專利名稱：抗小麥黃花葉病毒的簇毛麥4vs染色體的特異分子標記的制作方法
抗小麥黃花葉病毒的簇毛麥4VS染色體的特異分子標記技術領域
本發(fā)明屬于生物技術領域，涉及抗小麥黃花葉病毒的簇毛麥4VS染色體的特異分子標記。
背景技術：
小麥黃花葉病(wheat yellow mosaic, WYMV)是由小麥黃花葉病毒(wheatyellow mosaic bymovirus)引起的一種土傳病毒病害,其傳播介體禾谷多黏菌(Polymyxagraminis)的休眠孢子囊在土壤干燥條件下可存活數年以上，通過農事操作、病土、病根殘體等傳播，或通過帶介體土壤混雜在種子里進行遠距離傳播。發(fā)生小麥黃花葉病的田塊，一般可減產20-30%，嚴重時可達70%，甚至絕收(劉偉華等，2004 ；Liu等，2005a, 2005b)。我國每年小麥黃花葉病發(fā)生面積多達1000萬畝以上，且呈現逐年擴展趨勢，發(fā)生流行的威脅正在逐步增加，對小麥生產造成了重大損失(陳劍平，2005 ;孫炳劍等，2011)。
選育和推廣抗病品種是控制小麥黃花葉病最經濟、有效的途徑。我國已育成了儀寧小麥、寧豐小麥、寧麥9號、寧麥13、揚福麥9311及揚福麥4號等高抗新品種,有效控制了該病害的蔓延(何震天等，2009)。但目前育種工作中主要利用小麥2D和5A染色體長臂上的主效抗黃花葉病位點(Nishio等，2010 ;Zhu等，2012)，小麥抗黃花葉病的遺傳基礎較為狹窄。因此，發(fā)掘和利用新的抗黃花葉病遺傳資源，定位和克隆抗病新基因是小麥抗黃花葉病遺傳改良工作中的一 個迫切需求。
栽培品種遺傳基礎日趨狹窄已成為小麥育種取得突破性進展的主要瓶頸(李振聲，2010)。小麥近緣種屬蘊藏豐富的抗生物和非生物脅迫以及高產、優(yōu)質因子等基因資源，通過遠緣雜交將近緣物種中的優(yōu)良基因導入普通小麥，是拓寬小麥遺傳基礎、推進小麥育種取得突破性進展的有效途徑(吉萬全等，2001 ;張增艷等，2004 ;王述民等，2011)。
簇毛麥(Haynaldia villosa，基因組VV)原產于地中海沿岸，是栽培小麥的二倍體近緣物種，兼抗白粉病、條銹病、全蝕病、眼斑病和黃花葉病等多種病害(Gradzielewska,2006)。南京農業(yè)大學細胞遺傳研究所自上世紀70年代起開始開展將簇毛麥優(yōu)異基因導入普通小麥的研究，利用遠緣雜交和染色體工程手段育成了小麥-簇毛麥1V-7V整套異附加系、涉及4V和6V染色體的異代換系和抗白粉病的T6VS 6AL易位系。為了進一步研究簇毛麥所攜的優(yōu)異基因，首先對簇毛麥、小麥-簇毛麥雙二倍體、小麥-簇毛麥4V 二體異附加系、4V (4D)異代換系、T4VS 4DL純合補償性易位系進行了多年多點的小麥黃花葉病抗性鑒定，并開展了簇毛麥4VS染色體特異分子標記的開發(fā)和篩選等研究。發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于針對現有技術的上述缺陷，提供抗小麥黃花葉病毒的簇毛麥4VS染色體的特異分子標記。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述抗小麥黃花葉病毒的簇毛麥4VS染色體的特異分子標記的應用。
本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現:
簇毛麥4VS染色體的特異性分子標記，選自標記CINAU66和標記CINAU295中的任意一種；標記 CINAU66 的引物序列為:CINAU66F:SEQ ID N0.1，CINAU66R:SEQ ID N0.2，用標記CINAU66的引物從含有簇毛麥4VS染色體的抗病植株中能擴增出約950bp的特異條帶；標記CINAU295 的引物序列為:CINAU295F:SEQ ID N0.3，CINAU295R:SEQ ID N0.4，用標記CINAU295的引物從含有簇毛麥4VS染色體的抗病植株中擴增出約380bp的特異條帶。
本發(fā)明所述的簇毛麥4VS染色體的特異性分子標記引物，選自CINAU66F/CINAU66R 或 CINAU295F/CINAU295R 中的任意一對，引物 CINAU66F 序列為:SEQ ID N0.1，弓丨物 CINAU66R 序列為:SEQ ID N0.2，引物 CINAU295F 序列為:SEQ ID N0.3，引物 CINAU295R序列為 SEQ ID N0.4。
本發(fā)明所述的分子標記在鑒定含簇毛麥4VS染色體小麥中的應用。
本發(fā)明所述的分子標記在分子標記輔助選擇育種中的應用。
本發(fā)明所述的分子標記引物在鑒定含簇毛麥4VS染色體小麥中的應用。
本發(fā)明所述的分子標記引物在分子標記輔助選擇育種中的應用。
利用本發(fā)明所述的分子標記引物標記抗小麥黃花葉病毒的簇毛麥4VS染色體的方法，包括以下步驟:
(I)以待鑒定材料的DNA作為模板，用權利要求2所述的分子標記CINAU66或CINAU295的引物進行PCR擴增；
PCR 擴增體系為:含 20-100ngDNA 的 I ii L DNA 模板，1.0 y LlO X PCR buffer,0.8 u L MgCl2,0.8 u L dNTP,左、右引物各 0.2 u L, 0.15 u L Taq DNA polymerase, 5.85 u LddH20 ；
PCR程序為:94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸I分10秒，35個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；10°C保存；
PCR產物檢測:PCR產物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質量比39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測；
(2)兩對標記引物鑒定簇毛麥4VS染色體的標準為:用標記CINAU66的引物進行PCR擴增，能擴增出約950bp特異條帶的植株為含有簇毛麥4VS染色體的植株；用標記CINAU295的引物進行PCR擴增 ，能擴增出約380bp特異條帶的植株為含有簇毛麥4VS染色體的植株。
本發(fā)明中的涉及簇毛麥4VS染色體的結構變異體對小麥黃花葉病的抗性穩(wěn)定，在四個環(huán)境中(2007在南京六合試驗點；2008-2010連續(xù)三年在江蘇揚州試驗點)均對小麥黃花葉病表現高抗。
本發(fā)明中能特異追蹤簇毛麥4VS染色體的兩個標記的引物是分別以小麥EST(BE500311和BE637507)序列為模板設計而得到的(圖4)。
有益效果:
1、本發(fā)明中公開的來自簇毛麥4VS染色體的結構變異體對小麥黃花葉病的抗性穩(wěn)定，在四個環(huán)境中(2007在南京六合試驗點；2008-2010連續(xù)三年在江蘇揚州試驗點)均對小麥黃花葉病表現高抗。來自簇毛麥4VS染色體的抗小麥黃花葉病基因在小麥抗病育種中具有較高的利用價值。
2、本發(fā)明中公開的能特異追蹤抗小麥黃花葉病的簇毛麥4VS染色體的兩對分子標記的引物(CINAU66F/CINAU66R和CINAU295F/CINAU295R)是基于小麥EST序列設計而成，用來鑒定植株中是否簇毛麥4VS染色體，簡單易行、方便快捷、擴增穩(wěn)定。
3、標記引物 CINAU66F/CINAU66R 和 CINAU295F/CINAU295R 擴增的產物與簇毛麥4VS染色體緊密相連，所以用這兩對標記引物進行PCR擴增，利用分子標記輔助選擇簇毛麥4VS染色體的準確性高。


圖1:小麥-簇毛麥T4VS *4DL純合補償性易位系。(a):小麥-簇毛麥T4VS *4DL純合易位系根尖有絲分裂染色體中期GISH圖，簇毛麥總基因組DNA用fluorescein-12-dUTP標記，呈現綠色信號；(b):小麥-簇毛麥T4VS 4DL純合易位系根尖有絲分裂染色體中期FISH圖，重復序列克隆pScll9.2用biotin-16-dUTP標記，呈現綠色信號，重復序列克隆pAsl用digoxigenin-11-dUTP標記，呈現紅色信號。
圖2:小麥抗黃花葉病單株抗性鑒定分級標準
圖3:小麥-簇毛麥雙二倍體(a)、小麥-簇毛麥4V (4D)異代換系(b)、T4VS -4DL純合補償性易位系(c)普通小麥鎮(zhèn)9523的小麥黃花葉病抗性鑒定結果
圖4:兩對標記引物 CINAU66F/CINAU66R 和 CINAU295F/CINAU295R 所對應的小麥EST (BE500311和BE637507)序列及引物序列位置
圖5:用簇毛麥、小麥-簇毛麥雙二倍體、小麥-簇毛麥1V-7V 二體異附加系、4V(4D)異代換系、T4VS 4DL純合補償性易位系和普通小麥中國春的DNA作為模板，分別用本發(fā)明中的兩對標記引物CINAU66F/CINAU66R (a)和CINAU295F/CINAU295R (b)進行PCR擴增，結果表明標記引物CINAU66F/CINAU66R在抗病材料簇毛麥、小麥-簇毛麥雙二倍體、小麥-簇毛麥4V 二體異附加系、4V (4D)異代換系、T4VS -4DL純合補償性易位系中均擴增出約950bp的特異條帶，標記引物CINAU295F/CINAU295R均擴增出約380bp的特異條帶；而這兩對標記引物在感病的對照普通小麥中國春中均未擴增出相應的特異條帶。箭頭所示為特異條帶。
注:
M =Marker ；1:簇毛麥；2:小麥-簇毛麥雙二倍體；3:硬粒小麥；4:中國春；5:T4VS 4DL純合補 償性易位系；6:T4VL 5DL純合易位系;7_13:小麥-簇毛麥1V-7V 二體異附加系.具體實施方式
1、簇毛麥4VS所攜抗小麥黃花葉病基因的發(fā)掘
小麥抗黃花葉病的抗性鑒定標準分為0-5級(圖2)(參考文獻:Zhu X B，WangH Y，Guo J, Wu Z Z, Cao A Z, Bie T D, Nie M J, You F M, Cheng Z B，Xiao J, Liu YY，Cheng S H，Chen P D，Wang X E.Mapping and validation of quantitative traitloci associated with wheat yellow mosaic bymovirus resistance in bread wheat.Theoretical and Applied Genetics，2012，124(I): 177-188.):0 級為植株無癥狀；I 級為植株矮縮不明顯，輕度花葉，一般不產生明顯的條紋壞死斑，葉片不黃化或少數黃化；2級為植株矮縮不明顯，輕度花葉，產生明顯的條紋壞死斑，葉片黃化明顯；3級為植株輕度矮縮，花葉明顯，條紋壞死斑占葉面積1/2左右，部分葉片黃化，少數枯死，分蘗黃化矮縮；4級為植株明顯矮縮，嚴重花葉，條紋斑占葉面積3/4左右，心葉細弱扭曲或呈縮頂狀，部分葉片和分蘗枯死；5級為植株嚴重矮縮，大部分葉片和分蘗或整株枯死?？共φ铡黠L小麥’對小麥黃花葉病表現高抗，抗性水平為O級；感病對照‘鎮(zhèn)9523’則表現高感，抗級水平為5級。在四個環(huán)境中(2007在南京六合試驗點；2008-2010連續(xù)三年在江蘇揚州試驗點)對小麥-簇毛麥雙二倍體、小麥-簇毛麥4V (4D)異代換系、T4VS 4DL純合補償性易位系和普通小麥鎮(zhèn)9523進行了小麥黃花葉病抗性鑒定，結果發(fā)現凡是含有簇毛麥4VS染色體的材料都對小麥黃花葉病表現高抗(圖3)。簇毛麥4VS染色體所攜抗小麥黃花葉病基因是以往研究不曾報道過的，可作為小麥抗黃花葉病育種新的基因資源來加以利用。
2、特異追蹤簇毛麥4VS染色體的分子標記引物的設計
在開發(fā)和篩選抗小麥黃花葉病的簇毛麥4VS染色體的特異分子標記研究中，兩對分子標記CINAU66和CINAU295能特異追蹤簇毛麥4VS染色體(圖5)。這兩對標記的引物是根據小麥第四部分同源群上的兩個EST序列(BE500311和BE637507)(見參考文獻Qi LL, Echalier B，Chao S，Lazo GR, Butler GE, Anderson OD et al (2004)A chromosomebin map of16, OOOexpressed sequence tag loci and distribution of genes amongthe three genomes of polyploid wheat.Geneticsl68:701-712)，米用在線引物設計軟件Primer3V0.4.0 設計而成(http://frod0.w1.mit.edu/primer3/)。
標記CINAU66 的引物為 CINAU66F:GCTGAAACAAGAGATTGGCTTA (SEQ ID N0.1)和CINAU66R:GCCTTATGCCGCGTAATAGAT (SEQ ID N0.2);(圖 4)
標記CINAU295 的引物為 CINAU295F:GGATGATCTGATTGCACTTT (SEQ ID N0.3)和CINAU295R:GCATCTTTAACCTGTTGCTT (SEQ ID N0.4)。(圖 4)
3.標記引物 CINAU66F/CINAU66R 和 CINAU295F/CINAU295R 在涉及簇毛麥 4VS 染色體材料中的分子檢測
利用標記引物CINAU66F/CINAU66R在涉及簇毛麥4VS染色體結構變異體中進行PCR擴增檢測。結果表明:在高抗親本簇毛麥、小麥-簇毛麥雙二倍體、小麥-簇毛麥4V 二體異附加系、T4VS 4DL純合補償性易位系中均擴增出約950bp的特異條帶，而在不含有簇毛麥4VS染色體的高感材料中均 未擴增出該特異條帶(圖5a)。
利用標記引物CINAU295F/CINAU295R在涉及簇毛麥4VS染色體結構變異體中進行PCR擴增檢測。結果表明:在高抗親本簇毛麥、小麥-簇毛麥雙二倍體、小麥-簇毛麥4V 二體異附加系、T4VS 4DL純合補償性易位系中均擴增出約380bp的特異條帶，而在不含有簇毛麥4VS染色體的高感材料中均未擴增出該特異條帶(圖5b)。
PCR 試劑組成為:含 20-1OOng DNA 的 1.0 y L DNA 模板，1.0u L10XPCR buffer,0.LMgCl2，0.LdNTP，左右引物各 0.L，0.15ii L Taq DNA polymerase, 5.85 u L ddH2O。
PCR程序為:94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸I分10秒，35個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；10°C保存，PCR產物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質量比為39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法進行染色。
權利要求
1.簇毛麥4VS染色體的特異性分子標記，其特征在于選自標記CINAU66和標記CINAU295中的任意一種； 標記 CINAU66 的引物序列為:CINAU66F:SEQ ID N0.1，CINAU66R:SEQ ID N0.2，用標記CINAU66的引物從含有簇毛麥4VS染色體的抗病植株中能擴增出約950bp的特異條帶； 標記 CINAU295 的引物序列為:CINAU295F:SEQ ID N0.3，CINAU295R:SEQ ID N0.4，用標記CINAU295的引物從含有簇毛麥4VS染色體的抗病植株中擴增出約380bp的特異條帶。
2.權利要求1所述的簇毛麥4VS染色體的特異性分子標記引物，其特征在于選自CINAU66F/CINAU66R 或 CINAU295F/CINAU295R 中的任意一對，引物 CINAU66F 序列為:SEQID N0.1，引物 CINAU66R 序列為:SEQ ID N0.2，引物 CINAU295F 序列為:SEQ ID N0.3，引物CINAU295R 序列為 SEQ ID N0.4。
3.權利要求1所述的分子標記在鑒定含簇毛麥4VS染色體小麥中的應用。
4.權利要求1所述的分子標記在分子標記輔助選擇育種中的應用。
5.權利要求2所述的分子標記引物在鑒定含簇毛麥4VS染色體小麥中的應用。
6.權利要求2所述的分子標記引物在分子標記輔助選擇育種中的應用。
7.利用權利要求2所述的分子標記引物標記抗小麥黃花葉病毒的簇毛麥4VS染色體的方法，包括以下步驟: (1)以待鑒定材料的DNA作為模板，用權利要求2所述的分子標記CINAU66或CINAU295的引物進行PCR擴增； PCR 擴增體系為:含 20-100ngDNA 的 IiiL DNA 模板，1.0 y LlOXPCR buffer，0.8 y LMgCl2,0.8u L dNTP，左、右引物各 0.L，0.15ii L Taq DNA polymerase, 5.85 u L ddH20 ； PCR程序為:94°C預變性3分鐘；94°C變性30秒，55°C退火50秒，72°C延伸I分10秒，35個循環(huán)；72°C延伸10分鐘；10°C保存； PCR產物檢測:PCR產物在丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺質量比39:1的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，再用銀染法檢測； (2)兩對標記引物鑒定簇毛麥4VS染色體的標準為:用標記CINAU66的引物進行PCR擴增，能擴增出約950bp特異條帶的植株為含有簇毛麥4VS染色體的植株；用標記CINAU295的引物進行PCR擴增，能擴 增出約380bp特異條帶的植株為含有簇毛麥4VS染色體的植株。
全文摘要
本發(fā)明公開了抗小麥黃花葉病毒的簇毛麥4VS染色體的特異分子標記，屬于生物技術領域。首先公開了能追蹤簇毛麥4VS染色體的兩個分子標記CINAU66和CINAU295。在含有簇毛麥4VS染色體的材料中，標記引物CINAU66F/CINAU66R能擴增出約950bp的產物，標記引物CINAU295F/CINAU295R能擴增出約380bp的產物，這些引物能特異追蹤簇毛麥4VS染色體。本發(fā)明公開的抗小麥黃花葉病毒的簇毛麥4VS染色體，可為小麥抗黃花葉病毒育種提供新的基因資源；能特異追蹤簇毛麥4VS染色體的特異分子標記，可用于分子標記輔助選擇育種。
文檔編號C12N15/11GK103233006SQ20131017252
公開日2013年8月7日 申請日期2013年5月10日 優(yōu)先權日2013年5月10日
發(fā)明者王海燕, 趙仁慧, 陳忠明, 肖進, 曹愛忠, 賈琪, 袁春霞, 王秀娥 申請人:南京農業(yè)大學