牡蠣皰疹病毒i型檢測(cè)引物、方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類病原檢測(cè)領(lǐng)域，更具體涉及一種牡蠣皰疹病毒I型檢測(cè) 引物、方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 牡皰疹病毒1型（Ostreidherpesvirus1，OsHV-I)是感染雙殼類軟體動(dòng)物的 病毒。該病毒于1972年由Farley首次報(bào)道了美洲牡體內(nèi)的皰疹病毒感染。90年代從我 國(guó)北方養(yǎng)殖海區(qū)迅速傳播，扇貝累積死亡率高達(dá)90%以上，給扇貝養(yǎng)殖造成了巨大的損失。
[0003] 世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE)檢測(cè)方法主要有組織病理學(xué)方法、電子顯微鏡技術(shù)、聚 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)。這些檢測(cè)方法有些操作復(fù)雜，費(fèi)用高，有些技術(shù)條件要求高，有些方法 靈敏度不高，準(zhǔn)確性較低。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PolymeraseChainReaction，PCR)擴(kuò)增技術(shù) 作為最基本的基因擴(kuò)增技術(shù)，現(xiàn)在廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域，在病毒鑒定領(lǐng)域也 得到了廣泛的應(yīng)用。然而其擴(kuò)增結(jié)果受限于檢測(cè)對(duì)象的模板含量，當(dāng)模板量很少時(shí)，常常獲 得陰性結(jié)果。
[0004] 在貝類學(xué)領(lǐng)域，患病貝類體內(nèi)的病毒量通常很低，使用傳統(tǒng)的常規(guī)PCR檢測(cè)技術(shù) 通常由于其靈敏度不夠而出現(xiàn)假陰性結(jié)果，無(wú)法滿足水產(chǎn)養(yǎng)殖病害檢測(cè)的需要。巢式PCR 擴(kuò)增技術(shù)是一種建立在常規(guī)PCR技術(shù)上的新技術(shù)，其設(shè)計(jì)兩套PCR引物（巢式引物）對(duì)模 板進(jìn)行兩輪PCR擴(kuò)增反應(yīng)。在第一輪擴(kuò)增中，外引物用以產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物，以此擴(kuò)增產(chǎn)物作為 模板用內(nèi)引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。由于巢式PCR反應(yīng)有兩次PCR擴(kuò)增，從而降低了擴(kuò)增多個(gè) 靶位點(diǎn)的可能性（因?yàn)榕c兩套引物都互補(bǔ)的模板很少）因而增加了檢測(cè)的敏感性，同時(shí)又 有兩對(duì)PCR引物與檢測(cè)模板的配對(duì)，增加了檢測(cè)的可靠性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種牡蠣皰疹病毒I型檢測(cè)引物、方法與應(yīng)用,本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，方便 快捷，檢測(cè)限低，靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的特點(diǎn)。
[0006] 本發(fā)明是通過(guò)如下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的：
[0007] -種檢測(cè)牡蠣皰疹病毒1型的PCR引物，包括外引物PForl、PRevl和內(nèi)引物 PFor2、PRev2 ;
[0008] 所述PForl的序列為 5' -ATAGTATCACATTACCACCCG-3'，
[0009] 所述PRevl的序列為 5' -CAAITTGTATGCCTTCAGC-3' ；
[0010] 所述PFor2 的序列為 5' -GITCTATACCATACGACCTAC-3'，
[0011] 所述PRev2 的序列為 5' -TTGCGITCCGTGACTTCT-3'。
[0012] 本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)牡蠣皰疹病毒1型的巢氏PCR的試劑盒，包括上述引物 組。
[0013] 本發(fā)明提供一種快速檢測(cè)牡蠣皰疹病毒1型的巢氏PCR方法，包括如下步驟：
[0014] (1)分離樣本DNA
[0015] ⑵分別以步驟⑴的樣本DNA及陰性對(duì)照為模板，外引物組為引物進(jìn)行第一輪 PCR擴(kuò)增；再分別以第一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物及陽(yáng)性對(duì)照為模板，內(nèi)引物組為引物進(jìn)行第二輪 PCR擴(kuò)增；
[0016] (3)將第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳擴(kuò)增條帶情況判斷樣本是否感染 牡皰疹病毒1型。
[0017] 進(jìn)一步，所述外引物組PCR反應(yīng)體系：25yL反應(yīng)體系中IyL樣品DNA、2. 5yL的 10XPCR反應(yīng)緩沖液含：20mMTris-HCl,IOOmMKCl，3mMMgCl2、2yL濃度為2. 5mM的dNTPs、 〇? 5yL濃度為 25yM的PForUO. 5yL濃度為 25yM的Prevl、0. 5yL濃度為 5U/yL的 TaqDNA聚合酶、18yL的ddH20 ;PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min;94°C變性30sec、52°C退 火45sec、72°C延伸lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
[0018] 進(jìn)一步，所述內(nèi)引物組PCR反應(yīng)體系：25yL反應(yīng)體系中IyL外引物的擴(kuò)增產(chǎn)物、 2.5 1^的10\?〇?反應(yīng)緩沖液含：20禮！^8-11(：1，10011111((：1，311111%(：12、21^濃度為2.51111 的dNTPs、0. 5yL濃度為 25yM的PF0R2、0. 5yL濃度為 25yM的PREV2、0. 5yL濃度為 5U/ yL的TaqDNA聚合酶、18yL的ddH20 ;PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min;94°C變性30sec、 55°C退火45sec、72°C延伸45sec，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果：
[0020] 本發(fā)明檢測(cè)牡蠣皰疹病毒1型巢式PCR引物，提供一種檢測(cè)高致病性的貝類病毒 的分子檢測(cè)技術(shù)，尤其是能快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確的檢測(cè)病原的方法，能在8小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)。利 用本發(fā)明引物和方法對(duì)幾個(gè)疑似發(fā)病養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果為某發(fā)病毛蚶養(yǎng)殖場(chǎng)（死亡 率80%左右）的OsHV-I陽(yáng)性檢出率是100%，某發(fā)病扇貝養(yǎng)殖場(chǎng)（死亡率15%左右）的 OsHV-I陽(yáng)性檢出率是25%，某發(fā)病魁蚶養(yǎng)殖場(chǎng)（死亡率）的OsHV-I陽(yáng)性檢出率是30%。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1是檢測(cè)蝦夷扇貝牡蠣皰疹病毒1型的電泳圖，其中M-標(biāo)準(zhǔn)分子量，C-陰性對(duì) 照，1-陽(yáng)性蝦夷扇貝，2-陽(yáng)性蝦夷扇貝，3-陽(yáng)性蝦夷扇貝。
[0022] 圖2是本發(fā)明的巢氏PCR和OIE的常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增的電泳圖，其中M-標(biāo)準(zhǔn)分子 量，卜10 1DNAJ-IO2DNA、3-10 3DNA、4-10 4DNA、5-10 5DNA、6-10 6DNA、7-10 7DNA、8-10SDNA、 9-10 9DNAUO-IO10DNAUl-IO1DNAUS-IO2DNA、13-10 3DNA、14-10 4DNA、15-10 5DNA、C-陰性 對(duì)照，I一 10為巢氏PCR產(chǎn)物，11一 15為常規(guī)PCR產(chǎn)物。
[0023] 具體實(shí)施方法
[0024] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的操作進(jìn)行描述，所舉實(shí)施例只用于解釋本發(fā)明，并非 用于限定本發(fā)明的范圍。
[0025] 實(shí)例1采用本發(fā)明方法檢測(cè)蝦夷扇貝OsHV-I病毒。
[0026] 以感染的蝦夷扇貝為檢測(cè)對(duì)象，以未感染的蝦夷扇貝為陰性對(duì)照。
[0027] 引物序列如下：
[0028]所述PForl的序列為 5' -ATAGTATCACATTACCACCCG-3'，
[0029]所述PRevl的序列為 5' -CAAITTGTATGCCTTCAGC-3' ；
[0030]所述PFor2 的序列為 5' -GITCTATACCATACGACCTAC-3'，
[0031]所述PRev2 的序列為 5' -TTGCGITCCGTGACTTCT-3'。
[0032] 理論上擴(kuò)增出的目的條帶大小為669bp。
[0033] (1)樣品DNA的提?。喝∵m量瀕死蝦夷扇貝外套膜組織，用DNA提取試劑提取DNA。
[0034] (2)外引物PForl、Prevl的PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
[0035] ?0?反應(yīng)體系：25 1^反應(yīng)體系中11^樣品0嫩、2.5 1^的10\?0?反應(yīng)緩沖液含： 20mMTris-HCl，100mMKCl，3mMMgCl2、2yL濃度為 2.5mM的(1犯138、0.5 1^濃度為25 1^ 的PForI、0? 5yL濃度為 25yM的Prevl、0? 5yL濃度為 5U/yL的TaqDNA聚合酶、18yL 的ddH20。PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min;94°C變性30sec、52°C退火45sec、72°C延伸 lmin，35個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸lOmin。
[0036] (3)內(nèi)引物PF0R2、PREV2的PCR擴(kuò)增反應(yīng)：
[0037] 取外引物PForl、Prevl擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋100倍作為模板，以內(nèi)引物PF0R2、PREV2為 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)成分同第一次擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min;94°C變性 30sec、55°C退火45sec、72°C延伸45sec，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
[0038] (4)擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)與分析：1. 2% (W/V)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶并成像分 析。
[0039] (5)結(jié)果判定，如圖1所示：
[0040] A.當(dāng)檢測(cè)樣本和陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增條帶大小一致，為669bp時(shí)，結(jié)果為陽(yáng)性；
[0041] B.當(dāng)檢測(cè)樣本無(wú)條帶或條帶大小與陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增條帶大小不一致，不為669bp 時(shí)，結(jié)果為陰性。
[0042] 實(shí)施例2
[0043] 本實(shí)施例把蝦夷扇貝中的牡蠣皰疹病毒DNA分別稀釋成10 1UO 2、10 3、10 4、105、 106、107、10'109、10并用本發(fā)明的巢氏PCR和OIE的常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，試驗(yàn)結(jié)果表明 本發(fā)明的巢氏PCR比OIE的常規(guī)PCR敏感IO6倍，結(jié)果如圖2所示。
[0044] 本發(fā)明引物同樣可以檢測(cè)牡蠣、扇貝、毛蚶、魁蚶中的OsHV-I病毒，其檢測(cè)靈敏度 與蝦夷扇貝相同。以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本實(shí)施，凡在本發(fā)明的 精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種檢測(cè)牡蠣皰疹病毒1型的PCR引物，其特征在于它包括外引物PForUPRevl和 內(nèi)引物 PFor2、PRev2 ; 所述 PForl 的序列為 5' -ATAGTATCACATTACCACCCG-3'， 所述 PRevl 的序列為 5' -CAAITTGTATGCCTTCAGC-3' ； 所述 PFor2 的序列為 5' -GITCTATACCATACGACCTAC-3'， 所述 PRev2 的序列為 5' -TTGCGITCCGTGACTTCT-3'。2. -種快速檢測(cè)牡蠣皰疹病毒1型的巢氏PCR的試劑盒，其特征在于它包括權(quán)利要求 1所述的引物組。3. -種利用權(quán)利要求1所述引物快速檢測(cè)牡蠣皰疹病毒1型的巢氏PCR方法，其特征 在于它包括如下步驟： (1) 分離樣本DNA (2) 分別以步驟⑴的樣本DNA及陰性對(duì)照為模板，權(quán)利要求1所述的外引物組為引物 進(jìn)行第一輪PCR擴(kuò)增；再分別以第一輪PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物及陽(yáng)性對(duì)照為模板，權(quán)利要求1所述 內(nèi)引物組為引物進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增； (3) 將第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，根據(jù)電泳擴(kuò)增條帶情況判斷樣本是否感染牡蠣 皰疹病毒1型。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速檢測(cè)牡蠣皰疹病毒1型的巢氏PCR方法，其特征在 于所述外引物組PCR反應(yīng)體系：所述外引物組PCR反應(yīng)體系：25 y L反應(yīng)體系中I y L樣品 0嫩、2.5 1^的10\?0?反應(yīng)緩沖液含：2〇11111^18-11(：1，10〇11111((：1，311111%(：12、2 1^濃度為 2. 5mM 的 dNTPs、0. 5yL濃度為 25yM 的PForl、0. 5yL濃度為 25yM 的Prevl、0. 5yL濃度 為5U/ y L的TaqDNA聚合酶、18 y L的CldH2O ;PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性 30sec、52°C退火 45sec、72°C延伸 lmin，35 個(gè)循環(huán)；最后 72°C延伸 IOmin05. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種快速檢測(cè)牡蠣皰疹病毒1型的巢氏PCR方法，其特征 在于所述內(nèi)引物組PCR反應(yīng)體系：25yL反應(yīng)體系中I yL外引物的擴(kuò)增產(chǎn)物、2. 5yL的 IOXPCR反應(yīng)緩沖液含：20mM Tris-HCl, IOOmM KCl，3mM MgCl2、2yL濃度為2. 5mM的dNTPs、 〇? 5yL濃度為 25yM 的 PF0R2、0. 5yL濃度為 25yM 的 PREV2、0. 5yL濃度為 5U/yL 的 TaqDNA聚合酶、18yL的ddH20 ;PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性5min ;94°C變性30sec、55°C退 火45sec、72°C延伸45sec，30個(gè)循環(huán)；最后72°C延伸IOmin0
【專利摘要】一種牡蠣皰疹病毒I型檢測(cè)引物、方法與應(yīng)用，涉及水產(chǎn)養(yǎng)殖貝類病原檢測(cè)領(lǐng)域，它包括外引物PFor1、PRev1和內(nèi)引物PFor2、PRev2；本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，方便快捷，能在8小時(shí)內(nèi)完成檢測(cè)，且檢測(cè)限低，靈敏度高，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68
【公開(kāi)號(hào)】CN105087831
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510623544
【發(fā)明人】王雪鵬, 付天增, 龐曉茹, 韓風(fēng)杰, 李煜, 吳佳燕, 李啟蒙
【申請(qǐng)人】山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
【公開(kāi)日】2015年11月25日
【申請(qǐng)日】2015年9月25日