專利名稱：一種根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機(jī)酸領(lǐng)域，特別涉及富馬酸的生產(chǎn)方法。
背景技術(shù)：
富馬酸，又名反丁烯二酸，延胡索酸，是一種重要的有機(jī)基本化工原料和精細(xì)化工產(chǎn)品，廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工、涂料、樹脂、增塑劑等領(lǐng)域。食品級(jí)富馬酸是口味純正的酸味劑，用于生產(chǎn)汽水、果汁、冰淇淋和水果糖，對(duì)白面包、蔬菜、水果、鮮肉等食品還具有很好的防霉效果。飼料級(jí)富馬酸及其酯類用作酸性防腐劑，可提高飼料的適口性和利用效率。工業(yè)級(jí)富馬酸用于生產(chǎn)不飽和樹脂和醇酸樹脂，以及作生產(chǎn)電泳漆的原料。此外，富馬酸和脂肪醇在硫酸催化劑作用下進(jìn)行酯化反應(yīng)，可以生成富馬酸脂，其中富馬酸二甲酯是一種新型防腐防霉劑，具有高效、低毒、廣譜抗菌的功能。富馬酸還是生產(chǎn)L-天冬氨酸的原料。當(dāng)前工業(yè)上主要采用順酐異構(gòu)法生產(chǎn)富馬酸，其他可以用來(lái)生產(chǎn)富馬酸的工藝還包括糠醛氧化法、馬來(lái)酸酶催化異構(gòu)法、石蠟發(fā)酵法以及生物質(zhì)原料發(fā)酵法等，其中順酐異構(gòu)法、馬來(lái)酸酶催化異構(gòu)法及石蠟發(fā)酵法采用的原料均為石油基產(chǎn)品，隨著石油的枯竭及油價(jià)的大幅上漲，這些工藝不符合當(dāng)前可持續(xù)發(fā)展的要求，且產(chǎn)品的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力越來(lái)越差，而且市場(chǎng)上馬來(lái)酸的價(jià)格普遍高于富馬酸顯然用馬來(lái)酸異構(gòu)法生產(chǎn)富馬酸很不劃算。 糠醛氧化法的原料雖說(shuō)可以來(lái)自生物質(zhì)原料，但該工藝的產(chǎn)品收率低、催化劑毒性大，不符合當(dāng)前綠色環(huán)保的時(shí)代要求。正是由于這些原因，使得以可再生生物質(zhì)為原料發(fā)酵生產(chǎn)包括富馬酸在內(nèi)的各種平臺(tái)化合物成為各國(guó)政府今后發(fā)展的重點(diǎn)方向之一。當(dāng)前研究富馬酸發(fā)酵主要生產(chǎn)菌株是根霉菌，根霉菌具有營(yíng)養(yǎng)需求簡(jiǎn)單、生長(zhǎng)迅速及環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，從而使其成為重點(diǎn)研究對(duì)象，包括米根霉(Miizopus oryzae)、少根根霉(Rhizopus arrhizus)以及漂根霉(Rhizopus nigricans)等。其中，根霉(包括少根根霉和米根霉)是富馬酸發(fā)酵研究最多的菌種。當(dāng)前研究根霉富馬酸發(fā)酵的主要碳源是葡萄糖。根霉的糖化能力很強(qiáng)，可以100%降解淀粉為葡萄糖，工業(yè)上常把根霉作為釀酒的固體曲。目前，利用根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)有機(jī)酸的報(bào)道主要是L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)，目前人們?nèi)粤?xí)慣于采用葡萄糖作為原料發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸的報(bào)道，習(xí)慣上認(rèn)為采用淀粉質(zhì)原料發(fā)酵生產(chǎn)難以進(jìn)行導(dǎo)致富馬酸生產(chǎn)中沒(méi)有采用淀粉質(zhì)原料進(jìn)行生產(chǎn)。一般利用淀粉質(zhì)原料作為碳源，由于在發(fā)酵過(guò)程中，根霉游離細(xì)胞發(fā)酵的關(guān)鍵是發(fā)酵過(guò)程中的菌體形態(tài)， 普通攪拌式反應(yīng)器發(fā)酵，很難維持小菌球形態(tài)，存在著菌體結(jié)團(tuán)聚集的現(xiàn)象，不利于發(fā)酵過(guò)程中的傳質(zhì)傳氧。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，該方法采用未經(jīng)處理的淀粉質(zhì)原料作為碳源發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸，具有富馬酸的產(chǎn)量高，原料轉(zhuǎn)化率高，成本低廉，步驟簡(jiǎn)捷，環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。
本發(fā)明方法，包括以下步驟培養(yǎng)制備的根霉小菌球轉(zhuǎn)接入氣升式發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為淀粉質(zhì)原料。所述碳源為木薯粉、紅薯粉、土豆粉、玉米粉或稻米粉；所述木薯粉、紅薯粉、土豆粉、玉米粉、稻米粉由原料直接粉碎得到。所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為淀粉70-85g/L，尿素0. 03_05g/L，KH2PO4O-L 55g/L， MgSO4 · 7H20 0-0. 5g/L, ZnSO4 · 7H20 0-0. 025g/L, FeSO4O-O. 005g/L，碳酸鈣 0_40g/L，pH 在 5-6。所述根霉包括少根根霉或米根霉。所述少根根霉包括CGMCC No 5188及其他少根根霉。一種用于直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的根霉菌，所述根霉為少根根霉 (Rhizopusarrhizus) RH-07-13，保藏編號(hào) CGMCC No 5188。用于直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的少根根霉CGMCC 5188在發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸中的應(yīng)用。所述發(fā)酵培養(yǎng)方法如下在氣升式發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，裝入發(fā)酵罐體積30-70% 的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1-20 %，發(fā)酵的pH為5-6，發(fā)酵溫度定為28-32°C，通氣量為 l-2vvm，發(fā)酵周期為 150-168h。發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積0. 2%的大豆油，作為消泡劑，根霉小菌球培養(yǎng)制備方法如下(1)制備根霉孢子懸浮液；用無(wú)菌水將所斜面培養(yǎng)獲得的根霉孢子洗脫下來(lái)，用濾紙(孔徑20 μ m)過(guò)濾菌絲，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子稀釋為約107mL，即得孢子懸浮液；(2)接種培養(yǎng)制備小菌球?qū)㈡咦討腋∫航臃N到種子培養(yǎng)基中；接種量為20%，控制轉(zhuǎn)速180rpm，30°C培養(yǎng) 24h后，形成小菌球。所述的種子培養(yǎng)基的組成為葡萄糖30g/L，尿素1. 5g/L，KH2PO4O. 6g/L， MgSO4 · 7Η200· 5g/L, ZnSO4 · 7H20 1. 76mg/L, FeSO4O. 498mg/L, pH 2. 5。斜面培養(yǎng)基組成為甘油20g/L，瓊脂粉20g/L，酵母浸粉3g/L，麥芽浸粉3g/L，牛肉膏蛋白胨3g/L。本發(fā)明方法可以使用根霉類菌實(shí)現(xiàn)本發(fā)明方法，具備發(fā)酵產(chǎn)富馬酸的根霉都可利用淀粉質(zhì)原料直接發(fā)酵生產(chǎn)富馬酸。本發(fā)明所提供的少根根霉(lihizopus arrhizuS)RH-07-13，該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 5188，保藏地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101。保藏日期2011年8 月31日。該菌株為原始菌株經(jīng)紫外線-氯化鋰兩次誘變所得。原始菌株(CGMCC3. 2699) 購(gòu)自中科院微生物所。菌株特征少根根霉菌落成棉絮狀，起初白色，菌落成棉絮狀，起初白色，老后灰褐色，假根極不發(fā)達(dá)或沒(méi)有。孢囊梗直立或彎曲，單生，不分枝或分枝，壁光滑，淡褐色至黃褐色。孢子囊球形或近球形，壁有微刺，黃褐色或暗褐色。此菌有的菌系有很強(qiáng)的糖化力，可以100%降解淀粉，可用作釀酒的固體曲。菌株誘變過(guò)程簡(jiǎn)述(1)制備少根根霉孢子懸浮液，孢子濃度約107mL.(2)將孢子懸浮液紫外線照射不同時(shí)間，涂于LiCl平板，進(jìn)行LiCl化學(xué)誘變，培養(yǎng) 24-48h.(3)初篩將在LiCl平板上生長(zhǎng)的單菌落挑出，接入溴甲酚綠平板，培養(yǎng)M-4 !。 挑出透明圈直徑與菌落直徑之比較大的菌株，保存。(4)復(fù)篩初篩得到的菌落刮取孢子制備孢子懸浮液，依次進(jìn)行種子培養(yǎng)、發(fā)酵培養(yǎng)、發(fā)酵液預(yù)處理、HPLC測(cè)產(chǎn)。有益效果本發(fā)明采用氣升式發(fā)酵罐，控制發(fā)酵操作條件，消除了常規(guī)攪拌發(fā)酵罐存在的菌球狀菌絲體出現(xiàn)聚集結(jié)塊現(xiàn)象。以及大團(tuán)塊狀菌絲團(tuán)內(nèi)外傳質(zhì)傳氧不均，發(fā)酵效率低下。氣升式發(fā)酵罐中，由于沒(méi)有攪拌槳，剪切力小，發(fā)酵液自上而下循環(huán)流動(dòng)，接入的小菌球，不容易出現(xiàn)聚集現(xiàn)象，整個(gè)發(fā)酵液菌球分散均勻，發(fā)酵效率高。本發(fā)明采用種子培養(yǎng)形成菌球，發(fā)酵培養(yǎng)產(chǎn)酸的兩步發(fā)酵方式，利用小菌球狀少根根霉直接發(fā)酵木薯粉生產(chǎn)富馬酸，獲得了較高的產(chǎn)量和產(chǎn)率。本發(fā)明方法利用實(shí)驗(yàn)室選育的根霉及商業(yè)化根霉菌株直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料，生產(chǎn)富馬酸，通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化得到最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成。通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧狀況得到最高的富馬酸產(chǎn)量，并通過(guò)氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了放大發(fā)酵。發(fā)酵產(chǎn)物富馬酸的最終濃度和產(chǎn)率較高，本發(fā)明方法除具有富馬酸產(chǎn)量高之外，還具有成本降低，工藝簡(jiǎn)捷，與環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。有益效果本發(fā)明方法利用實(shí)驗(yàn)室保存的根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料，生產(chǎn)富馬酸，通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化得到最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)基組成。通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溶氧狀況得到最高的富馬酸產(chǎn)量， 并通過(guò)氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)，富馬酸的最終濃度和產(chǎn)率較高，以100g/L的葡萄糖為碳源，富馬酸的產(chǎn)量可達(dá)39. 40g/L，產(chǎn)率為0. 394g/g ；以84. 14g/L的木薯粉為碳源，富馬酸的產(chǎn)量可達(dá)49. 88g/L，產(chǎn)率達(dá)0. 593g/g。本發(fā)明方法除具有富馬酸產(chǎn)量高之外，還具有成本降低， 工藝縮短，與環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。利用根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料(例如，木薯粉)，可以免去常規(guī)發(fā)酵時(shí)，對(duì)淀粉質(zhì)原料進(jìn)行的糖化預(yù)處理過(guò)程，簡(jiǎn)化了生產(chǎn)工藝。另外，利用廉價(jià)的淀粉質(zhì)原料作為碳源，降低了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但這些實(shí)例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實(shí)驗(yàn)材料一、培養(yǎng)基(I)YPD斜面培養(yǎng)基
甘油20g/L，瓊脂粉20g/L，酵母浸粉3g/L，麥芽浸粉3g/L，牛肉膏蛋白胨3g/L。(2)種子培養(yǎng)基葡萄糖 30g/L,尿素 1. 5g/L，KH2PO4O. 6g/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L， ZnSO4 · 7H20 1. 76mg/L, FeSO4O. 498mg/L。pH 2. 5。(3)發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉質(zhì)原料 70-85g/L,尿素 0. 03_05g/L，KH2PO4O-L 55g/L， MgSO4 · 7Η200-0· 5g/L, ZnSO4 · 7Η20 0-0. 025g/L, FeSO4O-O. 005g/L，碳酸鈣 0_40g/L，pH 在 5-6。消泡劑大豆油0.2%菌株少根根霉(Rhizopusarrhizus)RH-07-13, CGMCC No. 5188。實(shí)施例1以裝液量50mL/250mL的三角瓶發(fā)酵為例，少根根霉R. arrhizus NRRL 15 直接發(fā)酵可溶性淀粉生產(chǎn)富馬酸的工藝如下1.根霉孢子的制備將根霉劃線接種于YPD斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5-6天，待孢子完全覆蓋白色菌絲， 即得。2.少根根霉孢子懸浮液的制備在無(wú)菌條件下，用無(wú)菌水將所制備的根霉孢子洗脫下來(lái)，用濾紙(孔徑20 μ m)過(guò)濾菌絲，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子密度稀釋控制為約107mL，即得孢子懸浮液。3.小菌球種子的制備采用250mL的三角瓶，裝入種子培養(yǎng)基lOOmL，140rpm，30°C培養(yǎng)24h后，可形成小菌球。4.三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)以20%的接種量接種小菌球種子，50mL/250mL的裝液量，以85g/L的玉米淀粉作為碳源，其他成分與上述發(fā)酵培養(yǎng)基相同，采用添加60g/L的碳酸鈣將發(fā)酵液的pH控制在 5-6。發(fā)酵溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為140rpm，發(fā)酵周期192小時(shí)。檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，其中富馬酸的積累可達(dá)32. 30g/L,富馬酸的產(chǎn)率達(dá)0. 359g/g。實(shí)施例2以裝液量50mL/250mL的三角瓶發(fā)酵為例，少根根霉R. arrhizus NRRL 15 直接發(fā)酵木薯粉生產(chǎn)富馬酸的工藝如下1.少根根霉孢子的制備將根霉劃線接種于YPD斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5-6天，待孢子完全覆蓋白色菌絲， 即得。2.少根根霉孢子懸浮液的制備用無(wú)菌水將所制備的根霉孢子洗脫下來(lái)，用濾紙(孔徑20 μ m)過(guò)濾菌絲，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子密度稀釋控制為約107/mL，即得孢子懸浮液。3.小菌球種子的制備采用250mL的三角瓶，裝入種子培養(yǎng)基lOOmL，140rpm，30°C培養(yǎng)24h后，可形成小菌球。4.三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)以20%的接種量接種小菌球種子，50mL/250mL的裝液量，以75g/L的木薯粉做為碳源，其他成分與上述發(fā)酵培養(yǎng)基相同，采用添加60g/L的碳酸鈣將發(fā)酵液的pH控制在 5-6。發(fā)酵溫度為30°C轉(zhuǎn)速為140rpm，發(fā)酵周期216小時(shí)。檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，其中富馬酸的積累可達(dá)13. 95g/L，富馬酸的產(chǎn)率達(dá)0. 233g/g。實(shí)施例3以裝液量50mL/250mL的三角瓶發(fā)酵為例，少根根霉(RH_07_13) CGMCC No 5188直接發(fā)酵木薯粉生產(chǎn)富馬酸的工藝如下1.少根根霉孢子的制備將根霉劃線接種于YPD斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5-6天，待孢子完全覆蓋白色菌絲， 即得。2.少根根霉孢子懸浮液的制備用無(wú)菌水將所制備的根霉孢子洗脫下來(lái)，用濾紙(孔徑20 μ m)過(guò)濾菌絲，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子密度稀釋控制為約107/mL，即得孢子懸浮液。3.小菌球種子的制備采用250mL的三角瓶，裝入種子培養(yǎng)基lOOmL，180rpm，30°C培養(yǎng)24h后，可形成小菌球。4.三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)以20%的接種量接種小菌球種子，50mL/250mL的裝液量，采用添加40g/L的碳酸鈣將發(fā)酵液的PH控制在5-6。以84. 14g/L的木薯粉作為碳源，其他成分與上述發(fā)酵培養(yǎng)基成分相同，發(fā)酵溫度為30°C轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵周期168小時(shí)。檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，其中富馬酸的積累可達(dá)34. 37g/L，富馬酸的產(chǎn)率達(dá)0. 408g/g。實(shí)施例4以裝液量25mL/250mL的三角瓶發(fā)酵為例，少根根霉(RH_07_13) CGMCC5188直接發(fā)酵木薯粉生產(chǎn)富馬酸的工藝如下1.少根根霉孢子的制備將根霉劃線接種于YPD斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5-6天，待孢子完全覆蓋白色菌絲， 即得。2.少根根霉孢子懸浮液的制備用無(wú)菌水將所制備的根霉孢子洗脫下來(lái)，用濾紙(孔徑20 μ m)過(guò)濾菌絲，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子密度控制為約107/mL，即得孢子懸浮液。3.小菌球種子的制備采用250mL的三角瓶，裝入種子培養(yǎng)基lOOmL，180rpm，30°C培養(yǎng)24h后，可形成小菌球。4.三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)以20%的接種量接種小菌球種子，25mL/250mL的裝液量，采用添加40g/L的碳酸鈣將發(fā)酵液的PH控制在5-6。以84. 14g/L的木薯粉做為碳源，其他成分與上述發(fā)酵培養(yǎng)基相同，發(fā)酵溫度為30°C轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵周期168小時(shí)。檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，其中富馬酸的積累可達(dá)49. 88g/L，富馬酸的產(chǎn)率達(dá)0. 593g/g。實(shí)施例5以裝液量1. 3L/2. 5L的氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵為例，少根根霉(RH-07_i;3) CGMCC No5188直接發(fā)酵木薯粉生產(chǎn)富馬酸的工藝如下1.少根根霉孢子的制備將根霉劃線接種于YPD斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5-6天，待孢子完全覆蓋白色菌絲， 即得。2.少根根霉孢子懸浮液的制備用無(wú)菌水將所制備的根霉孢子洗脫下來(lái)，用濾紙(孔徑20 μ m)過(guò)濾菌絲，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子密度稀釋為約107/mL，即得孢子懸浮液。3.小菌球種子的制備采用250mL的三角瓶，裝入種子培養(yǎng)基lOOmL，180rpm，30°C培養(yǎng)24h后，可形成小菌球。4.氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)以20%的接種量接種小菌球種子，1. 3L/2. 5L的裝液量，采用添加40g/L的碳酸鈣將發(fā)酵液的PH控制在5-6.以82g/L的木薯粉做為碳源，其他成分與上述發(fā)酵培養(yǎng)基相同， 發(fā)酵溫度為32°C。通氣量為l-2vvm，發(fā)酵周期150小時(shí)。檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，其中富馬酸的積累可達(dá)42. 32g/L，富馬酸的產(chǎn)率達(dá)0. 503g/g。實(shí)施例6以裝液量25mL/250mL的三角瓶發(fā)酵為例，，以菌株R. arrhizus NRRL 2582為例， 直接發(fā)酵木薯粉生產(chǎn)富馬酸的工藝如下1.少根根霉孢子的制備
將根霉劃線接種于YPD斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5-6天，待孢子完全覆蓋白色菌絲， 即得。2.少根根霉孢子懸浮液的制備用無(wú)菌水將所制備的根霉孢子洗脫下來(lái)，用濾紙(孔徑20 μ m)過(guò)濾菌絲，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子密度控制為約107/mL，即得孢子懸浮液。3.小菌球種子的制備采用250mL的三角瓶，裝入種子培養(yǎng)基lOOmL，180rpm，30°C培養(yǎng)24h后，可形成小菌球。4.三角瓶發(fā)酵培養(yǎng)以20%的接種量接種小菌球種子，25mL/250mL的裝液量，采用添加40g/L的碳酸鈣將發(fā)酵液的PH控制在5-6。以84. 14g/L的木薯粉做為碳源，其他成分與上述發(fā)酵培養(yǎng)基相同，發(fā)酵溫度為轉(zhuǎn)速為200rpm，發(fā)酵周期158小時(shí)。檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，其中富馬酸的積累可達(dá)35. 65g/L，富馬酸的產(chǎn)率達(dá)0. 424g/g。實(shí)施例7以裝液量1.3L/2.5L的氣升式發(fā)酵罐發(fā)酵為例，菌種為R. arrhizus NRRL 2582， 直接發(fā)酵木薯粉生產(chǎn)富馬酸的工藝如下1.少根根霉孢子的制備將根霉劃線接種于YPD斜面培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5-6天，待孢子完全覆蓋白色菌絲， 即得。2.少根根霉孢子懸浮液的制備
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用無(wú)菌水將所制備的根霉孢子洗脫下來(lái)，用濾紙(孔徑20 μ m)過(guò)濾菌絲，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子密度稀釋為約107/mL，即得孢子懸浮液。3.小菌球種子的制備采用250mL的三角瓶，裝入種子培養(yǎng)基lOOmL，180rpm，30°C培養(yǎng)24h后，可形成小菌球。4.氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)以10%的接種量接種小菌球種子，1. 3L/2. 5L的裝液量，采用添加40g/L的碳酸鈣將發(fā)酵液的PH控制在5-6.以84. 14g/L的木薯粉為碳源，其他成分與上述發(fā)酵培養(yǎng)基相同，發(fā)酵溫度為32°C。通氣量為l-2vvm，發(fā)酵周期160小時(shí)。檢測(cè)發(fā)酵產(chǎn)物，其中富馬酸的積累可達(dá)32. 21g/L，富馬酸的產(chǎn)率達(dá)0. 383g/g。
權(quán)利要求
1.一種根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，包括以下步驟培養(yǎng)制備的根霉小菌球轉(zhuǎn)接入氣升式發(fā)酵罐的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源為淀粉質(zhì)原料。
2.如權(quán)1所述根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，其特征在于所述碳源為木薯粉、紅薯粉、土豆粉、玉米粉或稻米粉。
3.如權(quán)2所述根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，其特征在于所述碳源在發(fā)酵培養(yǎng)基中的含量為70-85g/L。
4.如權(quán)1所述根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為淀粉質(zhì)原料 70-85g/L,尿素 0. 03-05g/L, KH2PO4O-L 55g/L，MgSO4 · 7H200-0.5g/L, ZnSO4 · 7H20 0-0. 025g/L, FeSO4O-O. 005g/L，碳酸鈣 0_40g/L，pH 在 5-6。
5.如權(quán)1所述根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，其特征在于所述根霉包括少根根霉和米根霉。
6.如權(quán)1所述根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)方法如下在氣升式發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，裝入發(fā)酵罐體積30-70%的發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量為1-20%，發(fā)酵的pH為5-6，發(fā)酵溫度定為^-32°C，通氣量為l-2vvm，發(fā)酵周期為150_168h。
7.如權(quán)1所述根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)過(guò)程添加發(fā)酵培養(yǎng)基體積0. 2%的大豆油。
8.如權(quán)1所述根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，其特征在于所述根霉小菌球培養(yǎng)制備方法如下(1)制備根霉孢子懸浮液；用無(wú)菌水將所斜面培養(yǎng)獲得的根霉孢子洗脫下來(lái)，用孔徑 20 μ m濾紙過(guò)濾菌絲，采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，將孢子稀釋為約107mL，即得孢子懸浮液；(2)接種培養(yǎng)制備小菌球?qū)㈡咦討腋∫航臃N到種子培養(yǎng)基中；接種量為1%，控制轉(zhuǎn)速180rpm，30°C培養(yǎng)24h后，形成小菌球。
9.一種用于直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的根霉菌，所述根霉為少根根霉 (Rhizopusarrhizus) RH-07-13，保藏編號(hào) CGMCC No 5188。
10.用于直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的少根根霉CGMCCNo 5188在發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料制備富馬酸的方法，包括以下步驟(1)制備根霉孢子；(2)將根霉孢子制備成根霉孢子懸浮液；(3)將孢子懸浮液接種于種子培養(yǎng)基中，培養(yǎng)形成小菌球；(4)將種子培養(yǎng)所得到的小菌球接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵。本發(fā)明方法利用實(shí)驗(yàn)室保存的根霉直接發(fā)酵淀粉質(zhì)原料，生產(chǎn)富馬酸，通過(guò)培養(yǎng)基優(yōu)化得到最優(yōu)的培養(yǎng)基組成。通過(guò)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的裝液量得到最高的富馬酸產(chǎn)量。并通過(guò)氣升式發(fā)酵罐培養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)了放大發(fā)酵。發(fā)酵產(chǎn)物富馬酸的最終濃度和產(chǎn)率較高。本發(fā)明方法除具有富馬酸產(chǎn)量高之外，還具有成本降低，工藝縮短，與環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/845GK102399828SQ20111027597
公開日2012年4月4日 申請(qǐng)日期2011年9月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月16日
發(fā)明者劉珞, 古春博, 王芳, 譚天偉, 鄧?yán)? 韓衛(wèi)強(qiáng) 申請(qǐng)人:北京化工大學(xué)