專利名稱：一種快速同步檢測(cè)小麥黃花葉病毒和中國(guó)小麥花葉病毒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
:本發(fā)明涉及一種快速同步檢測(cè)小麥黃花葉病毒和中國(guó)小麥花葉病毒的方法及其在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用，屬于農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
:小麥?zhǔn)侨澜缱钪饕募Z食作物之一，其中麥類病毒病是影響其生產(chǎn)的主要因子之一。迄今為止由禾谷多黏菌(Polymyxa graminis)傳播的小麥類病毒主要有真菌傳桿狀病毒屬(Furovirus)的中國(guó)小麥花葉病毒(Chinese wheat mosaicvirus,CWMV)、小麥土傳花葉病毒(Soil-bome wheat mosaic virus, SBWMV)、土傳禾谷類花葉病毒(Soil-bomecereal mosaic virus, SBCMV)和大麥黃花葉病毒屬(Bymovirus)的小麥黃花葉病毒(Wheatyellow mosaic virus, WYMV)和小麥梭條斑花葉病毒(Wheat spindle streak mosaicvirus，WSSMV)。其中SBWMV主要分布于美國(guó)、法國(guó)、意大利和日本，SBCMV分布于法國(guó)、英國(guó)和美國(guó)，WSSMV分布于加拿大、美國(guó)和法國(guó)等歐美國(guó)家，在中國(guó)小麥上發(fā)生的主要是WYMV和CWMV,其中WYMV在日本亦有分布。WYMV 基因組由 2 條單鏈 RNA (single-stranded RNAs, ssRNA)組成，分別是RNAl (7636 nt)和RNA2 (3659 nt)。WYMV在中國(guó)的冬小麥種植區(qū)如江蘇、河南、陜西、四川、湖北、安徽、浙江和山東等地廣泛分布，一般造成小麥產(chǎn)量損失20% -70%，甚至絕收。CWMV是近年來在中國(guó)新發(fā)現(xiàn)的一種小麥病毒，該病毒基因組為RNAl(7147nt)和RNA2 (3569nt)組成。該病毒早期被誤認(rèn)為是SBWMV，經(jīng)全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)CWMV和SBWMV的RNAl和RNA2核苷酸序列同源性分別為75%和63%，編碼蛋白氨基酸序列的同源性分別為84%和62%，兩者存在明顯差異。在中國(guó)目前主要分布于山東、江蘇，常與WYMV復(fù)合感染。目前對(duì)WYMV和CWMV主要采用血清學(xué)方法和分子生物學(xué)方法對(duì)兩種病毒單獨(dú)檢測(cè)，如型怡明用間接酶聯(lián)和直接DAS酶聯(lián)法檢測(cè)WYMV，張宗英利用RT-PCR、ELISA和Westernblotting等檢測(cè)河南駐馬店小麥樣上的WYMV，尚巧霞利用ELISA+RT-PCR方法對(duì)四川小麥中的WYMV進(jìn)行檢測(cè)，耿波用雙抗夾心方法檢測(cè)WYMV，劉曉軍初步建立CWMV的RT-LAMP檢測(cè)體系。為簡(jiǎn)化試驗(yàn)步驟，近年來在植物上利用多重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)多種病毒的方法發(fā)展較快，如岳紅妮成功從復(fù)合侵染的小麥材料中檢測(cè)大麥條紋花葉病毒(Barleystripe mosaicvirus, BSMV)、大麥黃矮病毒 PAV 株系(Barley yellow dwarf virus, BYDV-PAV)、WYMV 及小麥藍(lán)矮植原體(Wheat blue dwarf，WBD)，Mahua Deb建立一種多重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)大麥小麥黃矮病毒(Barley and Cereal ye I lowdwarf virus, B/CYDV) 5 個(gè)株系、WSSMV、SBWMV和小麥線條花葉病毒(Wheatstreak mosaic virus,WSMV)8種麥類病毒,而從復(fù)合侵染樣品中同時(shí)檢測(cè)WYMV和CWMV兩種病毒尚未有報(bào)道。WYMV和CWMV侵染小麥的癥狀主要為葉片黃化或花葉，植株矮化，進(jìn)一步發(fā)展直至枯萎死亡，均由禾谷多黏菌傳播，其生物學(xué)特性十分相似，難以從經(jīng)驗(yàn)觀察的角度有效區(qū)分，且CWMV常與WYMV復(fù)合侵染，增加了病害診斷的難度。為了能快速準(zhǔn)確診病害類型， 本研究試圖建立一種能從小麥病葉中同步檢測(cè)WYMV和CWMV的方法，以方便快捷診斷田間小麥的侵染狀況，為病害科學(xué)防治提供依據(jù)
發(fā)明內(nèi)容
:本發(fā)明提供了一種快速同步檢測(cè)小麥黃花葉病毒和中國(guó)小麥花葉病毒的方法。許多學(xué)者利用傳統(tǒng)生物學(xué)接種鑒定、分子生物學(xué)和血清學(xué)方法單獨(dú)檢測(cè)小麥黃花葉病毒(WYMV)和中國(guó)小麥花葉病毒(CWMV)，本發(fā)明是首次利用多重RT-RCR從復(fù)合侵染樣品中同時(shí)檢測(cè)WYMV和CWMV兩種病毒。本發(fā)明所提供的一種快速同步檢測(cè)小麥黃花葉病毒和中國(guó)小麥花葉病毒的方法，是通過以下方法獲得的:1)根據(jù)NCBI已報(bào)道的小麥黃花葉病毒和中國(guó)小麥花葉病毒核苷酸序列,通過軟件 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物；2) Trizol reagent 法提取植株總 RNA ;3)以CWWY-R2為引物，參照M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明反轉(zhuǎn)錄合成cDNA ； 4)優(yōu)化多重RT-PCR反應(yīng)體系(dNTP濃度、Taq DNA聚合酶濃度和Mg2+濃度)和反應(yīng)條件(退火溫度、循環(huán)次數(shù)和延伸時(shí)間)；5)在最佳反應(yīng)參數(shù)條件下，以江蘇省農(nóng)科院植保所病害室保存的WYMV和CWMV提純病毒為陽(yáng)性對(duì)照驗(yàn)證這一方法的準(zhǔn)確性。本發(fā)明提供的引物序列如下:
權(quán)利要求
1.一種快速同步檢測(cè)小麥黃花葉病毒和中國(guó)小麥花葉病毒的方法，其特征在于:利用簡(jiǎn)并引物,在優(yōu)化的多重RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng)中同時(shí)檢測(cè)這兩種病毒。
.2.1中所述的簡(jiǎn)并引物是指:
全文摘要
本發(fā)明公開了一種快速同步檢測(cè)小麥黃花葉病毒和中國(guó)小麥花葉病毒的方法，根據(jù)兩種病毒基因序列的異同點(diǎn)設(shè)計(jì)了三條引物反向引物CWWY-R2為5′-GGTTCCMGTTATCGTACT-3′。正向引物CW1-F25′-GGAAGGGATGCCATACAACT-3′，WY1-F25′-ACCCTACAAACAAACTCTGC-3′，植物總RNA為模板，以CWWY-R2為引物，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。然后通過優(yōu)化建立了一種同步檢測(cè)兩種病毒的反應(yīng)體系cDNA1.6μL、引物(10μmol/L)各0.4μL、10×PCR Buffer(不含Mg2+)2μL、dNTPs(10mmol/L each)0.4μL、Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.8μL、MgCl2(25mmol)0.8μL、ddH2O 13.2μL合計(jì)20μL；PCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min、94℃50s、50℃50s、72℃90s共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。PCR擴(kuò)增預(yù)期目的片段分別為WYMV 508bp、CWMV 918bp。利用該方法對(duì)江蘇高郵、揚(yáng)州和大豐的樣本進(jìn)行檢測(cè)，分別為WYMV、WYMV、CWMV單一侵染。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103103288SQ20131000043
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2013年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月5日
發(fā)明者繆倩, 季英華, 任春梅, 魏利輝, 周益軍, 程兆榜 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院