一種預(yù)防單純皰疹病毒ii型的疫苗的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于一種生物制品，具體涉及一種預(yù)防單純皰瘆病毒II型(HSV-2)的疫苗。
【背景技術(shù)】
[0002]生殖器皰瘆是目前世界上及我國沿海地區(qū)較為常見且發(fā)病率有逐漸增高趨勢(shì)的一種性傳播疾病，是由人類單純皰瘆病毒(HSV)通過性傳播感染泌尿生殖器及肛門部位皮膚黏膜而引起的。單純皰瘆病毒可分為1、2型，大多數(shù)生殖器皰瘆是由HSV-2感染所致，主要傳染源是生殖器皰瘆患者和無癥狀病毒攜帶者。HSV-2的感染是終身的，該病毒具有嗜神經(jīng)潛伏性，病毒可在人的骶尾神經(jīng)節(jié)內(nèi)建立終生潛伏。HSV-2潛伏性感染可因各種非特異性刺激活化而導(dǎo)致相關(guān)臨床癥狀的復(fù)發(fā)，如典型的生殖器皰瘆性損傷，或無癥狀排毒，從而重新具有傳染性。研宄者們發(fā)現(xiàn)HSV-2可以增加感染HIV的幾率。HSV-2可通過破損生殖器上皮為HIV-1募集活化的靶細(xì)胞和破壞黏膜朗格漢斯細(xì)胞功能。HIV患者感染HSV-2可以增加其生殖道HIV的釋放和加速HIV疾病的進(jìn)程。相反，感染HIV可以增加HSV-2的釋放頻率和數(shù)量。目前臨床試驗(yàn)表明抗病毒藥物治療不能減少由HSV-2引起的感染HIV的風(fēng)險(xiǎn)或傳播HIV的風(fēng)險(xiǎn)，也不能完全抑制HSV-2的釋放。
[0003]鑒于目前抗病毒藥物無法控制HSV-2的潛伏和復(fù)發(fā)以及由其導(dǎo)致的感染HIV和傳播HIV的風(fēng)險(xiǎn)，研宄者大多寄希望于疫苗。在過去的幾十年里，研宄者們?cè)谘邪l(fā)HSV-2疫苗方面做了大量的工作，然而收獲甚微。近幾十年來世界各國HSV疫苗的研宄結(jié)果表明，傳統(tǒng)的滅活疫苗和亞單位疫苗免疫原性弱，僅能誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答，細(xì)胞免疫誘導(dǎo)效果較差；減毒活病毒疫苗雖然可以誘導(dǎo)機(jī)體的免疫應(yīng)答但是有逆轉(zhuǎn)的風(fēng)險(xiǎn)。單純皰瘆病毒的免疫應(yīng)答過程中，細(xì)胞免疫和粘膜免疫發(fā)揮著更大的作用，但上述幾類疫苗均不能有效誘導(dǎo)細(xì)胞免疫和粘膜免疫應(yīng)答，因此，到目前為止，尚無可以在臨床上應(yīng)用的疫苗上市，單純皰瘆病毒疫苗基本上都處于臨床前或臨床研宄階段。
[0004]新型DNA疫苗使外源基因在活體內(nèi)表達(dá)，產(chǎn)生的抗原能夠激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，在抗感染性疾病和抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。DNA疫苗既具有減毒疫苗的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又無逆轉(zhuǎn)的危險(xiǎn)，還可以通過各種免疫佐劑加強(qiáng)免疫效果。DNA疫苗在免疫應(yīng)答中能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，并應(yīng)用在小鼠、綿羊、雞、猴和黑猩猩等多種動(dòng)物身上均獲得成功，但是它在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中的效率相對(duì)較低，影響了它的實(shí)際應(yīng)用，因此尋找能夠提高核酸疫苗免疫效率的分子是亟需解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種預(yù)防單純皰瘆病毒II型的疫苗。
[0006]上述發(fā)明目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:一種預(yù)防單純皰瘆病毒II型的疫苗，包括真核表達(dá)質(zhì)粒和重組質(zhì)粒，真核表達(dá)質(zhì)粒和重組質(zhì)粒以2:1的質(zhì)量比混合；所述真核表達(dá)質(zhì)粒為含全長(zhǎng)的糖蛋白D基因的pcDNA3-Kan質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒為含如SEQ ID N0.1所示的基因序列的pcDNA3-Kan質(zhì)粒。
[0007]本發(fā)明的有益效果:較之DNA疫苗免疫效率低的特點(diǎn)，本發(fā)明引入SEQ ID N0.1所示的基因序列的重組質(zhì)粒輔佐HSV-2 gD DNA疫苗，有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液免疫應(yīng)答，構(gòu)建機(jī)體抵抗HSV-2感染的第一道防線，降低發(fā)病率；激發(fā)細(xì)胞免疫應(yīng)答，構(gòu)建機(jī)體的第二道防線，可以更好的清除感染病毒。
[0008]【附圖說明】:
圖1小鼠血清抗gD IgG抗體水平結(jié)果圖。
[0009]圖2小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力結(jié)果圖。
[0010]圖3小鼠外周血⑶4+和⑶8+T細(xì)胞百分率結(jié)果圖。
[0011]圖4小鼠血清中趨化因子RANTES含量結(jié)果圖。
[0012]圖5小鼠外周血分泌IFN-γ和IL-4 T細(xì)胞百分率結(jié)果圖。
[0013]圖6致死量HSV-2病毒感染后小鼠的存活率結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
[0015]實(shí)施例1:真核表達(dá)質(zhì)粒的獲得
利用分子生物學(xué)技術(shù)PCR法、酶切、連接及克隆篩選將載體pcDNA3上原有抗性氨芐霉素(Amp)替換成卡那抗性(Kan)后，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒載體pcDNA3_Kan。PCR法擴(kuò)增HSV-2sav株糖蛋白D全基因序列(gD)，克隆重組后獲得含gD的重組質(zhì)粒pcDNA-Kan/gD，該重組質(zhì)粒pcDNA-Kan/gD及其具體的制備方法已與“何方等中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(6):997-999”中公開。
[0016]實(shí)施例2:重組質(zhì)粒的獲得
取活化的T細(xì)胞，用Rneasy Mini Kit (QIAGEN)提取總RNA，以O(shè)ligod(T)n為引物，逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。參照NCBI核酸數(shù)據(jù)庫收錄的編號(hào)為BCl 19225.1序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以合成的cDNA為模板，擴(kuò)增獲得SEQ ID N0.1。上游引物序列為5'~GCCGAATTCATGATAGAAACATACAGCCAACCT-3 ’，下游引物序列為 5 ’ -GACCTCGAGTCAGAGTTTGAGTAAGCCAAAAGA-3 ’。
[0017]將SEQ ID N0.1所示的基因序列和pcDNA3_Kan用EcoRI和Xho I雙酶切后切膠純化回收?；厥账闷?，以1:5摩爾濃度在T4連接酶作用下進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5 α的感受態(tài)菌株中，次日挑取中等大小的白色菌落接種于含Kan抗性的LB培養(yǎng)液中搖振過夜，抽提后得到重組質(zhì)粒。
[0018]上述用于構(gòu)建卡那霉素抗性的pcDNA3質(zhì)粒購自Invitrogen公司，序列和物理圖譜見該公司的產(chǎn)品目錄。HSV-2型病毒是HSV-2 sav株。
[0019]實(shí)施例3:將實(shí)施例1和2獲得的質(zhì)粒用于免疫小鼠 1.實(shí)驗(yàn)材料:
I)將實(shí)施例1和2獲得的質(zhì)粒分別在E.coli中擴(kuò)增，用QIAGEN純化試劑盒純化。用紫外分光光度法測(cè)定質(zhì)粒的濃度和純度，DNA的濃度和純度通過0D260和0D280確定，選取0D260/0D280比值在1.8-2.0的質(zhì)粒DNA去免疫小鼠。兩種質(zhì)粒分別于_20°C低溫凍存，免疫小鼠前解凍并根據(jù)質(zhì)量比2:1將兩種質(zhì)粒混合。
[0020]2)凍存HSV-2病毒sav3反復(fù)凍融三次。離心后取上清加入到單層Vero細(xì)胞上，37°C孵育lh。去掉病毒液體，加入4%FBS DMEM完全培養(yǎng)基，35°C培養(yǎng)24-48h。貼壁細(xì)胞用細(xì)胞刮板刮下，加入lml/bottle DMEM不完全培養(yǎng)液重懸后，-80°C凍存。倍比稀釋的HSV-2病毒懸液腹腔感染小鼠200 μ L/只，每天記錄小鼠死亡數(shù)，觀察兩周，計(jì)算半數(shù)致死量(median lethal dose，LD50)。
[0021]3)選取48只18-22g清潔級(jí)BALB/c雌性小鼠，隨機(jī)分4組。分別為pcDNA3_Kan(A組)、pcDNA3-Kan+實(shí)施例1獲得的質(zhì)粒(B組)、將實(shí)施例1和2獲得的質(zhì)粒按照質(zhì)量比2:1混合(C組)和實(shí)施例1獲得的質(zhì)粒(D組)。
[0022]2.實(shí)驗(yàn)方法 (O免疫及攻毒方案
免疫劑量:小鼠后腿肌內(nèi)注射10yL/只，隔3周加強(qiáng)免疫I次，共免疫兩次，劑量相同。加強(qiáng)