專利名稱：西風(fēng)小麥抗小麥黃花葉病毒主效qtl的分子標(biāo)記方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明公開了 ‘西風(fēng)小麥’抗小麥黃花葉病毒主效QTL QYm.nmi-5A. 1飽分子標(biāo)記方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。可為小麥抗黃花葉病毒育種提供新的基因資源；與QYm. nau~5A. 1緊密連鎖標(biāo)記的引物可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。背景技術(shù)：
普通小麥(Jriticum aestivum D有21對染色體，每對包含兩條一樣的染色體，這 21 條染色體分別為 1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、;3B、3D、4A、4B、4D、5A、5B、5D、6A、6B、6D、7A、7B、 7D，普通小麥通常用AABBDD表示(圖1)。每條染色體又包含長臂和短臂，分別用L和S表示，比如5A染色體包括長臂5AL和短臂5AS。幢(Jriticum aestivum L)作為世界性的重要糧食作物，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有舉足輕重的地位，但由真菌一禾谷多黏菌graminis)(見參考文獻(xiàn)=Inouye T (1969) Viral pathogen of the wheat yellow mosaic disease. Nogaku Kenkyu 53:61-68)介導(dǎo)的小麥黃花葉病毒(Wheat yellow mosaic bymovirus，WYMV)引起的小麥黃花葉病(Wheat yellow mosaic，WYM)對小麥的生長發(fā)育及產(chǎn)量造成了嚴(yán)重危害，正日益成為危害我國和日本等亞洲國家小麥生產(chǎn)的最嚴(yán)重的病害之一(見參考文獻(xiàn)1、陶家鳳，秦家忠，肖際亨，沈言章，趙福臻，李天眷，謝貽遠(yuǎn)，何代富，饒有后，黃顯華(1980)四川土傳小麥黃色花葉病的研究.植物病理學(xué)報(bào)10:5-25 ;2、于善謙，陳仲宜，徐來升，張若平，王鳴岐， 羅瑞梧(1986)發(fā)生在我國的小麥黃花葉病毒病.植物保護(hù)學(xué)報(bào)13:217-219 ;3、李大偉， 韓成貴，邢怡明，田兆豐，于嘉林，蔡祝南，劉儀(1997)中國小麥黃花葉病毒(WYMV)分布的 RT-PCR鑒定.植物病理學(xué)報(bào)27:303-307)。將抗性主效QTL/基因引入小麥栽培品種，培育和推廣抗病毒品種是目前生產(chǎn)上防治小麥黃花葉病最經(jīng)濟(jì)有效的方法。普通小麥品種‘西風(fēng)小麥’(公知公用，見參考文獻(xiàn)錢存鳴，周朝飛，姚國才， 姚金保，盛培英，楊學(xué)明(1999)小麥新品種寧麥9號的選育與應(yīng)用.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 3:19-20)具有抗倒伏、白粉病、赤霉病、條銹病、穗發(fā)芽等優(yōu)異性狀，抗病性狀突出，綜合性狀優(yōu)良。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所對‘西風(fēng)小麥’抗黃花葉病進(jìn)行了鑒定，結(jié)果表明‘西風(fēng)小麥’對小麥黃花葉病表現(xiàn)出高抗，‘鎮(zhèn)9523’表現(xiàn)高感。為了進(jìn)一步研究‘西風(fēng)小麥’對小麥黃花葉病的抗性遺傳機(jī)制和定位抗性QTL，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)細(xì)胞遺傳所以高抗小麥黃花葉病的‘西風(fēng)小麥’作母本、高感小麥抗黃花葉病的‘鎮(zhèn)9523’(審定品種)作父本、通過單籽傳法(Single-seed descent，SSD)構(gòu)建了 F6 重組自交系群體(Recombinant inbred line, RIL)，并開展了利用該RIL群體進(jìn)行抗性QTL定位以及與主效QTL緊密連鎖分子標(biāo)記的篩選工作，并開展了利用“RILV-6X鎮(zhèn)9523”次級F2分離群體進(jìn)一步評價(jià)抗病主效QTL QYm. nau~5A. 1的抗病效應(yīng)的研究，最后進(jìn)行了利用高抗小麥黃花葉病的‘西風(fēng)小麥’衍生品種驗(yàn)證與QYm. nau~5A.緊密連鎖分子標(biāo)記的有效性等研究。
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于公開來自普通小麥品種‘西風(fēng)小麥’的抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau~5A. 7，該QTL可為小麥抗病毒育種提供新的基因資源；同時(shí)，提供與QYm.nau~5A. 1緊密連鎖分子標(biāo)記CTMW^和CTMWM的引物和用法，可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。技術(shù)方案
1、本發(fā)明中的主效QTL QYm. nau~5A. 7來自抗小麥黃花葉病小麥品種‘西風(fēng)小麥’，々7 . nau~5A. 1對小麥黃花葉病的抗性穩(wěn)定，在四個(gè)環(huán)境中(2007在南京六合試驗(yàn)點(diǎn)；2008-2010 連續(xù)三年在江蘇揚(yáng)州試驗(yàn)點(diǎn))均可檢測到；貢獻(xiàn)率大，可解釋25. 9-53. 7%的表型變異。2、本發(fā)明中與抗小麥黃花葉病主效QTL /^^/-況.7緊密連鎖的兩個(gè)標(biāo)記的引物是分別以小麥EST (BE426712和BE497829)序列為模板設(shè)計(jì)而得到的(圖3)，其序列為，
標(biāo)記67似^//於的引物 CINAU152F CTTGGTTTCGGTGTGTGTAT CINAU152R :CCATTCTGATGGAAGCAATA ； 或標(biāo)記CINAUl53的引物 CINAU153F :GCAAAAATGTAATGCACCAT CINAU153R :GTTGCTATTGCCTTCAGTTG。其中，用標(biāo)記CINAU152的引物從含有QYm. nau~5A. 7的抗病植株中擴(kuò)增出約 IlOObp的特異條帶，或者用標(biāo)記CTMWM的引物從含有/^y-SA 1的抗病植株中擴(kuò)增出約900bp的特異條帶-MH CINAU 152琳CINAU 153與QYm. nau~5A. 1之間的遺傳距離分別為 0. 0 和 0. IcM0上述引物用于‘西風(fēng)小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau~5A. 1的分子標(biāo)記方法，包括
(1)以待鑒定材料的DNA作為模板，用CTMW於或CTMWM作為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； PCR 試劑組成為含 20-100ng DNA 的 1. Ομ DNA 模板，1. Ομ 10XPCR buffer, 0. 8μ
MgCl2,0. 8μ dNTP，左右引物各 0· 2μ ，0· 15μ Tag DNA polymerase, 5. 85 μ ddH20 ；
PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸1分10秒， 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘；10°C保存；
PCR產(chǎn)物檢測PCR產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比為39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測；
(2)兩對標(biāo)記引物鑒定QYm.nau~5A. 1的結(jié)果為
用標(biāo)記CTMiZA^的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出約IlOObp特異條帶的植株為含有 QYm. nau~5A. 1 的植株；
或者用標(biāo)記CV^WM的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出約900bp特異條帶的植株為含有 QYm. nau-5A. 1 的植株。有益效果
1、本發(fā)明中公開的來自‘西風(fēng)小麥’的抗小麥黃花葉病主效QTL 0rm.naU-5A」對病毒的抗性穩(wěn)定，在四個(gè)環(huán)境中(2007在南京六合試驗(yàn)點(diǎn)；2008-2010連續(xù)三年在江蘇揚(yáng)州試驗(yàn)點(diǎn))均可檢測到；貢獻(xiàn)率大，可解釋25. 9-53. 7%的表型變異。來自‘西風(fēng)小麥’的抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau~5A. 1在小麥抗病育種中具有較高的利用價(jià)值。2、本發(fā)明中公開的與‘西風(fēng)小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau_5A. 1緊密連鎖的兩對分子標(biāo)記的引物(CINAU152F/CINAU152R和CINAU153F/CINAU153R)是基于小麥 EST序列設(shè)計(jì)而成，用來鑒定植株中是否含有QYm. nau-5A. Λ簡單易行、方便快捷、擴(kuò)增穩(wěn)定。3、標(biāo)記引物 CINAU152F/CINAU152R 和 CINAU153F/CINAU153R 擴(kuò)增的產(chǎn)物與 QYtn. /^ -況.7之間的遺傳距離非常近，分別為0.0和0. lcM，所以用這兩對標(biāo)記引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用分子標(biāo)記輔助選擇1的準(zhǔn)確性高。四

圖1 普通小麥染色體示2 小麥抗黃花葉病單株抗性鑒定分級標(biāo)準(zhǔn)
圖 3 兩對標(biāo)記引物 CINAU152F/CINAU152R和 CINAU153F/CINAU153R所對應(yīng)的小麥 EST (BE426712和BE497829)序列及引物序列位置
圖4 ‘西風(fēng)小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau~5A. 7在5A染色體上的分布注左邊的數(shù)字代表疊加的遺傳距離(cM)，四個(gè)環(huán)境及其總平均值檢測到的QTL峰值的位置用不同的三角符號標(biāo)出。圖5 用“西風(fēng)小麥X鎮(zhèn)9523”RIL群體雙親和部分抗、感家系的DNA作為模板，分別用本發(fā)明中的兩對標(biāo)記引物CINAU152F/CINAU152R(a)和CINAU153F/CINAU153R(b)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明標(biāo)記引物CINAU152F/CINAU152R在抗病親本‘西風(fēng)小麥’(泳道1)和抗病家系(泳道3、4、7、8、10、14、17、18、20和21)中均擴(kuò)增出約1100 bp的特異條帶，標(biāo)記引物CINAU153F/CINAU153R均擴(kuò)增出約900 bp的特異條帶；而這兩對標(biāo)記引物在感病的親本和家系中均未擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶。箭頭所示為特異條帶。注M. Marker ； 1.西風(fēng)小麥；2.鎮(zhèn)9523 ;3_24.部分抗、感家系；R.純合抗??； S.純合感病
圖6 用“RILV-6X鎮(zhèn)9523”次級F2分離群體雙親和抗、感池及部分抗、感單株的DNA作為模板，分別用本發(fā)明中的標(biāo)記引物CINAU152F/CINAU152R (a)和CINAU153F/CINAU153R (b)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明標(biāo)記引物CINAU152F/CINAU152R在抗病親本‘RILV-6，(泳道 1)、抗池(泳道3)、純合抗病單株(泳道6、11和12)、雜合抗病單株(泳道7、9-10、13-14、16、 19-22和中均擴(kuò)增出約1100 bp的特異條帶，標(biāo)記引物CINAU153F/CINAU153R均擴(kuò)增出約900 bp的特異條帶；而這兩對標(biāo)記引物在感病的親本和單株中均未擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶。箭頭所示為特異條帶。注M.Marker ； 1. RIL5-6 ；2.鎮(zhèn) 9523 ;3.抗池；4.感池；5-24.部分抗、感單株；R.純合抗?。籋.雜合抗?。籗.純合感病。圖7 用抗小麥黃花葉病‘西風(fēng)小麥’的衍生品種和感小麥黃花葉病品種的 DNA作為模板，分別用本發(fā)明中的標(biāo)記引物CINAU152F/CINAU152R (a) 和CINAU153F/ CINAU153R(b)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明標(biāo)記引物CINAU152F/CINAU152R在‘西風(fēng)小麥， (泳道1)及其衍生的抗病品種(泳道2-4)中均擴(kuò)增出約1100 bp的特異條帶，標(biāo)記引物 CINAU153F/CINAU153R均擴(kuò)增出約900 bp的特異條帶；而這兩對標(biāo)記引物在感病品種(泳道5-16)中均未擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶。箭頭所示為特異條帶。注M. Marker ； 1. ‘西風(fēng)小麥’；2_4.高抗小麥黃花葉病的‘西風(fēng)小麥’衍生品種 ‘寧麥9號’、‘寧麥16號’和‘揚(yáng)麥18號’ ；5-16.高感小麥黃花葉病品種‘鎮(zhèn)9523’、‘皖麥36，、‘鄭麥9094，、‘周麥18，、‘陜麥139，、‘螞蚱麥，、‘揚(yáng)麥10，、‘濟(jì)南5號，、‘北京11，、‘有芒紅18號’、‘觀0089’和‘臨農(nóng)11’ ；R.純合抗??；S.純合感病。五具體實(shí)施例方式
1、‘西風(fēng)小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL的發(fā)掘
小麥抗黃花葉病的抗性鑒定標(biāo)準(zhǔn)分為0-5級(圖2)(參考文獻(xiàn)劉偉華，何震天，耿波，侯明生，張敏，聶桓等(2004)小麥對黃花葉病的抗性鑒定及典型品種的遺傳分析.植物病理學(xué)報(bào)34342447) :0級為植株無癥狀；1級為植株矮縮不明顯，輕度花葉， 一般不產(chǎn)生明顯的條紋壞死斑，葉片不黃化或少數(shù)黃化；2級為植株矮縮不明顯，輕度花葉，產(chǎn)生明顯的條紋壞死斑，葉片黃化明顯；3級為植株輕度矮縮，花葉明顯，條紋壞死斑占葉面積1/2左右，部分葉片黃化，少數(shù)枯死，分蘗黃化矮縮；4級為植株明顯矮縮，嚴(yán)重花葉， 條紋斑占葉面積3/4左右，心葉細(xì)弱扭曲或呈縮頂狀，部分葉片和分蘗枯死；5級為植株嚴(yán)重矮縮，大部分葉片和分蘗或整株枯死?！黠L(fēng)小麥’對小麥黃花葉病表現(xiàn)高抗，抗性水平為0級；‘鎮(zhèn)9523’則表現(xiàn)高感，抗級水平為5級。在四個(gè)環(huán)境中(2007在南京六合試驗(yàn)點(diǎn)； 2008-2010連續(xù)三年在江蘇揚(yáng)州試驗(yàn)點(diǎn))對“西風(fēng)小麥X鎮(zhèn)9523”的RIL群體(重組自交系群體)進(jìn)行了小麥黃花葉病抗性鑒定，結(jié)合構(gòu)建的分子標(biāo)記連鎖圖譜來定位‘西風(fēng)小麥’中抗小麥黃花葉病的QTL，其中位于‘西風(fēng)小麥’ 5AL染色體上的主效QTL QYm. nau~5A. 1在四個(gè)環(huán)境中均被檢測到，可解釋25. 9-53. 7%的表型變異(圖4)。新檢測到的QYm. nau~5A. 1是以往研究不曾報(bào)道過的，可作為小麥抗黃花葉病育種新的基因資源來加以利用。2、與QYm. nau~5A. 1緊密連鎖分子標(biāo)記引物的設(shè)計(jì)
在上述分子標(biāo)記連鎖圖譜構(gòu)建和抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau~5A. 1發(fā)掘的研究中，兩對分子標(biāo)記CINAU 152和CINAU 153與QYm. nau~5A. 1緊密連鎖(圖4)，并且與其LOD峰值(52. IcM)的遺傳距離分別為0. 0和0. 4cM0這兩對標(biāo)記的引物是根據(jù)小麥第五同源群上的兩個(gè)EST序列(BE426712和BE497^9)(公知公用，見參考文獻(xiàn)Qi LL, Echalier B, Chao S, Lazo GR, Butler GE, Anderson OD et al (2004) A chromosome bin map of 16, 000 expressed sequence tag loci and distribution of genes among the three genomes of polyploid wheat. Genetics 168:701-712)，采用在線引物設(shè)計(jì)軟件 Primer3 V0. 4. 0 設(shè)計(jì)而成(http://frodo. wi. mit. edu/primer3/)。標(biāo)記CINAUl52 的引物為 CINAU152F CTTGGTTTCGGTGTGTGTAT 和 CINAU152R CCATTCTGATGGAAGCAATA ；(圖 3)
標(biāo)記 CINAU153 的引物為 CINAU153F GCAAAAATGTAATGCACCAT 禾Π CINAU153R GTTGCTATTGCCTTCAGTTG)。(圖 3)
3、標(biāo)記引物 CINAU152F/CINAU152R 和 CINAU153F/CINAU153R 在“西風(fēng)小麥 X 鎮(zhèn) 9523”RIL群體中的分子檢測
利用標(biāo)記引物CINAU152F/CINAU152R在RIL群體的164個(gè)家系及其雙親中進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測。結(jié)果表明在高抗親本‘西風(fēng)小麥’和83個(gè)家系中均擴(kuò)增出約IlOObp的特異條帶， 而在高感親本‘鎮(zhèn)9523’和剩下的81個(gè)家系中均未擴(kuò)增出該特異條帶(圖fe)。利用標(biāo)記引物CINAU153F/CINAU153R在RIL群體的164個(gè)家系及其雙親中進(jìn)行 PCR擴(kuò)增檢測。結(jié)果表明在高抗親本‘西風(fēng)小麥’和84個(gè)家系中均擴(kuò)增出約900bp的特異條帶，而在高感親本‘鎮(zhèn)9523’和剩下的80個(gè)家系中未擴(kuò)增出該特異條帶(圖恥)。
PCR 試劑組成為含 20_100ng DNA 的 1. Ομ DNA 模板，1. OPLIOXPCR buffer, 0. 8pLMgCl2，0. 8μ χΙΝΤΡ，左右引物各 0· 2μ ，0· 15μ Taq DNA polymerase, 5. 85μ dd H20。PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸1分10 秒，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘；10°C保存，PCR產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比為 39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法進(jìn)行染色。4、標(biāo)記引物 CINAU152F/CINAU152R 和 CINAU153F/CINAU153R 在 F2 分離群體中的分子檢測
為了進(jìn)一步評價(jià)1的抗病效應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)室又根據(jù)檢測到的3個(gè)QTL置信區(qū)間內(nèi)的分子標(biāo)記在RIL群體及雙親中的擴(kuò)增結(jié)果，并結(jié)合各家系在四個(gè)環(huán)境中的抗性鑒定結(jié)果，共鑒定出12個(gè)僅含有主效QTL QYm. nau~5A. 1而不含其它微效QTL、黃花葉病抗性水平為0級的高抗家系，任擇其中一個(gè)高抗家系‘RILV-6，，構(gòu)建了 “RILV-6 X鎮(zhèn)9523”次級 F2分離群體(280個(gè)單株)。遺傳分析表明，nau~5A. 1在次級F2分離群體中呈顯性單基因遺傳。利用標(biāo)記引物(訊々肌52 /(訊4肌521 在F2群體雙親和抗、感池及群體單株中進(jìn)行 PCR擴(kuò)增檢測(條件和方法同上)。結(jié)果表明在280個(gè)F2單株中，60株純合抗病單株均擴(kuò)增出與高抗親本‘RILV-6’ 一致的特異條帶(約1100bp)，77株純合感病單株均擴(kuò)增出與高感親本‘鎮(zhèn)9523’ 一致的特異條帶(約850bp)，而143株雜合抗病單株能同時(shí)擴(kuò)增兩種特異條帶(圖6a)。利用標(biāo)記引物CINAU153F/CINAU153R在&群體的雙親和抗、感池及群體單株中進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(條件和方法同上)。結(jié)果表明在280個(gè)F2單株中，203株抗病單株均擴(kuò)增出與高抗親本‘RILV-6’ 一致的特異條帶(約900bp)，而77株感病單株均未擴(kuò)增出該特異條帶(圖6b)。根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果和連鎖分析，結(jié)果表明標(biāo)記CINAU152和CINAU153與QYm. nau-5A. 1之間的遺傳距離分別為0. 0和0. lcM。次級F2分離群體和RIL群體的結(jié)果互相驗(yàn)證，即QYm. nau~5A. 1既是‘西風(fēng)小麥’ 中抗小麥黃花葉病的主效QTL，又是高抗家系‘RILV-6’中抗小麥黃花葉病基因，并且標(biāo)記 CINAUl52 和 CINAU153 與 QYtn. nau~5A. 1 緊密連鎖。5、利用抗小麥黃花葉病‘西風(fēng)小麥’的衍生品種和感小麥黃花葉病品種驗(yàn)證標(biāo)記引物 CINAU152F/CINAU152R 和 CINAU153F/CINAU153R 的有效性
國內(nèi)育種工作者通過常規(guī)育種方法直接或間接利用‘西風(fēng)小麥’育成了一些廣泛推廣的高抗小麥黃花葉病的小麥品種，如‘寧麥9號’(公知公用，審定品種)、‘寧麥16號’(公知公用，審定品種)和‘揚(yáng)麥18號’等(公知公用，審定品種)。而‘鎮(zhèn)9523’(公知公用，審定品種)、‘皖麥36’(公知公用，審定品種)、‘鄭麥9094’ (公知公用，審定品種)、‘周麥18’(公知公用，審定品種)、‘陜麥139’(公知公用，審定品種)、‘螞蚱麥’(公知公用，審定品種)、‘揚(yáng)麥10’(公知公用，審定品種)、‘濟(jì)南5號’(公知公用，審定品種)、‘北京11’(公知公用，審定品種)、‘有芒紅18號’(公知公用，審定品種)、 ‘觀0089’(公知公用，審定品種)和‘臨農(nóng)11’(公知公用，審定品種)則為感小麥黃花葉病品種。為了檢測標(biāo)記CINAU152和CINAU153追蹤‘西風(fēng)小麥’衍生品種抗小麥黃花葉病 QTL QYm. nau~5A. 1的有效性，本研究利用抗小麥黃花葉病‘西風(fēng)小麥’的衍生品種和感小麥黃花葉病品種為測試材料，結(jié)果發(fā)現(xiàn)標(biāo)記CINAU152和CMAU153的引物在所有抗小麥黃花葉病‘西風(fēng)小麥’的衍生品種中分別擴(kuò)增出約IlOObp (圖7a)和900bp特異條帶(圖7b)，在感黃花葉病品種中未擴(kuò)增出相應(yīng)的特異條帶。該實(shí)驗(yàn)證明了標(biāo)記CINAU152和CINAU153 的引物可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種，特異性地追蹤‘西風(fēng)小麥’ 5AL染色體上的抗小麥黃花葉病 QTL QYm. nau~5A. 1。
權(quán)利要求
1.‘西風(fēng)小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTL QYm. nau~5A. 1的分子標(biāo)記引物，其序列為， 標(biāo)記67似^//於的引物CINAU152F CTTGGTTTCGGTGTGTGTAT CINAU152R :CCATTCTGATGGAAGCAATA ； 或標(biāo)記CINAUl53的引物 CINAU153F :GCAAAAATGTAATGCACCAT CINAU153R :GTTGCTATTGCCTTCAGTTG。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述‘西風(fēng)小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTLQYm. nau~5A. 1分子標(biāo)記引物，其特征在于，用標(biāo)記的引物從含有nau~5A. 1的抗病植株中擴(kuò)增出約 IlOObp的特異條帶，或者用標(biāo)記CTMWM的引物從含有/^y-SA 1的抗病植株中擴(kuò)增出約900bp的特異條帶-MH CINAU 152琳CINAU 153與QYm. nau~5A. 1之間的遺傳距離分別為0. 0和0. IcM, QTL QYm. nau~5A. 1對小麥黃花葉病的抗性穩(wěn)定，解釋25. 9-53. 7%的表型變異。
3.權(quán)利要求1或2所述引物用于‘西風(fēng)小麥’中抗小麥黃花葉病主效QTLQYm. nau~5A. 1 的分子標(biāo)記方法，包括(1)以待鑒定材料的DNA作為模板，用CINAU152或CINAU153的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； PCR 試劑組成為含 20-100ngDNA 的 μ DNA 模板，1. Ομ 10XPCR buffer,0. 8μ MgCl2,0. 8μ dNTP，左右引物各 0· 2μ ，0· 15μ Tag DNA polymerase, 5. 85μ ddH20 ；PCR程序?yàn)?4°C預(yù)變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸1分10秒， 35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10分鐘；10°C保存；PCR產(chǎn)物檢測PCR產(chǎn)物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質(zhì)量比39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測；(2)兩對標(biāo)記引物鑒定QYm.nau~5A. 1的結(jié)果為用標(biāo)記CTMiZA^的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出約IlOObp特異條帶的植株為含有 QYm. nau~5A. 1 的植株；或者用標(biāo)記CV^WM的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，能擴(kuò)增出約900bp特異條帶的植株為含有 QYm. nau-5A. 1 的植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了‘西風(fēng)小麥’抗小麥黃花葉病毒主效QTLQYm.nau-5A.1的分子標(biāo)記方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。首先公開了‘西風(fēng)小麥’抗小麥黃花葉病毒主效QTLQYm.nau-5A.1，同時(shí)公開了與該QTL緊密連鎖的兩個(gè)分子標(biāo)記CINAU152和CINAU153。在含有QTLQYm.nau-5A.1的材料中，標(biāo)記引物CINAU152F/CINAU152R擴(kuò)增出約1100bp的產(chǎn)物與QYm.nau-5A.1緊密連鎖，遺傳距離為0.0cM，標(biāo)記引物CINAU153F/CINAU153R擴(kuò)增出約900bp的產(chǎn)物與QYm.nau-5A.1緊密連鎖，遺傳距離為0.1cM。本發(fā)明公開的QYm.nau-5A.1可為小麥抗黃花葉病毒育種提供新的基因資源；與QYm.nau-5A.1緊密連鎖標(biāo)記的引物，可用于分子標(biāo)記輔助選擇育種。
文檔編號C12N15/11GK102260669SQ201110194389
公開日2011年11月30日 申請日期2011年7月12日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月12日
發(fā)明者劉洋洋, 吳真真, 曹愛忠, 朱曉彪, 王海燕, 王秀娥, 王耀南, 聶明娟, 郭嬌, 陳佩度 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)