGAGACCGCGGGTACGTAC-3，(SEQ ID NO 4)。反應(yīng)體系為模板5ul，IOXiTaq 酶 buffer 5ul,2. 5mM dNTP 4ul，濃度為 IOuM HSV-F引物2ul，濃度為IOuM HSV-R引物2ul，濃度為IOuM HSV-IP探針I(yè)ul，濃度為IOuM HSV-2P 探針 Iul，Taq 酶 2. 5U, ddH20 補至 50ul。PCR反應(yīng)條件為94°C 5min ；94°C 30s,60°C 40s，共40個循環(huán)；在熒光定量PCR儀上進行擴增，對FAM和JOE通道進行信號收集。如果是單通道實時熒光PCR儀可分管操作，兩個探針5’端均標記FAM熒光基團。下述實例中所用方法如無特殊說明均為常規(guī)方法，所合成的引物探針工作均由生工生物工程(上海)有限公司合成。引物探針的設(shè)計與合成根據(jù)Pub-Med中基因庫中所提供的1型和2型單純皰疹病毒的基因組序列進行比對，發(fā)現(xiàn)兩者基因組在核苷酸水平上可以達到50%以上的相似度，但二者同時也存在這差異，最終找到了一段比較理想的區(qū)域，位于HSV-I和HSV-2的glycoprotein D gene，兩者可以共用一對引物，但在探針上有所區(qū)別，根據(jù)探針的特異性可以將HSV-I和HSV-2區(qū)分開來。如圖1所示，深色區(qū)域為引物HSV-F和HSV-R與1型和2型單純皰疹病毒基因組序列對比圖，從圖中可以看出，這一對引物所在的區(qū)域HSV-I和HSV-2都是比較保守的，可以針對單純皰疹病毒進行通用擴增，但圖中框內(nèi)的區(qū)域兩者之間存在四個差異，這也是設(shè)計探針來區(qū)分兩者的依據(jù)。
TaqMan熒光探針的工作原理為PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5’ 3’ 外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離(如圖2)，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，形成擴增曲線(如圖3)?；谝陨纤?，熒光定量PCR可以避免氣溶膠污染，進行多重反應(yīng)。HSV-I和HSV-2的區(qū)分依賴于各自特異性探針上標記的熒光集團不同，可以采用不同的通道對熒光信號進行收集。當模板中只存在HSV-IDNA時，只有FAM通道可以收到熒光信號，形成擴增曲線；相反，當模板中只存在HSV-2 DNA時，只有JOE通道可以收集到熒光信號，形成擴增曲線；當兩種模板都存在時，兩個通道都會收到熒光信號，形成擴增曲線。通過在不同通道的熒光信號觀察到的熒光曲線來判斷模板中是HSV-I或/和HSV-2。實施例實驗材料HSV-1 (臨床株-測序驗證)，HSV-2 (臨床株-測序驗證)，Taq酶套裝 (Takara),引物，探針實驗儀器ABI7500 (熒光PCR儀)實驗方法1、體系構(gòu)建整個反應(yīng)體系如下表
權(quán)利要求
1.一種同時鑒定或檢測單純皰疹病毒1型和2型的方法，其特征在于包括采用如下引物及Taqman探針進行實時熒光定量PCR;所述引物包括上游引物HSV-F為 5，-GTCAGCGAGGATAACCTG-3，，下游引物 HSV-R 為 5，-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3，，均為公用引物；1型單純皰疹病毒特異性探針HSV-IP序列為5’ -TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3，；2型單純皰疹病毒探針 HSV-2P 序列為 5，-CTTCGAGACCGCGGGTACGTAC-3，。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于1型單純皰疹病毒的探針HSV-IP5’端標記 FAM, 3'端標記BHQ ；2型單純皰疹病毒的探針HSV-2P 5，端標記J0E，3，端標記BHQ。
3.鑒定或檢測單純皰疹病毒1型和2型的試劑盒，其包含引物 HSV-F5 ’ -GTCAGCGAGGATAACCTG-3，，引物 HSV-R 5 ’ -GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3 ’ ；探針 HSV -1P5，-TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3，，5，端標記 FAM，3，端標記 BHQ ；探針 HSV-2P5，-CTTCGAGA CCGCGGGTACGTAC-3，，5，端標記 J0E，3，端標記 BHQ。
4.權(quán)利要求1或2所述方法在病毒純培養(yǎng)物和臨床樣本的直接檢測方面的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求3所述試劑盒在病毒純培養(yǎng)物和臨床樣本的直接檢測方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種單純皰疹病毒1型和2型同時檢測鑒定方法。包括采用如下引物及Taqman探針進行實時熒光定量PCR，所述引物包括上游引物HSV-F為5’-GTCAGCGAGGATAACCTG-3’，下游引物HSV-R為5’-GTCCAGTCGTTTATCTTCAC-3’，為公用引物；1型單純皰疹病毒特異性探針HSV-1P序列為5’-TTGAGACCGCCGGCACGTAC-3’；2型單純皰疹病毒探針HSV-2P序列為5’-CTTCGAGACCGCGGGTACGTAC-3’。實現(xiàn)了在同一反應(yīng)管中同時檢測單純皰疹病毒1型和2型，并通過不同的熒光通道加以鑒別，擴增的同時可以直接在軟件上判讀結(jié)果，而不用跑電泳，避免了氣溶膠污染。
文檔編號C12Q1/68GK102373304SQ20111041251
公開日2012年3月14日 申請日期2011年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月12日
發(fā)明者不公告發(fā)明人 申請人:北京利德曼生化股份有限公司